CN102743749B - 应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法，该方法包括步骤：在篮式生物反应器中加入DMEM培养基，接种人二倍体细胞培养，细胞接种密度0.5×106～2.0×106cells/ml；培养条件：搅拌转速90～150rpm，DO 55％，pH7.0～7.4，37±1℃；培养至第6～9天时进行病毒接种，接种MOI为0.02～0.08，30±1℃培养；病毒接种22～26小时后，用PBS洗换，注入含0.2～0.3w/v％人血白蛋白的DMEM病毒维持液维持培养至收获病毒液。利用本发明的技术制备以人二倍体细胞为基质的风疹减毒活疫苗，减少了交叉污染，制品质量均一，具有较高经济效益。
Description
技术领域
本发明是关于一种风疹减毒活疫苗的制备方法，具体是一种应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法。
背景技术
目前，人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的制备，主要是应用传统的转瓶工艺生产，相关工艺如下：人二倍体细胞复苏→细胞扩增→转瓶培养细胞→风疹病毒接种→洗换→病毒液收获→相关检定。例如，CN101396557A公开了一种麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的制备方法，其中采用10L瓶旋转培养单层原代鸡胚细胞，分别接种麻疹沪-191株纯化病毒和S79株腮腺炎病毒，用MRC-5株人二倍体细胞静止培养风疹BRD-II株病毒，三种病毒液分别检定合格后通过澄清过滤合并成单价病毒原液；将合格的麻疹、腮腺炎和风疹单价病毒原液按一定比例配制，加入冻干保护剂制成半成品，最后分装冻干制成麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗。在转瓶工艺中，因不同转瓶是一个独立的细胞培养单元，所以每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致瓶间差异较难控制。而且转瓶培养工艺存在操作劳动强度大、占地空间大、隐性污染引起高内毒素的隐患大、细胞生长环境(温度、pH值、溶氧等)不易控制、细胞生长密度低等缺点。
另有文献报道应用细胞工厂(cell factory)进行病毒性疫苗的制备(细胞工厂培养技术在大规模细胞培养中的应用《医药资讯》2011.5.4)。细胞工厂可以在有限的空间内最大限度的利用培养表面，从而节省了大量的厂房空间，并可节省贵重的培养液，特别适合于贴壁细胞的培养，使细胞的放大培养变得简单易行，节省空间。然而，细胞工厂也存在一定的局限性，不能对细胞生长环境，如pH值、温度、溶氧等进行实时的监控与调控。此外，细胞工厂为抛弃性产品，经济成本较高。
近年来，利用生物反应器培养细胞的技术日趋成熟。生物反应器操作简单，运行稳定可靠，自动化控制程度高、培养表面积大、易于规模化生产，并且生物反应器能够提供更加良好的细胞生长环境，利于病毒繁殖。例如，“篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗”(张晋、张月兰等，《中国生物制品学杂志》2008年12期)报道了应用篮式生物反应器培养Vero细胞制备乙型脑炎疫苗；“生物反应器规模化培养重组CHO-C28细胞表达HBsAg的研究”(张英、徐枫、张平、宋涛，《微生物学免疫学进展》2007年第01期)报道了生物反应器规模化培养重组CHO-C28细胞。CN1390604A公开了一种利用篮式生物反应器大规模连续生产病毒疫苗的方法，该方法是在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen PlusR生物反应器中，以聚酯切片Fibra-CelTMDisks为载体，培养细胞生产病毒，在细胞生长至一定密度时，接种所述病毒，使所述病毒感染细胞，然后使病毒在合适的条件下大量增殖，再经纯化后收获病毒。
人二倍体细胞(2BS细胞)的培养条件相对较难控制，目前，未发现应用篮式生物反应器培养人二倍体细胞制备风疹疫苗的技术报道。
发明内容
本发明的主要目的是，提供一种应用篮式反应器替代传统的转瓶工艺，生产高质量的人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法。发明人在研究过程中，发现人二倍体细胞对培养过程中培养基、pH值、温度、溶氧(DO)、病毒接种的MOI(感染复数)等都较敏感，通过反复摸索生物反应器培养人二倍体细胞的培养技术，本发明最终确定了有利的细胞培养条件和风疹病毒繁殖条件，成功地制备出了以人二倍体细胞为基质的风疹减毒活疫苗，该疫苗具有良好的稳定性。根据本发明所提供的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法，其工艺步骤主要包括：细胞接种、病毒接种、洗换、病毒液收获。具体地，本发明的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法包括步骤：
在篮式生物反应器中加入DMEM培养基作为生长液，接种人二倍体细胞进行培养，细胞接种密度为：0.5×106～2.0×106cells/ml；培养条件：搅拌转速90～150rpm，溶氧55％，pH7.0～7.4，温度37±1℃；
在人二倍体细胞培养至第6～9天时，进行风疹病毒的接种，病毒接种MOI为0.02～0.08，毒种病毒滴度5.0～5.5lgCCID50/ml，病毒培养温度30±1℃培养；
病毒接种22～26小时后，应用pH值为7.1～7.2的PBS进行洗换，洗换结束后注入含0.2w/v％～0.3w/v％人血白蛋白的DMEM病毒维持液维持培养，至收获病毒液。
更进一步地，本发明的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法还可包括：
以所收获的病毒液配制风疹单价减毒活疫苗，配制后冻干，得人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗制品。
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法中，培养人二倍体细胞时所用的生长液(DMEM培养基)为含8～10％新生牛血清的DMEM培养基，且该生长液中初始葡萄糖含量为4.0～5.0g/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法，其中，在人二倍体细胞培养过程中，可利用葡萄糖监测确定细胞是否长成单层。根据本发明的具体实施方案，在人二倍体细胞培养过程中，当接种细胞第40～60小时时，开启灌流生长液，并设定灌流量为2～6L/day，以维持人二倍体细胞生长体系中的葡萄糖含量在2.0～3.0g/L，优选维持在2.4～2.6g/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法中，控制病毒培养阶段体系pH值为7.3～7.5(通过7.5％NaHCO3以及4Gas即氧气、二氧化碳、氮气、压缩空气四气来调节与控制)，优选pH值为7.45，特别有利于病毒的繁殖。
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法中，是在接种病毒后第110～130小时采取连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒液的连续收获。或者，也可以是在接种病毒后第80～90小时采取半连续灌流病毒维持液的方式进行病毒的培养与收获。更具体地，可以控制病毒生长体系中葡萄糖含量大于等于2.0g/L，优选维持体系中葡萄糖含量在2.4～2.6g/L左右，病毒维持液的灌流量一般为2～6L/day。
本发明的应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗的方法中，未详细提及的步骤(例如，以所收获的病毒液配制风疹单价减毒活疫苗，配制后冻干等步骤)可以按照所属领域的常规操作进行(例如，根据北京天坛生物制品股份有限公司或其他公司或文献记载的现有转瓶培养收获液进行相同的配制制备疫苗制品)；未详细提及的反应器的操作方法及其他工艺参数可以参照反应器的说明书确定。本发明的关键在于确定了对以篮式生物反应器制备人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗所得病毒收获液有重要影响的因素条件：人二倍体细胞的生长液、人二倍体细胞的接种密度及培养条件(包括搅拌转速、溶氧、pH值及温度)；病毒接种时间、病毒接种MOI及培养温度；洗换液及洗换时间；洗换后病毒维持液的确定。通过控制这些因素条件在本发明的范围内，能够成功地制备出以人二倍体细胞为基质的风疹减毒活疫苗，所得病毒收获液在具有较高收获量的情况下具有较高的病毒滴度，且本发明的以人二倍体细胞为基质的风疹减毒活疫苗具有良好的稳定性。
在本发明的一具体实施方案中，本发明是应用NBS篮式生物反应器制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗，该制备方法中，所确定的生物反应器使用参数如下：
NBS篮式反应器7.5L(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO；INC.，反应器型号：CelliGen 310 Benchtop Bioreactor，也可以采用其他容量的反应器，例如14L的反应器，培养参数中只是片状载体改为400g，Gasflow改为0.2～0.3，溶氧和搅拌速度等其他参数不变)
细胞接种及培养：培养液：8～10％(体积比)新生牛血清DMEM(无菌配制DMEM培养液后，加入新生牛血清使培养液中新生牛血清最终含量达8～10％(体积ml/体积ml比，用7.5％NaHCO3调液体pH值至7.0～7.4，优选7.1～7.2)
pH：7.0～7.4
温度：37℃±1℃
接种密度为：0.5×106～2.0×106cells/ml
培养6～9天；
病毒接种：MOI：0.02～0.08；
洗换：病毒接种22～26小时后洗换
pH值为7.1～7.2的PBS洗三次
维持液：0.2～0.3w/v％人血白蛋白DMEM(配制好普通DMEM培养液后，加入人血白蛋白使培养液中人血白蛋白含量达0.2～0.3w/v％(重量g/体积ml比，用7.5％NaHCO3调液体pH值至7.3～7.5)
pH：7.3～7.5，最优选7.45
温度：30℃±1℃；
病毒液收获：根据葡萄糖监测值，确定收获次数及收获时间。
在本发明的一具体实施方案中，是按照以下方法制备本发明的人二倍体细胞(2BS细胞)风疹减毒活疫苗：
7.5L NBS篮式生物反应器中加入含8～10％新生牛血清的DMEM培养基作为生长液，且该细胞培养生长液的葡萄糖含量为4.0～5.0g/L；接种人二倍体细胞，细胞接种密度0.5～2.0×106cells/ml，细胞培养参数设定为Agit＝120rpm；Temp＝37℃；pH值＝7.1；DO＝55％；
当接种细胞40～60小时后，开始灌流生长液，使得细胞生长体系中的葡萄糖含量维持在2.0～3.0g/L，优选2.4～2.6g/L；可以每天检测细胞培养过程中的葡萄糖含量，并适当调整灌流量，使得细胞生长液中的葡萄糖含量维持在所述范围内；
当细胞培养至接种细胞第145～215小时优选第160-200小时，进行病毒接种，病毒接种MOI为0.02～0.08，毒种病毒滴度5.0～5.5lgCCID50/ml，30℃培养；
病毒接种22～26小时后，应用pH值为7.1～7.2的PBS进行洗换，洗换结束后注入含0.2w/v％人血白蛋白的DMEM病毒维持液继续培养；
在接种病毒110～130小时后采取连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒液的连续收获；或者，在接种病毒80～90小时后采取半连续灌流病毒维持液的方式进行病毒的培养与收获。
按照本发明的方法，所收获的病毒收获液，具有较高的病毒滴度，病毒滴度不低于6.0lgCCID50/ml(《中华人民共和国药典》2010年版三部规定单次病毒收获液病毒滴度不低于4.8lgCCID50/ml)。
该病毒收获液经适当稀释后配制风疹单价减毒活疫苗，配制后冻干，得疫苗制品。
另一方面，本发明还提供了按照本发明的方法制备得到的以人二倍体细胞(2BS细胞)为基质的风疹减毒活疫苗，该疫苗的各项指标符合药典规定，并具有良好的稳定性(《中华人民共和国药典》2010年版三部规定风疹热稳定性试验可以在37℃存放7天，病毒滴度应不低于3.5lgCCID50/ml，本发明的疫苗可在37℃存放21天，病毒滴度仍维持在4.38lgCCID50/ml以上)。
本发明技术方案带来的有益效果：本发明中，国内首次应用生物反应器进行人二倍体细胞(2BS细胞)的培养，并制备了以人二倍体细胞(2BS细胞)为基质的风疹减毒活疫苗。根据所制备的风疹减毒活疫苗，如果病毒滴度稀释至5.5lgCCID50/ml，一个NBS生物反应器工艺(7.5L)的产量可高达90～120万毫升，相当于150～200个15L转瓶的产出，从经济效益上减少了人力资源的浪费、水的消耗。从制品的GMP管理角度减少了交叉污染，制品的质量更均一。
附图说明
图1显示2BS培养过程中葡萄糖消耗量。从图中可以看出，在2BS细胞培养阶段，细胞接种144～200小时左右葡萄糖消耗量达到高峰，此时为病毒接种最佳时期。
图2显示本发明一具体实施例中201002风疹病毒各次收获液之间葡萄糖浓度、收获时间、收获量及病毒滴度的比较图表。葡萄糖浓度维持在2.0～3.0g/L，病毒收获时间在病毒培养2.5～3.5天，病毒单次收获液4L，病毒单次收获液病毒滴度在6.0lgCCID50/ml以上。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例1：小量试验及工艺参数的确定
本实施例中，应用篮式生物反应器制备风疹减毒活疫苗。
工艺流程：
人二倍体细胞(2BS细胞)的接种→细胞培养→风疹病毒接种→洗换→病毒培养→单次病毒液收获(病毒滴定、无菌检查、支原体检查)→单次病毒收获液的合并(病毒滴定、无菌检查、支原体检查)→原液配制(无菌检查)→冻干(鉴别试验、外观、水分、病毒滴定、热稳定性实验、牛血清白蛋白残留量、无菌检查、异常毒性检查)。
具体方法步骤：
1.人二倍体细胞(2BS)培养阶段
含10％新生牛血清的DMEM培养基(DMEM培养基提供商：SAFC Biosciences，按照使用说明书配制，加入新生牛血清使培养液中新生牛血清最终含量达10％)作为细胞生长液进行人二倍体细胞阶段的培养。具体操作为：将装有片状载体(200g)的预先灭菌后的NBS反应器(7.5L，提供商：NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO；INC.反应器型号：CelliGen 310 Benchtop Bioreactor.))中先注入1/5～1/4罐体体积的细胞生长液后，再将人二倍体细胞(北京天坛生物制品股份有限公司提供，也可商购获得)注入罐体中，细胞接种密度为：0.5～2.0×106cells/ml；然后用细胞生长液补充液位至液位最高刻度线并进行反应器各项参数的设定：Agit.：90～150rpm；DO：55％；Gasflow：0.1；pH：7.0～7.4；Temp：37℃±1℃。
由于生物反应器无法直接观察到细胞生长情况，在细胞培养过程中，利用葡萄糖监测确定细胞是否长成单层，当接种细胞后40～60小时，开启灌流生长液，并设定生长液灌流量为2～6L/day，以使得细胞生长液中的葡萄糖含量维持在2.5g/L左右。
下表及图1给出了本实施例在2BS培养阶段培养液中葡萄糖消耗量随培养时间的变化。
在细胞培养至第168小时左右时葡萄糖消耗达到高峰，此时进行病毒的接种。
2.风疹病毒的接种
在人二倍体细胞培养至168小时，进行病毒接种，病毒接种MOI为0.02～0.08。2BS细胞在一个225cm2细胞培养瓶中长成致密单层，细胞计数为1.0×107个/瓶，设定其MOI分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16分别接种病毒，每个浓度都收获3次，收获病毒液量均为150ml，MOI在0.02～0.08时病毒增值至最高并达到一个平台区，随后病毒滴度逐渐下降。因此，本发明最终确定病毒MOI值为0.02～0.08。
本发明中，7.5L生物反应器接种细胞个数为4.25×109个(种毒量为1920ml，北京天坛生物制品股份有限公司风疹病毒2010-31-02，毒力为：5.2lgCCID50/ml)，30℃培养。
3.洗换、病毒培养
病毒接种22～26小时后，应用pH值为7.1～7.2的0.013M的PBS(39.68gNa2HPO4.12H2O；3.95g NaH2PO4.2H2O；68g NaCl配制10L)进行洗换，共洗换三次。第三次洗换结束后罐体内注入含0.2w/v％人血白蛋白的DMEM病毒维持液(提供商：SAFC Biosciences，按照使用说明书配制)维持培养，至收获病毒液。培养过程中，通过7.5％NaHCO3以及氧气、二氧化碳、氮气、压缩空气四气来调节与控制病毒培养体系pH值为7.45。
以下列举了发明人在研究过程中风疹病毒培养阶段的各培养参数对培养结果的影响：
(1)不同pH值维持液对收获液病毒滴度的影响
维持液中相同人血白蛋白含量，不同pH值对收获液病毒滴度影响的数据参见下表。
(2)人血白蛋白浓度对收获液病毒滴度的影响
维持液调pH值至7.45，对比维持液中不同人血白蛋白含量对收获液病毒滴度的影响，结果参见下表。人血白蛋白含量0.1w/v％病毒滴度低于其他维持液，人血白蛋白含量0.2w/v％以上病毒滴度无明显变化，本发明中最优选维持液中人血白蛋白含量0.2w/v％。
不同人血白蛋白病毒滴度
| 人血白蛋白含量(％) | 病毒滴度(lgCCID50/ml) |
| 0.1 | 5.45 |
| 0.2 | 6.38 |
| 0.3 | 6.13 |
| 0.4 | 6.25 |
| 0.5 | 6.38 |
(3)病毒培养液对收获液病毒滴度的影响
分别使用含0.2％人血白蛋白的DMEM与含0.2％人血白蛋白的MEM(GIBCO公司)作为病毒维持液进行病毒培养，收获病毒液并通过病毒滴度检测考察不同病毒培养液对收获液病毒滴度的影响，结果记录于下表。
4.病毒液收获
由于从反应器中无法观测到细胞病变，而细胞病变法检测病毒滴度需要10天时间，本实施例中采用葡萄糖监测确定病毒液收获时间，病毒收获液各项指标参见下表。
病毒收获液各项指标
实施例2：
结合实施例1的小量试验，本实施例于2010.11.15～2011.2.25制备二批2BS细胞风疹病毒单一收获液。其中201001批病毒疫苗制备具体过程为：7.5L NBS篮式生物反应器中加入4.0×109个人二倍体细胞，细胞培养阶段反应器参数设定为Agit＝120rpm；Temp＝37℃；pH值＝7.1；DO＝55％。细胞生长液中葡萄糖含量为4.1g/L。当培养至第三天(接种细胞56小时)时，细胞培养液中葡萄糖含量降至2.00g/L左右，此时开启灌流。每天检测细胞培养过程中的葡萄糖含量，并调整灌流量，使得细胞生长液中的葡萄糖含量维持在2.5g/L左右。当细胞培养至第九天(接种细胞200小时)时，进行病毒接种，毒种滴度为5.0lgCCID50/ml，病毒接种量为2560ml。在接种病毒后120小时开启流加并进行病毒液的连续收获。具体收获液及病毒滴度见下表。
201001比病毒滴度及收获液量
| 收获次数 | 病毒滴度(lgCCID50/ml) | 收获病毒液量(ml) |
| 201001-1 | 7.13 | 3000 |
| 201001-2 | 7.13 | 4000 |
| 201001-3 | 7.25 | 2500 |
| 201001-4 | 6.75 | 2300 |
| 201001-5 | 6.75 | 3200 |
| 201001-6 | 6.63 | 3000 |
| 201001-7 | 6.63 | 3000 |
| 201001-8 | 7.38 | 3100 |
| 201001-9 | 6.38 | 2800 |
| 201001-10 | 6.5 | 3200 |
| 201001-11 | 6.63 | 3300 |
| 201001-12 | 7.0 | 3500 |
| 201001-13 | 6.75 | 3000 |
| 201001-14 | 6.38 | 3500 |
| 201001-15 | 6.5 | 3400 |
| 201001-16 | 6.38 | 3300 |
| 201001-17 | 6.01 | 3200 |
| 平均滴度 | 6.7 | 总量：53300 |
201002批病毒疫苗制备过程中的细胞培养阶段与201001批完全一样，只是在病毒接种后，采取了半连续灌流的方式进行病毒的培养与收获，灌流量设定为2L/day。分别在病毒培养第84小时、144小时、216小时、284小时、368小时、416小时进行病毒液的收获。具体收获液及病毒滴度见下表及图2。
201002批病毒滴度及收获液量
| 收获次数 | 病毒滴度(lgCCID50/ml) | 收获病毒液量(ml) |
| 201002-1 | 7.63 | 4000 |
| 201002-2 | 7.25 | 4100 |
| 201002-3 | 7.5 | 4100 |
| 201002-4 | 6.25 | 4200 |
| 201002-5 | 6.5 | 4000 |
| 201002-6 | 6.63 | 4000 |
| 平均滴度 | 6.96 | 总量24400 |
201001批2BS细胞风疹病毒单一收获液在制备过程中采用的是连续灌注的方式，病毒收液量很大，但病毒滴度与转瓶相比提高幅度不大。在制备201002批采用半连续灌注方式病毒收液量略减少，但病毒滴度与转瓶相比提高幅度加大。因此，本发明优选采用半连续灌注的培养方式进行培养，分别在病毒接种后第80～90小时、140～150小时、210～220小时、280～290小时、360～370小时、410～420小时进行病毒液的收获。本发明的各项检定实验是以201002批病毒收获液进行的。
利用风疹病毒201002批病毒收获液做适当稀释配制(稀释液含0.5％蔗糖、0.8％明胶)风疹单价减毒活疫苗，配制后冻干。按照2010版《中华人民共和国药典》三部要求对制品进行全面检定，结果均符合《药典》规定。
风疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)试验苗的配制方式如下：
20110225-01(200倍稀释配制2500支，0.5ml/支)
20110225-02(100倍稀释配制2500支，0.5ml/支)
20110225-03(50倍稀释配制2500支，0.5ml/支)
应用北京天坛生物制品股份有限公司现有的转瓶工艺生产的风疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)配制2500支，0.5ml/支，作为对照组20110225-04。
冻干制品热稳后做全面检定，全检结果如下：
冻干制品的全面检定
制品检定合格后，参照《中国生物制品规程》(2000年版)进行制品的热稳定性试验，病毒滴度测定结果记录于下表：
风疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)试验苗稳定性试验25±2℃
风疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)试验苗稳定性试验-20±5℃
风疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)试验苗稳定性试验37±5℃
Claims (6)
1.一种应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法，该方法包括步骤：
在篮式生物反应器中加入DMEM培养基作为生长液，接种人二倍体细胞2BS细胞进行培养，细胞接种密度为：0.5×106～2.0×106cells/ml；培养条件：搅拌转速90～150rpm，溶氧55%，pH7.0～7.4，温度37±1℃；当接种细胞40～60小时后，开启灌流生长液，并设定灌流量为2～6L/day，维持细胞生长体系中的葡萄糖含量在2.0～3.0g/L ；
在人二倍体细胞培养至第6～9天时，进行风疹病毒的接种，病毒接种MOI为0.02～0.08，毒种病毒滴度5.0～5.5lgCCID50/ml，病毒培养温度30±1℃；控制病毒培养阶段体系pH值为7.3～7.5；
病毒接种22～26小时后，应用pH值为7.1～7.2的PBS进行洗换，洗换结束后注入含0.2～0.3w/v%人血白蛋白的DMEM病毒维持液继续培养，至收获病毒液；
收获的病毒液经适当稀释后配制风疹单价减毒活疫苗，配制后冻干，即为人二倍体细胞风疹减毒活疫苗制品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人二倍体细胞培养阶段中的生长液为含8～10%新生牛血清的DMEM培养基，且该生长液中初始葡萄糖含量为4.0～5.0g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，是在接种病毒后第100～130小时采取连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒液的连续收获。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，是在接种病毒后第80～90小时采取半连续灌流病毒维持液的方式进行病毒的培养与收获。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，病毒维持液的灌流量为2～6L/day，维持病毒生长体系中的葡萄糖含量大于等于2.0g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，该方法包括步骤：
7.5L NBS篮式生物反应器中加入含8～10%新生牛血清的DMEM培养基作为生长液，且该细胞培养生长液的葡萄糖含量为4.0～5.0g/L；接种人二倍体细胞2BS细胞，细胞接种密度0.5×106～2.0×106cells/ml，细胞培养参数设定为Agit=90～150rpm；Temp=37℃±1℃；pH值=7.0～7.4；DO=55%；
当接种细胞第40～60小时后，开启灌流生长液，使得细胞生长体系中的葡萄糖含量维持在2.0～3.0g/L；
距接种细胞145～215小时间，进行病毒接种，MOI为0.02～0.08，毒种病毒滴度5.0～5.5lgCCID50/ml，30℃培养；
病毒接种22～26小时后，用pH值为7.1～7.2的PBS进行洗换，洗换结束后注入含0.2～0.3w/v%人血白蛋白的DMEM病毒维持液维持培养；
在接种病毒后第110～130小时后采取连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒液的连续收获；或者，在接种病毒后第80～90小时后采取半连续灌流病毒维持液的方式进行病毒的培养与收获。
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| 张晋等.篮式生物反应器制备Vero 细胞乙型脑炎灭活疫苗.《中国生物制品学杂志》.2008,第21卷(第12期),1085-1087. |
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