CN104312981A - 脊髓灰质炎灭活疫苗及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脊髓灰质炎灭活疫苗及其生产方法。所述的脊髓灰质炎灭活疫苗是应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产的，具体包括：在篮式生物反应器中加入M199培养基，接种Vero细胞培养，至长成致密单层后，用Earle's平衡盐溶液洗换；洗换结束后注入M199培养基液，接种脊髓灰质炎病毒，病毒接种MOI为0.01～0.3，继续培养，病毒培养温度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培养阶段体系pH值为7.4～7.6；接种后培养42～72小时收获病毒液。本发明通过选择合适的培养基并控制适宜的培养温度、pH值、接种比例、溶氧等条件，病毒滴度高、抗原含量高，批间差异高度可控，质量均一。
Description
技术领域
本发明是关于一种脊髓灰质炎灭活疫苗及其生产方法，具体是一种应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，以及利用该方法生产得到的脊髓灰质炎灭活疫苗。
背景技术
脊髓灰质炎(简称脊灰)是由脊髓灰质炎病毒感染所引起的、以肢体麻痹为主的急性肠道传染病。脊髓灰质炎的主要易感人群为儿童。目前仍然没有有效的治疗脊灰的方法，控制与消灭脊灰最重要的是有效的脊髓灰质炎疫苗。
国内外已应用的脊髓灰质炎疫苗有两种：口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(Oralpoliovirus vaccine，OPV)和灭活脊髓灰质炎疫苗(Inactivated poliovirus vaccine，IPV)。其中，IPV不会产生疫苗相关麻痹型脊灰(Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis,VAPP)及疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-Derived Poliovirus,VDPV)引起的脊髓灰质炎病毒循环iVDPV感染，且IPV可与其他疫苗联合使用；并且，由于OPV对于有免疫缺陷的儿童会引起一定比例的脊髓灰质炎，WHO建议在全球证实消灭脊灰后尽早停止OPV的使用。因此，对于IPV的研究迫在眉睫。
传统的灭活脊髓灰质炎疫苗是采用发酵罐或转瓶工艺生产，相关工艺可参见CN1647822A、CN1297314C等，采用传统工艺，每批次的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，较难控制，且存在劳动强度大、占地空间大、隐性污染引起高内毒素的隐患大、细胞生长环境(温度、pH值、溶氧等)不易控制、细胞生长密度低等缺点。
近年来，利用生物反应器培养细胞的技术日趋成熟。目前已有关于以Sabin减毒株作为生产用毒种、以Vero细胞的微载体生物反应器培养技术生产灭活疫苗的技术报道，但该现有技术生产的疫苗安全性尚存在争议。CN102406928A公开了一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其中采用多级微载体生物反应器扩增传代培养人二倍体细胞，每级生物反应器的细胞生长达到106个/ml以上浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1：10～1：20的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模，再接种脊髓灰质炎病毒、增殖培养、收获病毒培养液并进行纯化和灭活，但该技术生产的收获液病毒滴度较低，且并没有公开具体的培养条件。
目前并未有应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质高效生产高质量脊髓灰质炎灭活疫苗的技术报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质高效生产高质量脊髓灰质炎灭活疫苗的方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种应用篮式生物反应器生产Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方法。事实上，以Vero细胞为基质接种脊髓灰质炎病毒的培养条件相对较难控制。发明人经过反复摸索实验，最终确定了有利的细胞培养条件和脊髓灰质炎病毒繁殖条件，成功地制备出了以Vero细胞为基质的脊髓灰质炎灭活疫苗，该疫苗具有良好的稳定性。根据本发明所提供的应用篮式生物反应器制备Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，其工艺步骤主要包括：细胞接种、洗换、病毒接种、病毒液收获。具体地，本发明的应用篮式生物反应器生产Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方法包括步骤：
在篮式生物反应器中加入M199培养基作为细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换；
洗换结束后注入M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，病毒接种MOI为0.01～0.3，继续培养，病毒培养温度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培养阶段体系pH值为7.4～7.6；
病毒接种后培养42～72小时，收获病毒液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法还包括：
收获的病毒液经适当稀释后配制脊髓灰质炎灭活疫苗，配制后冻干，即为Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗制品。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，所述脊髓灰质炎病毒为I型、II型、或III型脊髓灰质炎病毒。具体而言，I型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养48-66小时，II型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养30-54小时，III脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养42-72小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，，控制篮式反应器搅拌桨转速为：接种细胞阶段搅拌桨转速为110～130rpm；培养细胞阶段转速为70～90rpm；接种病毒阶段转速为90～110rpm；培养病毒阶段转速为70～90rpm。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，采用篮式反应器控制系统的“4Gas”模式进行Vero细胞及病毒培养。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，所述Vero细胞培养阶段中的生长液为高糖M199培养基，其初始葡萄糖含量为5.0～6.0g/L；在Vero细胞培养过程中，当接种细胞40～60小时后，开启灌流生长液，并设定灌流量为2～6L/day，维持细胞生长体系中的葡萄糖含量在2.0～3.0g/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，Vero细胞接种密度为：0.5×106～3.0×106cells/ml；培养体系pH 7.4～7.6，温度37±1℃；培养6～8天至长成致密单层。
根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，是在接种病毒后第42-72小时采取连续或半连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒液的连续收获，所述病毒维持液为M199培养基；病毒维持液的灌流量为2～6L/day，维持病毒生长体系中的葡萄糖含量大于等于2.0g/L。
另一方面，本发明还提供了一种按照本发明所述的方法制备得到的Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗。
本发明的应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗的方法中，未详细提及的步骤(例如，以所收获的病毒液经纯化、灭活和/或冻干等制备疫苗制品的步骤)可以按照所属领域的常规操作进行(例如，根据北京天坛生物制品股份有限公司或其他公司或文献记载的现有转瓶培养收获液进行相同的配制制备疫苗制品)；未详细提及的反应器的操作方法及其他工艺参数可以参照反应器的说明书确定。本发明的关键在于确定了对以篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗所得病毒收获液有重要影响的因素条件：确定篮式反应器培养I、II、III型脊髓灰质炎病毒的培养基、pH值、培养温度；病毒接种时间、病毒接种MOI；溶氧条件；病毒收获时间等。通过控制这些因素条件在本发明的范围内，能够成功地制备出以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗，所得病毒收获液在具有较高收获量的情况下具有较高的病毒滴度。
整体而言，本发明技术方案带来的有益效果：采用篮式反应器成功培养脊髓灰质炎病毒，细胞接种密度大，病毒滴度高、抗原含量高，批间差异高度可控，质量均一。且本发明的以Vero细胞为基质的脊髓灰质炎灭活疫苗具有良好的稳定性。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
以下各实施例中所用原始材料均可商购获得，主要实验材料与主要检定方法如下：
一、主要实验材料
病毒株：脊髓灰质炎病毒I、II、III型，由北京天坛生物制品股份有限公司提供；
细胞：Vero细胞，由北京天坛生物制品股份有限公司提供；
199培养基：由北京天坛生物制品股份有限公司培养基室提供；
MEM培养基：购自宜兴赛尔生物科技有限公司；
DMEM培养基：购自SAFC公司。
二、主要检定方法
病毒滴度：采用微量滴定细胞病变法，karber法计算LogCCID50值。
有效抗原含量检测：ELISA双抗体夹心法。以脊髓灰质炎病毒的单克隆抗体包板，HRP标记的多克隆抗体作为酶标记物。
Vero细胞蛋白残留(HCP)含量检测：采用ELISA双抗体夹心法，应用市售Vero细胞HCP检测试剂盒进行检测。
以下各实施例中，采用篮式反应器控制系统的“4Gas”模式，根据培养工艺要求的pH值及溶氧范围，自动分配和调整空气、氧气、氮气、二氧化碳的通气量，维持反应器内培养液的pH值及溶氧，为细胞和病毒提供适宜的生长环境。
实施例一、不同培养液及pH值条件下篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒试验
1 不同培养基及每种培养基的不同pH值条件下培养脊髓灰质炎病毒试验
采用M199、DEME和MEM三种不同的培养基配制细胞生长液和病毒维持液，各培养基配制成4个pH值梯度，分别为pH7.2、pH7.4、pH7.6和pH7.8。接种Vero细胞进行培养，待细胞培养6～8天，长成致密单层后，采用Earle’s液洗涤三次，以相同的MOI(MOI＝0.01)分别接种I、II、III型脊髓灰质炎病毒进行培养，测定培养不同时间的病毒滴度和Vero细胞残余蛋白(HCP)含量。
1.1 不同培养基和pH值条件下I型脊髓灰质炎病毒的培养试验
I型脊髓灰质炎病毒在M199、DEME和MEM三种不同的培养基中培养时，以M199和DMEM的病毒滴度较高，均可达8.5lgCCID50/ml，其中又以M199的病毒高峰维持时间较长；并且不同pH值条件下的M199其病毒滴度的差别相对较小，病毒增殖情况更平稳，DMEM在不同pH值条件下其病毒滴度的波动较大，对pH值的要求较严格。虽然在DMEM培养时HCP含量较低，但病毒滴度这一主要指标低于M199。
结果见表1。
表1 不同培养基和pH值下I型脊髓灰质炎病毒培养试验
1.2 不同培养基和pH值条件下II型脊髓灰质炎病毒的培养试验
II型脊髓灰质炎病毒在M199、DEME和MEM三种不同的培养基中培养时，M199的病毒滴度最高且，其次为DMEM，其中MEM的病毒滴度最低，同时M199培养基中病毒高峰的维持时间也较长。从HCP水平上比较可以看出，M199的HCP含量明显低于其他两种培养基。
在M199培养基上，4个pH值梯度中，病毒滴度明显以pH7.4和pH7.6较高，均能达到7.5lgCCID50/ml以上；不同pH值的HCP水平没有明显的差异。
结果见表2。
表2 不同培养基和pH值下Ⅱ型脊髓灰质炎病毒培养试验
1.3 不同培养基和pH值条件下III型脊髓灰质炎病毒的培养试验
III型脊髓灰质炎病毒在M199、DEME和MEM三种不同的培养基中培养时，以M199和DMEM的病毒滴度较高，均可达8.5lgCCID50/ml，其中又以M199的病毒高峰维持时间较长；并且不同pH值条件下的M199其病毒滴度的差别相对较小，病毒增殖情况更平稳，其中以pH7.4和pH7.6的病毒滴度最高。HCP水平上，M199培养基明显低于DMEM培养基和MEM培养基。
结果见表3。
表3 不同培养基和pH值下Ⅲ型脊髓灰质炎病毒培养试验
2 高糖M199培养基篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒试验
配制高糖M199培养液(初始葡萄糖含量为5.5g/L)做为Vero细胞生长液和脊髓灰质炎病毒的维持液，pH值范围为7.4-7.6。采用14L篮式反应器对3个型别病毒进行培养，Vero细胞接种密度为：2.5×106cells/ml；培养温度37±1℃；在Vero细胞培养过程中，当接种细胞40～60小时后，开启灌流生长液，并设定灌流量为2～6L/day，维持细胞生长体系中的葡萄糖含量在2.0～3.0g/L；培养6～8天，长成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换；洗换结束后注入高糖M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，病毒接种MOI为0.01，继续培养，病毒培养温度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培养阶段体系pH值为7.4～7.6。其中，篮式反应器搅拌桨转速为：接种细胞阶段搅拌桨转速为110～130rpm；培养细胞阶段转速为70～90rpm；接种病毒阶段转速为90～110rpm；培养病毒阶段转速为70～90rpm。
结果见表4。
表4 篮式反应器以pH7.5培养脊髓灰质炎病毒的病毒滴度
实施例二、篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒不同培养温度及MOI的培养试验
1、一次性细胞方瓶初步筛选脊髓灰质炎病毒培养温度及MOI条件
首先在一次性细胞方瓶中进行静置培养试验。参照口服脊髓灰质炎病毒的培养温度(33±0.5℃)，选定33±0.5℃和31±0.5℃两个不同的温度进行脊髓灰质炎病毒的培养，每种培养温度条件下又分别选用了3个不同MOI即0.01、0.1和0.3，检测不同温度及不同MOI的病毒滴度以及HCP含量。
1.1 Ⅰ型脊髓灰质炎病毒不同培养温度及MOI的培养试验
33℃培养条件下，Ⅰ型脊髓灰质炎病毒的病毒滴度优于31℃，HCP水平基本无差别；选择的三个不同MOI培养条件下，培养60小时均能达到病毒繁殖高峰。
综合以上试验结果，初步确定Ⅰ型脊髓灰质炎病毒培养温度为33±0.5℃，接种MOI为0.01-0.3。结果见表5。
表5 Ⅰ型脊髓灰质炎病毒不同培养温度及不同MOI的病毒滴度和HCP结果比较
1.2 II型脊髓灰质炎病毒MOI及培养温度的选择试验
33℃培养Ⅱ型脊髓灰质炎病毒时其病毒滴度明显高于31℃培养的结果，HCP水平基本无差别。33℃培养时，三个不同的MOI中，0.01和0.1在培养60小时达到病毒繁殖高峰，MOI为0.3时培养48小时达到病毒繁殖高峰，病变较快；但HCP含量比较发现MOI为0.01、0.1、0.3无明显差别。
综合以上试验结果，初步确定Ⅱ型脊髓灰质炎病毒接种MOI为0.01-0.3。结果见表6。
表6 Ⅱ型脊髓灰质炎病毒不同培养温度及不同MOI的病毒滴度和HCP含量比较
1.3 III型脊髓灰质炎病毒MOI及培养温度的选择试验
33℃培养Ⅲ型脊髓灰质炎病毒，其病毒滴度明显高于31℃培养的结果，HCP水平基本无差别。33℃培养时，MOI为0.01和0.1时均在培养60小时达到病毒繁殖高峰，MOI 0.3时病毒繁殖高峰出现在48小时，病变较快，HCP浓度与MOI为0.01、0.1时无明显差别。
综合以上结果，初步确定Ⅲ型脊髓灰质炎病毒接种MOI为0.01-0.3。结果见表7。
表7 Ⅲ型脊髓灰质炎病毒不同培养温度不同MOI培养的病毒滴度和HCP结果
2.篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒的培养温度及MOI的确定
参照一次性细胞方瓶中脊髓灰质炎病毒培养温度的筛选结果，确定篮式反应器病毒培养温度为33±0.5℃。在此基础上选择0.001、0.01、0.1、0.3共4个不同的MOI进行再次筛选。
配制高糖M199培养液(初始葡萄糖含量为6.0g/L)做为Vero细胞生长液和脊髓灰质炎病毒的维持液，pH值范围为7.4-7.6。采用14L篮式反应器对3个型别病毒进行培养，Vero细胞接种密度为：2.0×106cells/ml；培养温度37±1℃；在Vero细胞培养过程中，当接种细胞48小时后，开启灌流生长液，并设定灌流量为2～6L/day，维持细胞生长体系中的葡萄糖含量在2.0～3.0g/L；培养6～8天，长成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换三次；洗换结束后注入高糖M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，继续培养。其中，各培养阶段溶氧40～80％，篮式反应器搅拌桨转速为：接种细胞阶段搅拌桨转速为110～130rpm；培养细胞阶段转速为70～90rpm；接种病毒阶段转速为90～110rpm；培养病毒阶段转速为70～90rpm。
结果见表8～表10。
表8 I型脊髓灰质炎病毒不同MOI的比较
表9 II型脊髓灰质炎病毒不同MOI的比较
表10 III型脊髓灰质炎病毒不同MOI的比较
表8、表9、表10的数据表明，3个型别的病毒在MOI为0.001时，病毒的增殖均不理想；而MOI为0.01、0.1、0.3时，病毒滴度较高，平台期维持时间较长。抗原含量的结果显示，不同MOI以0.001为最差，0.01-0.3MOI抗原浓度增殖情况基本呈现正态分布。
实施例三、篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒溶氧的确定
篮式反应器采用30％、50％和70％三个不同的溶氧(DO)设定值，其对应溶氧(DO)范围为20-40％，40-60％和60-80％。培养3个型别脊髓灰质炎病毒，比较不同溶氧饱和度下病毒滴度的变化，确定篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒的较适DO。其他培养条件参照实施例二。
试验结果显示，在DO为30％时，3个型别的病毒滴度均远远低于DO为50％和70％时的病毒滴度；3个型别的病毒在DO为50％与70％的病毒滴度并无明显差异，因此确定较适溶氧范围为40-80％。结果见表11～表13。
表11 I型脊髓灰质炎病毒不同溶氧下的病毒滴度
| 时间 | DO＝30％ | DO＝50％ | DO＝70％ |
| 0h | 3.92 | 4.50 | 4.17 |
| 6h | 4.00 | 4.58 | 4.42 |
| 12h | 4.50 | 5.21 | 4.79 |
| 18h | 5.21 | 6.12 | 5.71 |
| 24h | 5.79 | 6.62 | 6.25 |
| 30h | 6.17 | 6.88 | 6.50 |
| 36h | 6.54 | 7.63 | 7.29 |
| 42h | 7.25 | 8.92 | 8.21 |
| 48h | 6.75 | 9.25 | 8.54 |
| 54h | 6.38 | 9.71 | 8.75 |
| 60h | 5.83 | 9.38 | 8.46 |
| 66h | 5.37 | 8.75 | 7.79 |
| 72h | 5.09 | 8.25 | 7.41 |
表12 II型脊髓灰质炎病毒不同溶氧下的病毒滴度
| 时间 | DO＝30％ | DO＝50％ | DO＝70％ |
| 0h | 4.71 | 5.08 | 4.88 |
| 6h | 4.96 | 5.25 | 5.04 |
| 12h | 5.25 | 6.50 | 5.96 |
| 18h | 6.50 | 7.08 | 6.88 |
| 24h | 7.00 | 7.88 | 7.54 |
| 30h | 7.25 | 8.25 | 7.87 |
| 36h | 7.33 | 8.38 | 8.08 |
| 42h | 6.50 | 8.71 | 8.54 |
| 48h | 6.25 | 8.88 | 8.13 |
| 54h | 6.12 | 8.96 | 8.00 |
| 60h | 6.00 | 8.50 | 8.17 |
| 66h | 5.38 | 8.25 | 8.25 |
| 72h | 5.04 | 7.96 | 7.50 |
表13 III型脊髓灰质炎病毒不同溶氧下的病毒滴度
| 时间 | DO＝30％ | DO＝50％ | DO＝70％ |
| 0h | 4.12 | 4.88 | 4.50 |
| 6h | 4.38 | 5.08 | 4.88 |
| 12h | 5.00 | 5.75 | 5.50 |
| 18h | 5.25 | 6.46 | 6.17 |
| 24h | 5.88 | 7.25 | 6.96 |
| 30h | 6.25 | 7.50 | 7.25 |
| 36h | 6.88 | 8.54 | 8.17 |
| 42h | 7.50 | 8.96 | 8.75 |
| 48h | 7.12 | 9.87 | 9.50 |
| 54h | 6.79 | 10.25 | 9.67 |
| 60h | 6.21 | 9.501 | 9.25 |
| 66h | 5.87 | 9.00 | 8.75 |
| 72h | 5.17 | 7.71 | 7.04 |
实施例四、篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒病毒收获时间的选择
篮式反应器培养条件参照实施例二。接种病毒后，每6小时取样检测病毒滴度、D抗原浓度、HCP浓度。结果显示，I型脊髓灰质炎病毒培养36小时，病毒滴度达到7.5lgCCID50/ml以上，培养42小时病毒滴度达到8.5lgCCID50/ml以上，培养54小时病毒滴度达到高峰，培养66小时开始出现下降趋势；D抗原浓度从42小时明显上升，66小时开始出现下降趋势，高峰出现在48-60小时之间。Ⅱ型脊髓灰质炎病毒培养18小时病毒滴度即达到8.0lgCCID50/ml以上，培养42小时病毒滴度达到9.0lgCCID50/ml以上，从66小时开始出现下降趋势；D抗原浓度从18小时明显上升，54小时开始出现下降趋势，高峰出现在30-48小时之间。Ⅲ型脊髓灰质炎病毒培养42小时病毒滴度开始明显上升，42小时病毒滴度为8.5lgCCID50/ml以上，54小时高峰时病毒滴度达到10.0lgCCID50/ml以上，从66小时开始出现下降趋势；D抗原浓度从30小时明显上升，54小时为抗原浓度高峰，66小时开始出现下降趋势，高峰出现在36-60小时之间。各型HCP浓度变化趋势与病毒滴度和D抗原浓度的变化趋势一致。结果见表14、表15、表16。
表14 I型脊髓灰质炎病毒不同培养时间的病毒滴度、抗原含量和HCP含量
表15 II型脊髓灰质炎病毒不同培养时间的病毒滴度、抗原含量和HCP含量
表16 III型脊髓灰质炎病毒不同培养时间的病毒滴度、抗原含量和HCP含量
综合病毒滴度、D抗原浓度的结果，确定了I型脊髓灰质炎病毒的收获时间为48-66小时，II型脊髓灰质炎病毒的收获时间为30-54小时，III脊髓灰质炎病毒的收获时间为42-72小时。
具体收获病毒液时，也可在上述适宜的收获时间采取连续或半连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒液的连续收获，所述病毒维持液为高糖M199培养基；病毒维持液的灌流量为2～6L/day，维持病毒生长体系中的葡萄糖含量大于等于2.0g/L。所收获的病毒液的滴度可维持在相对稳定范围内。
由上述实验可以看出，本发明采用篮式反应器培养脊髓灰质炎病毒，细胞接种密度大，病毒滴度高、抗原含量高，批间差异高度可控，质量均一。
利用本发明实施例四中的病毒收获液做适当稀释配制脊髓灰质炎灭活疫苗，配制后，对制品进行全面检定，结果见表17。
表17 Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)2～8℃长期稳定性试验结果
从上表结果可以看出，本发明的病毒收获液做适当稀释配制脊髓灰质炎灭活疫苗，长期稳定性检测结果均符合规定。
Claims (10)
1.一种脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，该方法包括步骤：
在篮式生物反应器中加入M199培养基作为细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换；
洗换结束后注入M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，病毒接种MOI为0.01～0.3，继续培养，病毒培养温度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培养阶段体系pH值为7.4～7.6；
病毒接种后培养42～72小时，收获病毒液。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：
收获的病毒液经适当稀释后配制脊髓灰质炎灭活疫苗，配制后冻干，即为Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗制品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述脊髓灰质炎病毒为I型、II型、或III型脊髓灰质炎病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，I型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养48-66小时，II型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养30-54小时，III脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养42-72小时。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，控制篮式反应器搅拌桨转速为：
接种细胞阶段搅拌桨转速为110～130rpm；培养细胞阶段转速为70～90rpm；接种病毒阶段转速为90～110rpm；培养病毒阶段转速为70～90rpm。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，采用篮式反应器控制系统的“4Gas”模式进行Vero细胞及病毒培养。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述Vero细胞培养阶段中的生长液为高糖M199培养基，其初始葡萄糖含量为5.0～6.0g/L；在Vero细胞培养过程中，当接种细胞40～60小时后，开启灌流生长液，并设定灌流量为2～6L/day，维持细胞生长体系中的葡萄糖含量在2.0～3.0g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，Vero细胞接种密度为：0.5×106～3.0×106cells/ml；培养体系pH 7.4～7.6，温度37±1℃；培养6～8天至长成致密单层。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，是在接种病毒后第42-72小时采取连续或半连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒液的连续收获，所述病毒维持液为M199培养基；病毒维持液的灌流量为2～6L/day，维持病毒生长体系中的葡萄糖含量大于等于2.0g/L。
10.一种按照权利要求1～9任一项所述的方法制备得到的Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗。
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