CN115044529A - 一种大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，包括以下步骤：解冻复苏人二倍体细胞；扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液；人二倍体细胞接种至固定床式或篮式生物反应器，通过反应器中设置的若干片状载体，使人二倍体细胞贴壁在若干片状载体上，让人二倍体细胞在相同反应器及相同培养环境中完成增殖、扩繁后，获得规模化人二倍体细胞，又在规模化人二倍体细胞上进行规模化病毒接种、繁殖后，用来规模化生产抗病毒疫苗，满足疫情期所需疫苗数量，且无论是人二倍体细胞、还是抗病毒疫苗都具有较高的一致性，满足市场需求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用固定床式或篮式生物反应器大规模培养人二倍体细胞KMB17生产病毒疫苗的方法。特别是用人二倍体细胞MRC-5、2BS或KMB17，并借助固定床式或篮式生物反应器，以聚氨酯纤维纸片为载体培养人二倍体细胞进行病毒增殖、扩增进而生产疫苗的方法。
背景技术
人二倍体细胞来源于正常人胚胎，为人源有限传代，通常为40～60代，当其超过传代寿命，则会发生细胞衰老、退化以及死亡。传代寿命内，人二倍体细胞的任一传代细胞的染色体组型保持正常二倍体染色体数目，人二倍体细胞株虽然稳定传代寿命有限，但其细胞株在衰老前的任一代都可将其冻存起来，需要时再复苏重新培养使用，因此，一个细胞株所能供应的使用量是非常巨大的。例如典型的人二倍体细胞：MRC-5细胞系、WI-38细胞系、2BS细胞系、KMB-17细胞系等都在商业上可供，可从诸如美国模式菌种收集中心(ATCC)、欧洲细胞培养物收藏中心(ECACC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)v等细胞种子库中购买。用人二倍体细胞制备病毒性疫苗可降低使用原代细胞在其培养物中存在各种潜在致病因子的风险，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质。人二倍体细胞与原代细胞相比，具有能够充分鉴定和标准化的优点，所建立的细胞库可多年用于生产，有利于质量控制。人二倍体细胞与肿瘤传代细胞相比，理论上不存在致肿瘤的潜在危险。
但是，由于人二倍体细胞生长缓慢、传代次数有限、对生长环境要求高，特别对流体剪切力的耐受能力极低，不宜在剪切力较大的生物反应器中贴壁生长。而目前上市的以人二倍体细胞为基质进行病毒培养的疫苗，大多采用静置培养的方式，难以适应大规模培养。因此，有必要对现有技术加以改进。
发明内容
为解决现有人二倍体细胞难以用生物反应器实现大规模培养的问题，本发明提供一种用固定床式或篮式生物反应器，并以片状载体大规模培养人二倍体细胞的方法，用于生产病毒疫苗。
本发明通过下列技术方案完成：一种大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，其特征在于包括下列步骤：
A)解冻复苏人二倍体细胞：
将冻存的人二倍体细胞放入36-38℃水浴中解冻复苏，将复苏后的细胞液加入到细胞培养液中，混匀，在800-1000rpm下离心二次，每次2-5分钟，弃上清液，在细胞沉淀中再加入细胞培养液，混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞培养液，在36-38℃下培养细胞；
所述细胞培养液按如下体积比配制：
B)扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液：
B1)细胞的挑选
选出培养4-7天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的细胞；
B2)细胞传代
B21)清洗细胞
将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝上，弃旧液，以含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS作为洗液加入细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，并将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3-5次，以冲洗细胞贴壁生长面；
B22)消化细胞
打开细胞培养瓶的瓶盖，弃洗液，加入0.125％胰蛋白酶消化液于细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3-5次，使胰蛋白酶消化液完全浸润细胞贴壁生长面，之后打开瓶盖，在酒精灯火焰保护下使细胞贴壁生长面朝上，弃胰蛋白酶消化液，再使细胞贴壁生长面朝下，平放3-15分钟，当细胞呈毛玻璃状时，轻拍细胞培养瓶，使细胞呈流沙状滑下后，直立细胞培养瓶；
所述0.125％胰蛋白酶消化液按下列体积比配制：
B23)悬浮细胞
在细胞培养瓶中加入与步骤A相同的细胞培养液，拧紧瓶盖，使细胞贴壁生长面朝下，振摇细胞培养瓶，以分散细胞成细胞悬液，收集细胞悬液于虹吸瓶中，旋转摇晃该虹吸瓶5-10次，使细胞混匀，补加与步骤A相同的细胞培养液，使细胞悬液稀释至1×104-5×105个细胞/ml，混匀，分装至细胞培养瓶中；
B3)细胞培养
将分装到细胞培养瓶中的细胞混合均匀，前后摇动4-6次，于37.0℃±0.5℃下恒温培养5-7天；
C)人二倍体细胞接种至固定床式或篮式生物反应器
C1)固定床式或篮式生物反应器准备
将片状载体放入固定床式或篮式生物反应器中，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS充分润湿片状载体，再添加0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS至固定床式或篮式生物反应器的pH探头和溶氧探头完全没过磷酸盐缓冲液PBS，于121℃下湿热灭菌30分钟；
C2)固定床式或篮式生物反应器预培养
将灭菌后的固定床式或篮式生物反应器中的残留0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS溶液放出，补加与步骤A相同的细胞培养液至浸润片状载体；
C3)细胞接种
按1×104-1×105个细胞/cm2的接种量，将步骤B3)培养的细胞以细胞悬液的形式加入到固定床式或篮式生物反应器中，补加与步骤A相同的细胞培养液至固定床式或篮式生物反应器培养体积；
C4)人二倍体细胞在片状载体上的贴壁
以0.5-2cm/s的线性流速驱动细胞悬液流过片状载体，使细胞贴壁在片状载体上1-3小时，待细胞培养液中不再检测到活细胞时，即完成人二倍体细胞在片状载体上的贴壁；
C5)人二倍体细胞在生物反应器上的培养；
C51)在固定床式或篮式生物反应器中的温度为35-39℃、pH值为6.5-8.0、溶氧15％-100％的条件下，进行细胞扩增培养24小时；
C52)随着细胞的不断扩增，细胞密度逐渐增大，采用灌流培养、循环培养、换液培养中的一种继续进行细胞培养，获得规模化人二倍体细胞。
所述各步骤对应的液体加入量均为常规量，或者适量。
所述各步骤使用的％均为质量百分比。
所述灌流培养，即通过连接固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入新的细胞培养液、排出原有的细胞培养液及代谢产物，使固定床式或篮式生物反应器培养体积保持不变，满足细胞生长所必须的营养元素。
所述循环培养，即在固定床式或篮式生物反应器旁挂上新细胞培养液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新细胞培养液瓶连通，使新的细胞培养液不断送入固定床式或篮式生物反应器中进行细胞培养，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物，实现细胞培养液循环，满足细胞生长所必须的营养元素。
所述换液培养，即在细胞培养过程中，将固定床式或篮式生物反应器中的原有细胞培养液及代谢产物通过出液管及其上的泵排出，再通过进液管及其上的泵送入新的细胞培养液，实现细胞培养液的更替，满足细胞生长所必须的营养元素。
D、用步骤C52)获得的人二倍体细胞进行下列病毒的接种、繁殖及收获：
D1)取出载有人二倍体细胞的片状载体3-5片，用结晶紫消化染色后计数，当片状载体上的细胞密度达4×104个细胞/cm2以上后，通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物；
D2)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，至该反应器中形成液流，之后以0.5-2cm/s的线性流速清洗细胞5—10分钟，停止流动，通过反应器的出液管及其上的泵，排出含有酚红的磷酸盐缓冲液PBS，再送入新的含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，以0.5-2cm/s的线性流速清洗细胞5—10分钟，停止流动；如此重复2-3次；
D3)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有对应病毒的病毒维持液，完成病毒接种；
D4)以0.5-2cm/s的线性流速，并在温度为30-39℃、pH值6.5-8.0、溶氧15％-100％的条件下，采用灌流培养、循环培养、换液培养中的一种，完成病毒扩增；
D5)病毒滴度或抗原含量达到设定值时，终止病毒培养，按2cm/s及以上的流速，使培养的病毒从片状载体上释放出来后，通过反应器的出液管及其上的泵排出，完成病毒收获。
收获的病毒液按常规制备成病毒活疫苗或者病毒灭活疫苗。
本发明具有下列优点和效果：采用上述技术方案，可方便地在一个固定床式或篮式生物反应器的相同环境中，设置若干片状载体，使人二倍体细胞贴壁在若干片状载体上，让人二倍体细胞在相同返应器及相同培养环境中完成增殖、扩繁后，获得规模化人二倍体细胞，又在规模化人二倍体细胞上进行规模化病毒接种、繁殖后，收获规模化病毒后，用来生产所需要的抗病毒疫苗，大幅增加抗病毒疫苗产量，满足疫情期所需疫苗数量，且无论是人二倍体细胞、还是抗病毒疫苗都具有较高的一致性，高效实现病毒疫苗的大规模工业化生产，满足市场需求。
附图说明
图1为实施例1细胞生长曲线图；
图2为实施例2细胞生长曲线图；
图3为实施例3细胞生长曲线图；
图4为细胞染色后可见其在反应器中不同位置的片状载体上均匀分布图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
大规模培养人二倍体细胞，具体是KMB-17细胞，用于生产肠道病毒EV71型病毒疫苗的方法，其特征在于包括下列步骤：
A)解冻复苏KMB-17细胞：
将从液氮中取出的冻存KMB-17细胞放入36～38℃水浴中解冻复苏，将复苏后的细胞液加入到适量细胞培养液中，混匀，在1000rpm下离心二次，每次2分钟，弃上清液，在细胞沉淀中再加入适量细胞培养液，混匀后，转移至一个T225细胞培养瓶中，添加适量细胞培养液，在36℃下培养细胞至细胞生长平铺于瓶底；
所述细胞培养液按如下体积比配制：
B)扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液：
B1)细胞的挑选
选出培养4天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的细胞；
B2)细胞传代
B21)清洗细胞
将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝上，弃旧液，以含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS作为洗液加入细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，并将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶5次，以冲洗细胞贴壁生长面；
B22)消化细胞
打开细胞培养瓶的瓶盖，弃洗液，加入0.125％胰蛋白酶消化液于细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3次，使胰蛋白酶消化液完全浸润细胞贴壁生长面，之后打开瓶盖，在酒精灯火焰保护下使细胞贴壁生长面朝上，弃胰蛋白酶消化液，再使细胞贴壁生长面朝下，平放5分钟，当细胞呈毛玻璃状时，轻拍细胞培养瓶，使细胞呈流沙状滑下后，直立细胞培养瓶；
所述0.125％胰蛋白酶消化液按下列体积比配制：
B23)悬浮细胞
在细胞培养瓶中加入与步骤A相同的细胞培养液，拧紧瓶盖，使细胞贴壁生长面朝下，振摇细胞培养瓶，以分散细胞成细胞悬液，收集细胞悬液于虹吸瓶中，旋转摇晃该虹吸瓶5次，使细胞混匀，补加与步骤A相同的细胞培养液，使细胞悬液稀释至1×105个细胞/ml，混匀，分装至四个T225细胞培养瓶中；
B3)细胞培养
将分装到细胞培养瓶中的细胞混合均匀，前后摇动4次，于37.0℃±0.5℃下恒温培养5天，分装至八个T225细胞培养瓶中；
C)KMB-17细胞接种至PALL固定床式或篮式生物反应器
C1)固定床式或篮式生物反应器准备
将20g、表面积24000cm2的片状载体放入固定床式或篮式生物反应器中，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS充分润湿片状载体，再添加300ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，使固定床式或篮式生物反应器的pH探头和溶氧探头完全浸泡(没过)在磷酸盐缓冲液PBS中，于121℃下湿热灭菌30分钟；
C2)固定床式或篮式生物反应器预培养
将灭菌后的固定床式或篮式生物反应器中的残留0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS溶液放出，补加与步骤A相同的细胞培养液至浸润片状载体；
C3)KMB-17细胞接种
按2.08×104个细胞/cm2的接种密度，将步骤B3)培养的KMB-17细胞以细胞悬液的形式加入到固定床式或篮式生物反应器中，补加与步骤A相同的适时细胞培养液，获得5×105个细胞/ml的细胞悬液共1000ml；
C4)KMB-17细胞在片状载体上的贴壁
以2cm/s的线性流速驱动细胞悬液流过片状载体，使细胞贴壁在片状载体上1小时，待细胞培养液中不再检测到活细胞时，即完成人二倍体细胞在片状载体上的贴壁；
C5)KMB-17细胞在生物反应器上的培养；
C51)在固定床式或篮式生物反应器中的温度为36℃、pH值为7.2、溶氧50％的条件下，进行24小时培养后，开启下列循环培养：在固定床式或篮式生物反应器旁挂上1L新细胞培养液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新细胞培养液瓶连通，以5ml/min的流速，使新的细胞培养液不断送入固定床式或篮式生物反应器中进行细胞培养，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，以6ml/min的流速，排出原有细胞培养液及代谢产物，实现细胞培养液循环，满足细胞生长所必须的营养元素；
C52)循环培养48小时后，开启下列灌流培养：即通过连接固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，以7ml/min的流速，送入新的细胞培养液，以1ml/min的流速，排出原有的细胞培养液及代谢产物，使固定床式或篮式生物反应器培养体积保持不变，满足细胞生长所必须的营养元素，连续灌流培养3天，使KMB-17细胞增殖四倍，细胞生长曲线如图1所示；
D、用步骤C52)获得的KMB-17细胞进行下列病毒的接种、繁殖及收获：
D1)每天取出载有KMB-17细胞的片状载体3片，用结晶紫消化染色后计数，当片状载体上的KMB-17细胞密度达4×104个细胞/cm2以上后，说明细胞实现了2-3倍以上增殖，培养至第五天细胞密度达到9.44×104个细胞/cm2，通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物；
D2)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，至该反应器中形成液流，之后以2cm/s的线性流速清洗细胞5分钟，停止流动，通过反应器的出液管及其上的泵，排出含有酚红的磷酸盐缓冲液PBS，再送入新的含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，以2cm/s的线性流速清洗细胞5分钟，停止流动；如此重复2次；
D3)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有对应病毒的下列病毒接种液，完成病毒接种：
D4)以2cm/s的线性流速，并在温度为36℃、pH值7.6、溶氧30％的条件下，完成病毒扩增培养；
D5)病毒扩增培养12小时后，开启下列循环培养进行病毒的繁殖：即在固定床式或篮式生物反应器旁挂上1L新鲜病毒维持液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新鲜病毒维持液瓶连通，使新鲜病毒维持液以5ml/min的流速送入固定床式或篮式生物反应器中，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，以6ml/min的流速排出原有病毒维持液，实现病毒维持液循环，病毒维持液配方如下：
| 名称 | MEM | 3％谷氨酰胺 | 6.6％碳酸氢钠 |
| v所占比例 | 95.0％(V/V) | 2.0％(V/V) | 3.0％(V/V) |
| 1000(ml) | 950 | 20.0 | 30.0 |
循环培养72小时后，终止病毒培养，按5cm/s的流速，使培养的病毒从片状载体上释放出来后，释放10分钟后，通过反应器的出液管及其上的泵排出，完成病毒收获，经常规的感染性滴度检测为6.5lgTCID50/ml，与细胞工厂培养的病毒收获液感染性滴度无显著性差异，本发明获得的该病毒收获液经灭活纯化后，配以佐剂制成人肠道病毒EV71型灭活疫苗。
实施例2
大规模培养人二倍体细胞，具体是KMB-17细胞，用于生产肠道病毒柯萨奇A16型病毒疫苗的方法，其特征在于包括下列步骤：
A)解冻复苏KMB-17细胞：
将从液氮中取出的冻存KMB-17细胞放入38℃水浴中解冻复苏，将复苏后的细胞液加入到适量细胞培养液中，混匀，在800rpm下离心二次，每次5分钟，弃上清液，在细胞沉淀中再加入适量细胞培养液，混匀后，转移至一个T225细胞培养瓶中，添加适量细胞培养液，在38℃下培养细胞至细胞生长平铺于瓶底；
所述细胞培养液按如下体积比配制：
B)扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液：
B1)细胞的挑选
选出培养7天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的细胞；
B2)细胞传代
B21)清洗细胞
将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝上，弃旧液，以含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS作为洗液加入细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，并将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶4次，以冲洗细胞贴壁生长面；
B22)消化细胞
打开细胞培养瓶的瓶盖，弃洗液，加入0.125％胰蛋白酶消化液于细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶4次，使胰蛋白酶消化液完全浸润细胞贴壁生长面，之后打开瓶盖，在酒精灯火焰保护下使细胞贴壁生长面朝上，弃胰蛋白酶消化液，再使细胞贴壁生长面朝下，平放15分钟，当细胞呈毛玻璃状时，轻拍细胞培养瓶，使细胞呈流沙状滑下后，直立细胞培养瓶；
所述0.125％胰蛋白酶消化液按下列体积比配制：
B23)悬浮细胞
在细胞培养瓶中加入与步骤A相同的细胞培养液，拧紧瓶盖，使细胞贴壁生长面朝下，振摇细胞培养瓶，以分散细胞成细胞悬液，收集细胞悬液于虹吸瓶中，旋转摇晃该虹吸瓶10次，使细胞混匀，补加与步骤A相同的细胞培养液，使细胞悬液稀释至1×104个细胞/ml，混匀，分装至四个T225细胞培养瓶中；
B3)细胞培养
将分装到细胞培养瓶中的细胞混合均匀，前后摇动5次，于37.0℃±0.5℃下恒温培养6天，分装至八个T225细胞培养瓶中；
C)KMB-17细胞接种至PALL固定床式或篮式生物反应器
C1)固定床式或篮式生物反应器准备
将20g、表面积24000cm2的片状载体放入固定床式或篮式生物反应器中，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS充分润湿片状载体，再添加300ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，使固定床式或篮式生物反应器的pH探头和溶氧探头完全浸泡(没过)在磷酸盐缓冲液PBS中，于121℃下湿热灭菌30分钟；
C2)固定床式或篮式生物反应器预培养
将灭菌后的固定床式或篮式生物反应器中的残留0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS溶液放出，补加与步骤A相同的细胞培养液至浸润片状载体；
C3)KMB-17细胞接种
按2.08×104个细胞/cm2的接种密度，将步骤B3)培养的KMB-17细胞以细胞悬液的形式加入到固定床式或篮式生物反应器中，补加与步骤A相同的适时细胞培养液，获得5×105个细胞/ml的细胞悬液共1000ml；
C4)KMB-17细胞在片状载体上的贴壁
以0.5cm/s的线性流速驱动细胞悬液流过片状载体，使细胞贴壁在片状载体上3小时，待细胞培养液中不再检测到活细胞时，即完成人二倍体细胞在片状载体上的贴壁；
C5)KMB-17细胞在生物反应器上的培养；
C51)在固定床式或篮式生物反应器中的温度为39℃、pH值为6.8、溶氧15％的条件下，进行24小时培养后，开启下列循环培养：在固定床式或篮式生物反应器旁挂上新细胞培养液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新细胞培养液瓶连通，以5ml/min的流速，使新的细胞培养液不断送入固定床式或篮式生物反应器中进行细胞培养，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，以6ml/min的流速，排出原有细胞培养液及代谢产物，实现细胞培养液循环，满足细胞生长所必须的营养元素；
C52)循环培养48小时后，开启下列灌流培养：即通过连接固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，以7ml/min的流速，送入新的细胞培养液，以1ml/min的流速，排出原有的细胞培养液及代谢产物，使固定床式或篮式生物反应器培养体积保持不变，满足细胞生长所必须的营养元素，连续灌流培养3天，使KMB-17细胞增殖四倍，细胞生长曲线如图2所示；
D、用步骤C52)获得的KMB-17细胞进行下列病毒的接种、繁殖及收获：
D1)每天取出载有KMB-17细胞的片状载体3-5片，用结晶紫消化染色后计数，当片状载体上的KMB-17细胞密度达4×104个细胞/cm2以上后，说明细胞实现了3倍以上增殖，培养至第五天细胞密度达到9.44×104个细胞/cm2，通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物；
D2)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，至该反应器中形成液流，之后以0.5cm/s的线性流速清洗细胞10分钟，停止流动，通过反应器的出液管及其上的泵，排出含有酚红的磷酸盐缓冲液PBS，再送入新的含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，以0.5cm/s的线性流速清洗细胞10分钟，停止流动；如此重复3次；
D3)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有对应病毒的下列病毒接种液，完成病毒接种：
D4)以2cm/s的线性流速，并在温度为39℃、pH值7.6、溶氧30％的条件下，完成病毒扩增培养；
D5)病毒扩增培养12小时后，开启下列循环培养进行病毒的繁殖：即在固定床式或篮式生物反应器旁挂上1L新鲜病毒维持液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新鲜病毒维持液瓶连通，使新鲜病毒维持液以5ml/min的流速送入固定床式或篮式生物反应器中，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，以6ml/min的流速排出原有病毒维持液，实现病毒维持液循环，病毒维持液配方如下：
| 名称 | MEM | 3％谷氨酰胺 | 6.6％碳酸氢钠 |
| 所占比例 | 95.0％(V/V) | 2.0％(V/V) | 3.0％(V/V) |
| 1000(ml) | 950.0 | 20.0 | 30.0 |
循环培养72小时后，终止病毒培养，按5cm/s的流速，使培养的病毒从片状载体上释放出来后，释放10分钟后，通过反应器的出液管及其上的泵排出，完成病毒收获，经常规的感染性滴度检测为6.0lgTCID50/ml，与细胞工厂培养的病毒收获液感染性滴度无显著性差异，本发明获得的该病毒收获液经灭活纯化后，配以佐剂制成人肠道病毒柯萨奇A16型灭活疫苗。
实施例3
大规模培养人二倍体细胞，具体是KMB-17细胞，用于生产肠道病毒CA10型病毒疫苗的方法，其特征在于包括下列步骤：
A)解冻复苏KMB-17细胞：
将从液氮中取出的冻存KMB-17细胞放入37℃水浴中解冻复苏，将复苏后的细胞液加入到适量细胞培养液中，混匀，在900rpm下离心二次，每次3分钟，弃上清液，在细胞沉淀中再加入适量细胞培养液，混匀后，转移至一个T225细胞培养瓶中，添加适量细胞培养液，在37℃下培养细胞至细胞生长平铺于瓶底；
所述细胞培养液按如下体积比配制：
B)扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液：
B1)细胞的挑选
选出培养5天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的细胞；
B2)细胞传代
B21)清洗细胞
将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝上，弃旧液，以含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS作为洗液加入细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，并将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶4次，以冲洗细胞贴壁生长面；
B22)消化细胞
打开细胞培养瓶的瓶盖，弃洗液，加入0.125％胰蛋白酶消化液于细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶5次，使胰蛋白酶消化液完全浸润细胞贴壁生长面，之后打开瓶盖，在酒精灯火焰保护下使细胞贴壁生长面朝上，弃胰蛋白酶消化液，再使细胞贴壁生长面朝下，平放3-15分钟，当细胞呈毛玻璃状时，轻拍细胞培养瓶，使细胞呈流沙状滑下后，直立细胞培养瓶；
所述0.125％胰蛋白酶消化液按下列体积比配制：
B23)悬浮细胞
在细胞培养瓶中加入与步骤A相同的细胞培养液，拧紧瓶盖，使细胞贴壁生长面朝下，振摇细胞培养瓶，以分散细胞成细胞悬液，收集细胞悬液于虹吸瓶中，旋转摇晃该虹吸瓶8次，使细胞混匀，补加与步骤A相同的细胞培养液，使细胞悬液稀释至5×105个细胞/ml，混匀，分装至四个T225细胞培养瓶中；
B3)细胞培养
将分装到细胞培养瓶中的细胞混合均匀，前后摇动5次，于37.0℃±0.5℃下恒温培养6天，分装至八个T225细胞培养瓶中；
C)KMB-17细胞接种至PALL固定床式或篮式生物反应器
C1)固定床式或篮式生物反应器准备
将20g、表面积24000cm2的片状载体放入固定床式或篮式生物反应器中，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS充分润湿片状载体，再添加300ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，使固定床式或篮式生物反应器的pH探头和溶氧探头完全浸泡(没过)在磷酸盐缓冲液PBS中，于121℃下湿热灭菌30分钟；
C2)固定床式或篮式生物反应器预培养
将灭菌后的固定床式或篮式生物反应器中的残留0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS溶液放出，补加与步骤A相同的细胞培养液至浸润片状载体；
C3)KMB-17细胞接种
按2.08×104个细胞/cm2的接种密度，将步骤B3)培养的KMB-17细胞以细胞悬液的形式加入到固定床式或篮式生物反应器中，补加与步骤A相同的适时细胞培养液，获得5×105个细胞/ml的细胞悬液共1000ml；
C4)KMB-17细胞在片状载体上的贴壁
以1cm/s的线性流速驱动细胞悬液流过片状载体，使细胞贴壁在片状载体上2小时，待细胞培养液中不再检测到活细胞时，即完成人二倍体细胞在片状载体上的贴壁；
C5)KMB-17细胞在生物反应器上的培养；
C51)在固定床式或篮式生物反应器中的温度为37℃、pH值为7.8、溶氧80％的条件下，进行24小时培养后，开启下列循环培养：在固定床式或篮式生物反应器旁挂上新细胞培养液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新细胞培养液瓶连通，以5ml/min的流速，使新的细胞培养液不断送入固定床式或篮式生物反应器中进行细胞培养，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，以6ml/min的流速，排出原有细胞培养液及代谢产物，实现细胞培养液循环，满足细胞生长所必须的营养元素；
C52)循环培养48小时后，开启下列灌流培养：即通过连接固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，以7ml/min的流速，送入新的细胞培养液，以1ml/min的流速，排出原有的细胞培养液及代谢产物，使固定床式或篮式生物反应器培养体积保持不变，满足细胞生长所必须的营养元素，连续灌流培养3天，使KMB-17细胞增殖四倍，细胞生长曲线如图3所示；
D、用步骤C52)获得的KMB-17细胞进行下列病毒的接种、繁殖及收获：
D1)每天取出载有KMB-17细胞的片状载体5片，用结晶紫消化染色后计数，当片状载体上的KMB-17细胞密度达4×104个细胞/cm2以上后，说明细胞实现了3倍以上增殖，培养至第五天细胞密度达到9.44×104个细胞/cm2，通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物；
D2)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，至该反应器中形成液流，之后以1cm/s的线性流速清洗细胞8分钟，停止流动，通过反应器的出液管及其上的泵，排出含有酚红的磷酸盐缓冲液PBS，再送入新的含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，以1cm/s的线性流速清洗细胞8分钟，停止流动；如此重复3次；
D3)通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有对应病毒的下列病毒接种液，完成病毒接种：
D4)以2cm/s的线性流速，并在温度为39℃、pH值7.6、溶氧30％的条件下，完成病毒扩增培养；
D5)病毒扩增培养12小时后，开启下列循环培养进行病毒的繁殖：即在固定床式或篮式生物反应器旁挂上1L新鲜病毒维持液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新鲜病毒维持液瓶连通，使新鲜病毒维持液以5ml/min的流速送入固定床式或篮式生物反应器中，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，以6ml/min的流速排出原有病毒维持液，实现病毒维持液循环，病毒维持液配方如下：
| 名称 | MEM | 3％谷氨酰胺 | 6.6％碳酸氢钠 |
| 所占比例 | 95.0％(V/V) | 2.0％(V/V) | 3.0％(V/V) |
| 1000(ml) | 950.0 | 20.0 | 30.0 |
循环培养72小时后，终止病毒培养，按5cm/s的流速，使培养的病毒从片状载体上释放出来后，释放10分钟后，通过反应器的出液管及其上的泵排出，完成病毒收获，经常规的感染性滴度检测为8.0lgTCID50/ml，与细胞工厂培养的病毒收获液感染性滴度无显著性差异，本发明获得的该病毒收获液经灭活纯化后，配以佐剂制成人肠道病毒CA10型灭活疫苗。
由实施例1-3可以看出，本发明的方法通过对以上各个步骤操作条件的严格控制，找到各个步骤操作条件的合理组合，使得采用固定床式或篮式生物反应器片状载体培养人二倍体细胞大规模生产病毒疫苗成为可能，减少劳动力成本，确保批次完整性，由于发酵罐严格的温度、pH、DO的控制，还能很好的维持批间一次性，可以高效实现病毒疫苗的大规模工业化生产。
Claims (6)
1.一种大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，其特征在于包括下列步骤：
A、解冻复苏人二倍体细胞：
将冻存的人二倍体细胞放入36-38℃水浴中解冻复苏，将复苏后的细胞液加入到细胞培养液中，混匀，在800-1000rpm下离心二次，每次2-5分钟，弃上清液，在细胞沉淀中再加入细胞培养液，混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞培养液，在36-38℃下培养细胞；
所述细胞培养液按如下体积比配制：
DMEM或MEM 81.5-93.5%
3%谷氨酰胺 1.0-3.0%
6.6%碳酸氢钠 0.5-3.0%
硫酸卡那霉素注射液 0-100IU/ml
新生牛血清 5.0-10.0%
胎牛血清 0.0-2.5%
各组分总合 100%；
B、扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液：
B1、细胞的挑选
选出培养4-7天、生长成致密单层、形态良好、不卷边、不脱落、无pH异常、无污染、培养液清亮的细胞；
B2、细胞传代
B21、清洗细胞
将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝上，弃旧液，以含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS作为洗液加入细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，并将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3-5次，以冲洗细胞贴壁生长面；
B22、消化细胞
打开细胞培养瓶的瓶盖，弃洗液，加入0.125%胰蛋白酶消化液于细胞培养瓶中，拧紧瓶盖，将细胞培养瓶中的细胞贴壁生长面朝下，倾斜30度角，前后摇动细胞培养瓶3-5次，使胰蛋白酶消化液完全浸润细胞贴壁生长面，之后打开瓶盖，在酒精灯火焰保护下使细胞贴壁生长面朝上，弃胰蛋白酶消化液，再使细胞贴壁生长面朝下，平放3-15分钟，当细胞呈毛玻璃状时，轻拍细胞培养瓶，使细胞呈流沙状滑下后，直立细胞培养瓶；
所述0.125%胰蛋白酶消化液按下列体积比配制：
磷酸盐缓冲液PBS 84.7-87.5%
1%胰蛋白酶 12.0-14.0%
4% EDTA.2Na 0.3-0.8%
1mol/L NaOH 0.2-0.5%
各组分总合 100%；
B23、悬浮细胞
在细胞培养瓶中加入与步骤A相同的细胞培养液，拧紧瓶盖，使细胞贴壁生长面朝下，振摇细胞培养瓶，以分散细胞成细胞悬液，收集细胞悬液于虹吸瓶中，旋转摇晃该虹吸瓶5-10次，使细胞混匀，补加与步骤A相同的细胞培养液，使细胞悬液稀释至1×104-5×105个细胞/ml，混匀，分装至细胞培养瓶中；
B3、细胞培养
将分装到细胞培养瓶中的细胞混合均匀，前后摇动4-6次，于37.0℃±0.5℃下恒温培养5-7天；
C、人二倍体细胞接种至固定床式或篮式生物反应器
C1、固定床式或篮式生物反应器准备
将片状载体放入固定床式或篮式生物反应器中，用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液PBS充分润湿片状载体，再添加0.01mol/L 磷酸盐缓冲液PBS至固定床式或篮式生物反应器的pH探头和溶氧探头完全没过磷酸盐缓冲液PBS，于121℃下湿热灭菌30分钟；
C2、固定床式或篮式生物反应器预培养
将灭菌后的固定床式或篮式生物反应器中的残留0.01mol/L 磷酸盐缓冲液PBS溶液放出，补加与步骤A相同的细胞培养液至浸润片状载体；
C3、细胞接种
按1×104-1×105个细胞/cm2的接种量，将步骤B3）培养的细胞以细胞悬液的形式加入到固定床式或篮式生物反应器中，补加与步骤A相同的细胞培养液至固定床式或篮式生物反应器培养体积；
C4、人二倍体细胞在片状载体上的贴壁
以0.5-2cm/s的线性流速驱动细胞悬液流过片状载体，使细胞贴壁在片状载体上1-3小时，待细胞培养液中不再检测到活细胞时，即完成人二倍体细胞在片状载体上的贴壁；
C5、人二倍体细胞在生物反应器上的培养；
C51、在固定床式或篮式生物反应器中的温度为35-39℃、pH值为6.5-8.0、溶氧15％-100％的条件下，进行细胞扩增培养24小时；
C52、随着细胞的不断扩增，细胞密度逐渐增大，采用灌流培养、循环培养、换液培养中的一种继续进行细胞培养，获得规模化人二倍体细胞。
2.如权利要求1所述的大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，其特征在于所述灌流培养是通过连接固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入新的细胞培养液、排出原有的细胞培养液及代谢产物，使固定床式或篮式生物反应器培养体积保持不变，满足细胞生长所必须的营养元素。
3.如权利要求1所述的大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，其特征在于所述循环培养是在固定床式或篮式生物反应器旁挂上新细胞培养液瓶，通过进液管及其上的泵将固定床式或篮式生物反应器与新细胞培养液瓶连通，使新的细胞培养液不断送入固定床式或篮式生物反应器中进行细胞培养，再通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物，实现细胞培养液循环，满足细胞生长所必须的营养元素。
4.如权利要求1所述的大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，其特征在于所述换液培养是在细胞培养过程中，将固定床式或篮式生物反应器中的原有细胞培养液及代谢产物通过出液管及其上的泵排出，再通过进液管及其上的泵送入新的细胞培养液，实现细胞培养液的更替，满足细胞生长所必须的营养元素。
5.如权利要求1所述的大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，其特征在于所述步骤C52获得的人二倍体细胞通过下列步骤进行病毒的接种、繁殖及收获：
D1、取出载有人二倍体细胞的片状载体3-5片，用结晶紫消化染色后计数，当片状载体上的细胞密度达4×104个细胞/cm2以上后，通过固定床式或篮式生物反应器的出液管及其上的泵，排出原有细胞培养液及代谢产物；
D2、通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，至该反应器中形成液流，之后以0.5-2cm/s的线性流速清洗细胞5—10分钟，停止流动，通过反应器的出液管及其上的泵，排出含有酚红的磷酸盐缓冲液PBS，再送入新的含有酚红10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS，以0.5-2cm/s的线性流速清洗细胞5—10分钟，停止流动；如此重复2-3次；
D3、通过固定床式或篮式生物反应器的进液管及其上的泵，送入含有对应病毒的病毒维持液，完成病毒接种；
D4、以0.5-2cm/s的线性流速，并在温度为30-39℃、pH值6.5-8.0、溶氧15％-100％的条件下，采用灌流培养、循环培养、换液培养中的一种，完成病毒扩增；
D5、病毒滴度或抗原含量达到设定值时，终止病毒培养，按2cm/s及以上的流速，使培养的病毒从片状载体上释放出来后，通过反应器的出液管及其上的泵排出，完成病毒收获。
6.如权利要求5所述的大规模培养人二倍体细胞用于生产病毒疫苗的方法，其特征在于收获的病毒液按常规制备成病毒活疫苗或者病毒灭活疫苗。
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