CN113117067A - 一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法，包括：将收获的病毒鸡胚细胞培养上清过滤并浓缩处理后，采用含氯化钠以及精氨酸的磷酸缓冲液洗滤并加入β‑丙内酯进行灭活水解，再加入人血清白蛋白并低温静置后，进行超声以及纯化，即得已去除鸡胚宿主蛋白的狂犬病疫苗制品纯化液。本发明的方法中，加入人血白蛋白，可有效减少超声波对病毒颗粒的影响；进一步降低了产品中杂蛋白的含量；通过超声波清洗机对灭活水解液进行超声处理，洁净度要求及操作难度低，稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗制品纯化技术领域，尤其涉及一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法。
背景技术
狂犬病毒培养收获液常含有各种成分的混合体系。采用Vero细胞作为培养基质的狂犬病毒疫苗制备中，常将培养收获液澄清浓缩后，采用超声及层析的方式去除制品中的DNA杂质。而现有鸡胚法制备狂犬病疫苗的工艺，是将鸡胚细胞剪碎，消化分散后的鸡胚原代成纤维细胞作为培养基质。收获的培养液中常含有细胞碎片、游离宿主DNA及鸡胚宿主蛋白。收获液经澄清过滤后，通常采用简单的超滤浓缩及分子筛层析纯化工艺得到终产品。虽然鸡胚法制备狂犬病疫苗对宿主DNA无严格要求，但采用现有工艺制备的狂犬病疫苗，残留的宿主蛋白较高，蛋白去除率低，易引起临床的不良反应。造成产品中杂蛋白偏高的主要原因有：(1)宿主细胞蛋白质难以通过分子大小差异去除。部分宿主蛋白分子量大小不一，部分宿主蛋白及游离的糖蛋白等形成了大分子聚集体，和狂犬病毒粒子较为接近。(2)宿主DNA加剧了蛋白的聚集。宿主基因组DNA断裂产生大量断裂的大片段的DNA带有的粘性末端，在超滤浓缩过程中加剧了病毒及宿主蛋白的聚集。(3)超声只能去除部分杂蛋白。直接超声处理浓缩液，可去除部分杂蛋白，但仍残留较高蛋白聚集体，难以保证产品最终质量。
因此，亟需一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法，向浓缩液中加入一定浓度的人血白蛋白，以分散病毒块及聚集蛋白体；并同时采用一定功率、频率及功率密度的超声波处理，打断大片段DNA，降低浓缩液黏性；通过分子筛层析，将分散的宿主蛋白聚集体及大片段DNA和病毒颗粒分离，再通过离子交换层析进一步精纯去除组分内的小分子蛋白，达到提高产品质量及合格率的目的。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法，包括：
将收获的病毒鸡胚细胞培养上清过滤并浓缩处理后，采用含氯化钠以及精氨酸的磷酸缓冲液洗滤并加入β-丙内酯进行灭活水解，再加入人血清白蛋白并低温静置后，进行超声以及纯化，即得已去除鸡胚宿主蛋白的狂犬病疫苗制品纯化液。
优选地，所述过滤为依次经3.0μm～5.0μm的滤芯以及0.45μm～1.2μm的滤芯进行澄清过滤。
优选地，所述浓缩为经100kD～300kD的超滤膜包或中空纤维进行浓缩。
优选地，所述洗滤为采用pH为7.6～8.0的含50mmol/L～300mmol/L氯化钠以及100mmol/L～300mmol/L精氨酸的磷酸缓冲液进行洗滤5～10倍。
优选地，所述灭活水解为按1:2000～1:6000加入β-丙内酯进行灭活水解。
优选地，所述人血清白蛋白的终浓度为0.5％～5％。
进一步地，所述人血清白蛋白的终浓度为0.75％～1.5％。
优选地，所述低温静置为于2℃～8℃下静置12h～24h。
优选地，所述超声包括：转移至超声专用瓶中，采用超声波清洗机于0℃～25℃下超声0.5h～3h；
其中，转移的液体体积不超过所述超声专用瓶总体积的1/4～2/3；
所述超声波清洗机的频率为25kHz～28kHz，功率为1000w～5000w，功率密度为0.5w/cm2～1.5w/cm2。
优选地，所述纯化为依次采用分子筛填料以及阴离子交换填料进行层析纯化。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的方法中，加入人血白蛋白，可有效减少超声波对病毒颗粒的影响；进一步降低了产品中杂蛋白的含量；通过超声波清洗机对灭活水解液进行超声处理，洁净度要求及操作难度低，稳定性高。
附图说明
图1-2为灭活水解液/纯化收集液1-9的SDS-PAGE蛋白胶考马斯亮蓝分析结果；
图3为灭活水解液1的分子筛层析及阴离子交换层析色谱结果；
图4为灭活水解液4的分子筛层析及阴离子交换层析色谱结果；
图5为灭活水解液7的分子筛层析及阴离子交换层析色谱结果；
图6为灭活水解液10的分子筛层析及阴离子交换层析色谱结果；
图7为纯化收集液9中病毒颗粒的电镜照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
本实施例提供一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法，包括：
将收获的病毒鸡胚细胞培养上清依次经3.0μm～5.0μm的滤芯以及0.45μm～1.2μm的滤芯进行澄清过滤，并经100kD～300kD的超滤膜包或中空纤维进行浓缩处理后，采用pH为7.6～8.0的含50mmol/L～300mmol/L氯化钠以及100mmol/L～300mmol/L精氨酸的磷酸缓冲液进行洗滤5～10倍，并按1:2000～1:6000加入β-丙内酯进行灭活水解，再加入人血清白蛋白(所述人血清白蛋白的终浓度为0.75％～1.5％)并于2℃～8℃下静置12h～24h后，转移至超声专用瓶中(转移的液体体积为所述超声专用瓶总体积的1/4～2/3)，采用超声波清洗机(频率为25kHz～28kHz，功率为1000w～5000w，功率密度为0.5w/cm2～1.5w/cm2)于0℃～25℃下超声0.5h～3h，依次采用分子筛填料sepharose4FF或sepharose 6FF以及阴离子交换填料capto Q或capto Q impres进行层析纯化，即得已去除鸡胚宿主蛋白的狂犬病疫苗制品纯化液。
实施例2
取30L收获的病毒鸡胚细胞培养上清依次经3.0μm的滤芯以及1.2μm的滤芯进行澄清过滤，并经300kD的超滤膜包进行浓缩5倍处理后，采用含150mmol/L氯化钠以及200mmol/L精氨酸的磷酸缓冲液(pH7.8)进行洗滤5倍后，再浓缩至原体积的15倍左右，得到2000mL的浓缩液；按1:4000加入500μL的β-丙内酯，并于2℃～8℃下振荡24h，转入37℃下继续振荡2h，完成灭活水解，得到灭活水解液1。
取20mL灭活水解液1过层析柱xk26/70，sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集洗脱峰1，采用pH7.8的含100mmol/L氯化钠的磷酸盐作为流动相，洗脱流速为1cm/min，得到纯化收集液2。
取纯化收集液2上样至经平衡液(含100mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)平衡后的阴离子交换层析柱capto Q上，经洗杂缓冲液(含300mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)冲洗至基线后，采用洗脱缓冲液(含600mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)洗脱收集，得到纯化收集液3。
取500mL灭活水解液1，于2℃～8℃下静置16h，转移至2L超声专用瓶，放入含有冰水的VGT-1024S型超声波清洗机中，频率为28kHz，功率为1400w，功率密度为0.5w/cm2，于0℃-25℃下超声1h，得到灭活水解液4。
取20mL灭活水解液4过层析柱xk26/70，sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集洗脱峰1，采用pH7.8的含100mmol/L氯化钠的磷酸盐作为流动相，洗脱流速1cm/min，得到纯化收集液5。
取纯化收集液5上样至经平衡液(含100mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)平衡后的阴离子交换层析柱capto Q上，经洗杂缓冲液(含300mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)冲洗至基线后，采用洗脱缓冲液(含600mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)洗脱收集，得到纯化收集液6。
取500mL灭活水解液1，加入人血清白蛋白至其终浓度为1.5％，并于2℃-8℃下静置16h，转移至2L超声专用瓶，放入含有冰水的VGT-1024S型超声波清洗机中，频率为28kHz，功率为1400w，功率密度为0.5w/cm2，于0℃-25℃下超声1h，得到灭活水解液7。
取20mL灭活水解液7过层析柱xk26/70，sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集洗脱峰1，采用pH7.8的含100mmol/L氯化钠的磷酸盐作为流动相，洗脱流速为1cm/min，得到纯化收集液8。
取纯化收集液8上样至经平衡液(含100mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)平衡后的阴离子交换层析柱capto Q上，经洗杂缓冲液(含300mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)冲洗至基线后，采用洗脱缓冲液(含600mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)洗脱收集，得到纯化收集液9。
取500mL灭活水解液1，加入人血清白蛋白至其终浓度为0.75％，并于2℃-8℃下静置16h，转移至2L超声专用瓶，放入含有冰水的VGT-1024S型超声波清洗机中，频率为28kHz，功率为1400w，功率密度为0.5w/cm2，于0℃-25℃下超声1h，得到灭活水解液10。
取20mL灭活水解液10过层析柱xk26/70，sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集洗脱峰1，采用pH7.8的含100mmol/L氯化钠的磷酸盐作为流动相，洗脱流速为1cm/min，得到纯化收集液11。
取纯化收集液11上样至经平衡液(含100mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)平衡后的阴离子交换层析柱capto Q上，经洗杂缓冲液(含300mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)冲洗至基线后，采用洗脱缓冲液(含600mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，pH7.8)洗脱收集，得到纯化收集液12。
灭活水解液/纯化收集液1-9的SDS-PAGE蛋白胶考马斯亮蓝分析结果如图1-2所示，其中：Lane 1为纯化收集液2；Lane 2为纯化收集液5；Lane 3为纯化收集液8；Lane 4为灭活水解液1；Lane 5为灭活水解液4；Lane 6为灭活水解液7；Lane 7为纯化收集液3；Lane8为纯化收集液6；Lane 9为纯化收集液9；
灭活水解液1、灭活水解液4、灭活水解液7以及灭活水解液10的分子筛层析及阴离子交换层析色谱结果如图3-6所示，其中：图A均为分子筛层析色谱结果，图B均为阴离子交换层析色谱结果；且图A中峰1均为病毒峰，峰2均为杂蛋白峰，而图B中峰1均为杂蛋白峰，峰2均为病毒峰；
纯化收集液9中病毒颗粒的电镜照片如图7所示；
灭活水解液/纯化收集液1-12中蛋白质含量、抗原含量、蛋白去除率以及比活性的检测数据如下表所示：
综上所述，本发明的方法中，加入人血白蛋白，可有效减少超声波对病毒颗粒的影响；进一步降低了产品中杂蛋白的含量；通过超声波清洗机对灭活水解液进行超声处理，洁净度要求及操作难度低，稳定性高。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法，其特征在于，包括：
将收获的病毒鸡胚细胞培养上清过滤并浓缩处理后，采用含氯化钠以及精氨酸的磷酸缓冲液洗滤并加入β-丙内酯进行灭活水解，再加入人血清白蛋白并低温静置后，进行超声以及纯化，即得已去除鸡胚宿主蛋白的狂犬病疫苗制品纯化液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤为依次经3.0μm～5.0μm的滤芯以及0.45μm～1.2μm的滤芯进行澄清过滤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩为经100kD～300kD的超滤膜包或中空纤维进行浓缩。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗滤为采用pH为7.6～8.0的含50mmol/L～300mmol/L氯化钠以及100mmol/L～300mmol/L精氨酸的磷酸缓冲液进行洗滤5～10倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭活水解为按1:2000～1:6000加入β-丙内酯进行灭活水解。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人血清白蛋白的终浓度为0.5％～5％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述人血清白蛋白的终浓度为0.75％～1.5％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低温静置为于2℃～8℃下静置12h～24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声包括：转移至超声专用瓶中，采用超声波清洗机于0℃～25℃下超声0.5h～3h；
其中，转移的液体体积不超过所述超声专用瓶总体积的1/4～2/3；
所述超声波清洗机的频率为25kHz～28kHz，功率为1000w～5000w，功率密度为0.5w/cm2～1.5w/cm2。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化为依次采用分子筛填料以及阴离子交换填料进行层析纯化。
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