CN111575249B - 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法。该方法包括：将灭活的病毒液通过滤膜初步过滤，然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液；加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA；将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗，再用洗脱液平衡2～5个柱体积，接着将病毒浓缩液泵入到层析柱中，洗脱液洗脱；在紫外检测波长280nm条件下，收集第一个流穿峰即为病毒纯化液。本发明采用超滤浓缩、核酸酶消化和柱层析工艺步骤，结合复合填料Capto Core 700对新型冠状病毒液进行纯化，能够快速、稳定地大规模生产新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。

Description

新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法
技术领域
本发明是关于一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法，具体涉及一种应用复合填料Capto Core 700纯化新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的方法。
背景技术
2019年底发现的新型冠状病毒SARS-CoV-2疫情迅速席卷全球，对全球各地区人民的生命健康和社会的经济发展都带来巨大的损失。
疫苗作为狙击和预防新冠病毒的一种有效方式，成为全球药物研发的关注焦点。
灭活疫苗是指将通过物理或者化学的方法使病毒失去感染性和复制能力，但保留了病毒能引起人体免疫应答的活性而制备成的疫苗。灭活疫苗是针对新发突发传染病最有效的疫苗研发途径。具有生产工艺成熟、质量标准可控、保护范围广等优点，可用于大规模接种，并且有国际通行标准来判断疫苗的安全性和有效性。
SARS-CoV-2病毒直径在为60～140nm，主要有4种结构蛋白，分别为S(棘突)蛋白、N(核衣壳)蛋白、M(膜)蛋白、E(包膜)蛋白。其中，S蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引起免疫应答的重要抗原，是疫苗设计的关键靶点。因此，高效、快速地完成病毒纯化同时减少表面S蛋白的损伤对制备灭活疫苗至关重要。
Capto core 700是一种复合模式的层析填料，由辛胺配基核心和惰性壳层组成，惰性壳层可以阻排分子量大于700KD的分子，阻止其经壳上的孔进入核心；内层含有带正电荷且具有疏水性的辛胺配基，常见的宿主蛋白、DNA片段、核酸酶的杂质均可以进入孔内与辛胺基结合而被去除。适用于病毒类疫苗凝胶过滤纯化，可以去除培养基中的杂蛋白、宿主细胞蛋白，具有处理量大、流速快、化学稳定性高和良好的机械性能等特点，易于实现规模扩大。
目前对新型冠状病毒尚无有效的预防疫苗，未发现应用复合填料Capto Core 700纯化新型冠状病毒灭活疫苗的技术报道。
发明内容
为了能够快速制备灭活疫苗，尽可能地去除病毒培养液中所含的宿主蛋白与DNA等杂质，本发明的目的在于采用Capto core 700复合填料纯化新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Vero细胞灭活疫苗病毒液；新冠病毒SARS-CoV-2的分子大小在100nm左右，不能进去空隙从而以流穿模式得到纯化。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一方面，本发明提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法，其包括以下步骤：
将灭活的新型冠状病毒Vero细胞病毒液通过滤膜初步过滤，除去细胞碎片及部分杂蛋白；然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液；
向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA；
将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗(至少1个柱体积，去除内毒素)，然后再用洗脱液平衡2～5个柱体积，接着将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析柱中，采用洗脱液洗脱；在紫外检测波长280nm条件下，收集第一个流穿峰即为新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。
纯化新型冠状病毒Vero细胞病毒液的难点在于需要高效、快速的完成病毒纯化同时减少表面抗原的损伤，尽可能去除宿主细胞蛋白与DNA，以符合疫苗质量标准。本发明创造性地采用“核酸酶处理+复合填料Capto Core 700一步纯化法”，通过向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶能够将宿主Vero细胞DNA裂解为小片段，同时对新冠病毒不会造成损伤，再通过Capto core 700纯化后能够更加有效去除宿主细胞DNA与杂蛋白；两种操作的组合能够保证抗原的高效回收，同时有效去除宿主Vero细胞DNA与杂蛋白。
本发明的纯化方法中，先采用碱液冲洗能够除去纯化前层析系统、管路以及填料中都可能有细菌残留，这些残留的细菌会产生内毒素，进入人体会造成发热、内毒素休克等不良影响。
新型冠状病毒主要通过呼吸道传播，传播能力强，灭活病毒疫苗生产难度高，在生产工艺中可能产生气溶胶；因此，本发明的纯化方法中，收获的新型冠状病毒Vero细胞病毒液首先进行灭活，是针对新冠病毒的特殊工艺操作。
灭活步骤包括：
向收获的新型冠状病毒Vero细胞病毒液中加入灭活剂β-丙内酯(β-丙内酯与病毒液的体积比为1:(2000～8000))，静置于2～8℃冰箱内灭活，灭活时间为16～48h；灭活完成后进行水解，水解步骤为：将病毒液置于恒温箱内37℃水解2小时，得到灭活的新型冠状病毒Vero细胞病毒液。
上述的纯化方法中，优选地，所述新型冠状病毒为冠状病毒SARS-CoV-2。
上述的纯化方法中，优选地，进行初步过滤的滤膜孔径为0.45～5.0μm。
上述的纯化方法中，优选地，进行超滤浓缩的滤膜的截留分子量为100～300KD。
上述的纯化方法中，优选地，超滤浓缩体积为10倍以上。
上述的纯化方法中，优选地，向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，使核酸酶在浓缩液中的终浓度为50～300U/ml，室温下放置2～12h或37℃下放置0.5～4h，降解Vero细胞中残留的DNA。
上述的纯化方法中，优选地，将复合填料Capto Core 700装入层析柱中的柱高为20～50cm。
上述的纯化方法中，优选地，所述碱液为1mol/L的氢氧化钠溶液。采用1mol/L的NaOH溶液冲洗能够有效去除层析系统、管路、填料中的内毒素，使产品符合质量标准。
上述的纯化方法中，优选地，所述洗脱液为pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液。
上述的纯化方法中，优选地，采用洗脱液进行洗脱的洗脱流速为30～100cm/h。
上述的纯化方法中，优选地，将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析柱中的上样体积为柱体积的10％～30％。
上述的纯化方法中，优选地，所述核酸酶包括全能核酸酶，优选采用Benzonase核酸酶和/或Biolonase核酸酶。
本发明的纯化方法中，关键在于确定了应用复合填料Capto Core 700纯化新型冠状病毒灭活疫苗纯化液有重要影响的因素条件：柱高、上样体积占柱体积百分比、洗脱溶液pH，洗脱流速等。通过控制这些因素条件在本发明的范围内，能成功纯化出以Vero细胞为基质的新型冠状病毒纯化液，所得病毒纯化液具有较高的抗原回收率，并较好地去除培养液中的残余细胞宿主蛋白和DNA，符合国家限量标准。
上述的纯化方法中，优选地，所述层析柱包括XK50/60层析柱、XK16/40层析柱或BPG 140/500层析柱。
另一方面，本发明还提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液，其是采用上述纯化方法纯化获得的。
再一方面，本发明还提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗，其是采用上述新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液经过适当稀释后配制新型冠状病毒灭活疫苗，配制后分装，即为Vero细胞新型冠状病毒灭活疫苗制品。
本发明的有益效果：
本发明通过采用超滤浓缩、核酸酶消化和柱层析工艺步骤，结合柱层析首次采用复合填料Capto Core 700对新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液进行纯化，能够快速、稳定地大规模生产新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。
附图说明
图1显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)方法进行鉴定的图谱(M：marker；1：病毒浓缩液；2：病毒纯化液)。
图2显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过Western Blot方法进行鉴定的图谱(从左到右分别为：一抗：抗S蛋白；一抗：抗N蛋白；一抗：新冠肺炎恢复期患者血清)。
图3显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过HPLC方法进行纯度分析的图谱。
图4显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液的电镜图片(A为全局图，B、C为局部放大图)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明以下实施例中，新冠病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法中，各类检测指标按照以下方法：
蛋白质含量：Lowry法，参照《中华人民共和国药典》(2015年版，三部)进行检定。
抗原含量：ELISA法，参照《新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检定方法》进行检定。
Vero细胞DNA残留量：qPCR法，本试验结果表明，经一步纯化后纯化样品中的外源性DNA残留量均低于100pg/剂量，符合国家限量标准。
Vero细胞蛋白质残留量：参照《中华人民共和国药典》(2015年版，三部)进行检定，本试验结果表明，经一步纯化后纯化样品中的Vero细胞蛋白质残留量均低于100ng/剂量，符合国家限量标准。
实施例1：
本实施例提供一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法，其包括以下步骤：
向收获的新型冠状病毒Vero细胞病毒液(病毒滴度为7.4～7.5LgCCID50/ml)中加入灭活剂β-丙内酯(β-丙内酯与病毒液的体积比为1:4000)，静置于2～8℃冰箱内灭活，灭活时间为16～48h；灭活完成后进行水解，水解步骤为：将病毒液置于恒温箱内37℃水解2小时，得到灭活的新型冠状病毒Vero细胞病毒液。通过1.0/0.65μm的滤膜初步过滤，除去细胞碎片及部分杂蛋白；然后通过截留分子量为300KD的滤膜超滤，浓缩体积10倍以上，得到新型冠状病毒浓缩液；
向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶(Benzonase核酸酶)，使核酸酶在浓缩液中的终浓度为200U/ml，室温下放置2h，降解Vero细胞中残留的DNA；
将复合填料Capto Core 700装入XK50/60层析柱中，柱床高度20～30cm，先采用1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗填装好的层析柱1个柱体积，以去除内毒素；然后再用洗脱液(pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液)平衡2～5个柱体积，接着将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析柱中，上样体积为柱体积的15％，采用洗脱液(pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液)洗脱，洗脱流速为45cm/h；紫外检测器波长280nm处检测，收集第一个流穿峰即为新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化液。表1为3组批次新冠病毒液样品纯化后获得的病毒纯化液检测指标。
表1：
Figure BDA0002537594510000051
Figure BDA0002537594510000061
由表1三组样品纯化后的检测指标可以看出：本发明的纯化方法对新型冠状病毒的纯化效果优良，纯化方法稳定，具有可重复性。采用本发明的复合填料Capto core700纯化新型冠状病毒，上样量高、流速快，缩短了工艺时间，既保留了有效抗原，又有效去除了核酸酶、宿主蛋白与DNA等杂质，适用于新冠病毒灭活疫苗的快速研发与生产。
图1显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)方法进行鉴定的图谱。图2显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过Western Blot方法进行鉴定的图谱。
由图1、图2可以看出：病毒纯化液中含有S蛋白，N蛋白以及M蛋白，利用抗S蛋白抗体、抗N蛋白抗体以及人恢复期血清进行反应，病毒浓缩液和纯化液中的S蛋白与N蛋白分别与相应抗体呈强阳性反应。
图3显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过HPLC方法进行纯度分析的图谱。由图3可以看出：病毒纯化液的纯度达到99.28％。
图4显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液的电镜图片。由图4可以看出：病毒体颗粒为大致球形或中等多边形，直径范围约为80nm～160nm，灭活病毒体包膜周围有清晰且完整的刺突蛋白，具有冠状病毒典型结构，说明新型冠状病毒纯化液中具有完整的新型冠状灭活病毒颗粒。
实施例2：
本实施例提供应用Capto core 700复合填料纯化新型冠状病毒液，对比应用分离范围为6×104～20×106D的琼脂糖凝胶Sepharose 4Fast Flow纯化新型冠状病毒液。将收集纯化液进行检定，检测项目包括：蛋白含量、抗原含量、Vero细胞蛋白(HCP)残留量、Vero细胞DNA残留量，计算抗原回收率、HCP去除率以及DNA去除率，将计算结果进行分析比较，如下表2所示，表2为采用Capto core 700与Sepharose 4Fast Flow纯化后的病毒纯化液检测指标。
表2：
Figure BDA0002537594510000062
使用Capto core 700纯化病毒浓缩液，抗原回收率高于Sepharose 4Fast Flow，HCP与DNA的去除率无明显差别，但Capto core 700处理量大、流速快、化学稳定性高，更适宜于工业化大规模生产。
实施例3：
本实施例提供本发明纯化工艺的放大方案，进行了三种规格的纯化工艺放大实验，分别使用XK16/40层析柱、XK50/60层析柱、BPG140/500层析柱进行纯化，试验结果见下表3所示。表3为Capto core 700应用于不同层析柱纯化新冠病毒液的效果比较。
表3：
Figure BDA0002537594510000071
由表3实验结果可以看出：使用XK16/40、XK50/60、BPG140/500三种规格的层析柱，抗原回收率在47.9％～56.2％之间，不同规格层析柱HCP去除率在95.2％～99.5％之间，DNA去除率在96.4％～98.9％之间。试验结果表明，使用Capto core700纯化新冠病毒，在不同规模的层析试验中抗原回收率与杂质去除率相差较小，适用于不同规模的新冠病毒纯化。

Claims (14)

1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法，其包括以下步骤：
将灭活的新型冠状病毒SARS-CoV-2的Vero细胞病毒液通过滤膜初步过滤，除去细胞碎片及杂蛋白；然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液；
向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA；
将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗，然后再用洗脱液平衡2~5个柱体积，接着将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析柱中，采用洗脱液洗脱；在紫外检测波长280nm条件下，收集第一个流穿峰即为新型冠状病毒SARS-CoV-2的Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，进行初步过滤的滤膜孔径为0.45~5.0μm。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，进行超滤浓缩的滤膜的截留分子量为100~300KD。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，超滤浓缩体积为10倍以上。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，使核酸酶在浓缩液中的终浓度为50~300U/ml，室温下放置2~12h或37℃下放置0.5~4h，降解Vero细胞中残留的DNA。
6.根据权利要求5所述的纯化方法，其中，所述核酸酶包括全能核酸酶。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，将复合填料Capto Core 700装入层析柱中的柱高为20~50cm。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述碱液为1mol/L的氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述洗脱液为pH值为6.2~8.0的PBS缓冲液。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，采用洗脱液进行洗脱的洗脱流速为30~100cm/h。
11.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析柱中的上样体积为柱体积的10%~30%。
12.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述层析柱包括XK50/60层析柱、XK 16/40层析柱或BPG 140/500层析柱。
13.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液，其是采用权利要求1~12任一项所述纯化方法纯化获得的。
14.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的Vero细胞灭活疫苗，其是采用权利要求13所述新型冠状病毒SARS-CoV-2的Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液经过适当稀释后配制新型冠状病毒灭活疫苗，配制后分装，即为Vero细胞新型冠状病毒SARS-CoV-2的灭活疫苗制品。
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