CN1616654A - 一种sars病毒的灭活及纯化方法以及制备含有所述灭活病毒疫苗的方法及所述疫苗 - Google Patents
一种sars病毒的灭活及纯化方法以及制备含有所述灭活病毒疫苗的方法及所述疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1616654A CN1616654A CN 200310114341 CN200310114341A CN1616654A CN 1616654 A CN1616654 A CN 1616654A CN 200310114341 CN200310114341 CN 200310114341 CN 200310114341 A CN200310114341 A CN 200310114341A CN 1616654 A CN1616654 A CN 1616654A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- deactivation
- sars virus
- viral
- virus
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 title claims abstract description 83
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 52
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 88
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 62
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 57
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 46
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 101000674278 Homo sapiens Serine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 claims description 19
- 101000674040 Homo sapiens Serine-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 19
- 102100040516 Serine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 claims description 19
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 10
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 9
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 9
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 9
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 9
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 9
- 238000005325 percolation Methods 0.000 claims description 9
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002679 ablation Methods 0.000 claims description 7
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 4
- GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N Cobalt-60 Chemical compound [60Co] GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000010129 solution processing Methods 0.000 claims 1
- 229940124680 SARS vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940041323 measles vaccine Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种SARS病毒的灭活方法,所述灭活病毒的纯化方法,SARS灭活疫苗的制备工艺,以及含有所述灭活病毒的疫苗。
Description
发明领域
本发明涉及一种SARS病毒的灭活方法,所述灭活病毒的纯化方法,SARS灭活疫苗的制备工艺,以及含有所述灭活病毒的疫苗。
发明背景
为有效防止重症急性呼吸综合症(Severe Acute RespiratorySyndrome,以下简称为SARS)在我国乃至全世界范围的蔓延,目前迫切需要能够有效预防引起所述病症的SARS病毒疫苗。
就常用的疫苗种类而言,主要可分为采用由基因工程方法获得的特定病毒表面抗原或其片段引发免疫反应的基因工程型疫苗,如基因工程乙型肝炎病毒疫苗;采用病毒经减毒后制备的减毒型活疫苗,如麻疹减毒活疫苗;以及由活体病毒株通过有效灭活后制备的灭活型疫苗,如甲型肝炎病毒灭活疫苗。
为了在短时间内获得可用于临床的SARS病毒疫苗,本发明人利用获自临床SARS患者的SARS病毒分离株,经工业化大规模培养得到高浓度的SARS病毒液,成功探索出有效灭活所述SARS病毒的灭活方法以及所述灭活病毒的纯化方法,并由此成功研制出含有所述灭活病毒的疫苗。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种SARS病毒的灭活方法。在本发明所述的SARS病毒灭活方法中,选用福尔马林溶液或β-丙内酯作为灭活剂,能够有效实现SARS病毒灭活,尤其是大规模工业化培养的SARS病毒的灭活。与传统病毒灭活方式相比,本发明所述方法能够有效灭活SARS病毒至符合疫苗生产的水平,同时保持了所述灭活病毒的抗原性。
在本发明的一个具体实施方案中,选用与病毒样品总体积比为1∶1000-1∶4000的福尔马林溶液,37℃处理经大规模工业化培养的SARS病毒样品2.9-12.5小时,灭活SARS病毒。在本发明的又一具体实施方案中,选用与病毒样品总体积比为1∶4000-1∶8000的β-丙内酯,在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时。
在本发明中还可以在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活病毒。在本发明的一个具体实施方案中,将制备好的灭活剂(例如,以体积比1∶100稀释的福尔马林溶液)经密闭的管道系统加入盛有待灭活SARS病毒的细胞工厂内,福尔马林终浓度1∶1000-4000,混匀,在搅拌下,经37℃原位灭活2.9-12.5小时后收获。
在本发明的又一具体实施方案中,任选的,还包括对所得SARS病毒样品的超时灭活。具体的,以福尔马林为灭活剂,对收获于固定容器内的经首次灭活之SARS病毒样品,再经一定时间,优选为首次灭活时间的3倍(灭活条件同首次灭活)的超时灭活;
在本发明的又一具体实施方案中,任选的,还包括对所得SARS病毒样品的二次灭活。具体地,以β-丙内酯溶液为灭活剂,以与病毒样品总体积比为1∶6000~1∶8000的量加入经前述处理的SARS病毒样品中,灭活过夜(16-24hr)后,再加入以与病毒样品总体积比为1∶4000~1∶6000(为两次加β-丙内酯工作浓度之和)的量进行二次灭活,第二次灭活条件是在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时,室温作用2天或37℃水浴作用2小时,以将SARS病毒彻底灭活。
在本发明所述方法实施病毒灭活后,对于灭活效果验证采用常规检测方法检测,例如,可将所得病毒灭活液样品在敏感细胞(如Vero-E6或Vero细胞)上盲传3代,验证其灭活效果。
本发明的另一个方面涉及一种所述灭活SARS病毒的纯化方法。在本发明所述的SARS灭活病毒的纯化工艺中,采用例如离心、超滤、组合层析等步骤,能够有效获得高度纯化的灭活SARS病毒,用于所述灭活SARS病毒疫苗的制备。
在本发明的一个具体实施方案中,采用了包括病毒澄清、超滤浓缩和柱层析的技术方案纯化灭活病毒,所得病毒纯化液可以用于疫苗生产,同时可以用于诊断试剂中参比抗原的制备。
在本发明所述病毒纯化的方法中,可以选择至少一种上述步骤,或其任意组合,以实现最终纯化灭活病毒至可用于灭活疫苗生产以及制备SARS检测试剂中的抗原的目的。
在本发明的又一具体实施方案中,1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01MPBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;以及3)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰即为病毒精纯液。
在本发明的又一具体实施方案中,1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01MPBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;3)向步骤2)所得的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶,优选为Benzonase;消化体系中Vero细胞残留DNA;4)再次超滤;和5)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰即为病毒精纯液。
在本发明的又一具体实施方案中,1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01MPBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;3)柱层析:将病毒超滤液用Sepharosefour fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰;4)向步骤3)中收集的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶,优选为Benzonase;消化体系中Vero细胞残留DNA;和5)再次超滤,获得病毒精纯液。
在本发明中所使用的DNA酶可以为本领域已知的能够有效降解Vero细胞残留DNA的DNA酶,优选的,所述DNA裂解酶为Benzonase(默克公司)
本发明的又一方面涉及一种灭活SARS病毒疫苗,其中含有免疫有效量的灭活SARS病毒,以及药学上可接受的载体,任选的,还含有合适量的佐剂。在本发明中,所述免疫有效量是指能够在接种后有效产生免疫反应的量。本领域技术人员能够知晓如何依据疫苗接种的途径选择适当的接种量。在适于本发明所述的疫苗中,所述疫苗中灭活病毒的含量为1-1000ug/ml,优选为20-500ug/ml,特别优选为40-100ug/ml。
本发明所述疫苗中可以不使用佐剂,或者使用疫苗制备领域中常用的佐剂包括但不限于,氢氧化铝佐剂或流感病毒血凝素。
本发明还涉及一种制备灭活SARS病毒疫苗的方法。具体的,将经过上述方法纯化后所获得的病毒纯化液进一步经过如下处理:
1)将病毒精纯液用选自0.2μm滤器或辐照方法除菌,获得疫苗原液;
2)将疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升,分装为灭活疫苗。
本发明所述SARS病毒疫苗制备方法中,步骤1)中所述过滤除菌优选为采用0.2μm滤器除菌,而辐照灭菌优选的采用4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品60分钟。
本发明所述制备疫苗的方法中,步骤2)中可以采用注射用水稀释疫苗原液,还可以采用含有氢氧化铝浓度为0.7-1.2mol/L,0.01MPBS,pH6.8-7.2,的氢氧化铝稀释液稀释疫苗原液,最终将疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原(SARS抗原单位用SU表示,1SU是指能使小鼠产生64个中和抗体单位所需的抗原量)。或者采用含有流感血凝素的流感疫苗原液将SARS疫苗原液配比到含有如上所述效剂量SARS抗原,H1N1、H3N2、B型流感病毒血凝素分别大于12微克。
在本发明所述灭活SARS病毒疫苗中,可包含灭活的至少一种选自如下的冠状病毒属SARS病毒的毒株:Sino1,Sino2,Sino3,Sino4,和Sino5。所述病毒毒株分别于2003年6月27日保藏在国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国北京市海淀区中关村北一条13号),保藏号分别为0962,0963,0964,0965和0966。
本发明还涉及预防哺乳动物尤其是人免受SARS病毒感染的方法,包括给需要的个体接种免疫有效量的本发明的疫苗。优选地,接种途径包括但不限于皮下、鼻内、口服、皮内、肌内、或肠胃外途径。
附图说明
图1.选择不同福尔马林溶液浓度进行灭活对SARS病毒感染滴度的影响。
图2.选择不同β-丙内酯溶液浓度对SARS病毒感染滴度的影响。
实施例
实施例1 SARS病毒灭活
在本发明中,采用选自福尔马林溶液和β-丙内酯的灭活剂,对含有SARS病毒的样品进行灭活。
1)福尔马林溶液灭活
分别以等体积向待处理的SARS病毒样品中加入经1∶100(体积比)稀释的福尔马林溶液,在37℃下用工作浓度分别为1∶1000、1∶2000、1∶4000(体积比)稀释的福尔马林溶液处理SARS病毒液,得到SARS病毒推算灭活时间分别为2.9小时、6.0小时和12.5小时。结果详见表1灭活动力学曲线参见图1。
表1 不同浓度福尔马林溶液灭活SARS病毒时间
灭活前 推算灭活时间
福尔马林 斜率
CCID50/ml (hr)
1∶1000 6.7 -2.4 2.9
1∶2000 6.7 -1.13 6.0
1∶4000 6.7 -0.53 12.5
2)β-丙内酯溶液灭活
分别以等体积向待处理的SARS病毒样品中加入经1∶10(体积比)稀释的β-丙内酯溶液,在4℃下用工作浓度分别为1∶4000、1∶6000、1∶8000(体积比)稀释的β-丙内酯溶液处理SARS病毒液,得到SARS病毒推算灭活时间分别为2.9小时、7.2小时和11.6小时,结果见表2。在此基础上延长至少2倍时间即为首次灭活时间。灭活动力学曲线参见图2。
表2 不同浓度β-丙内酯灭活SARS病毒时间
灭活前 推算灭活时间
β-丙内酯浓度 斜率
CCID50/ml (hr)
1∶4000 7.2 -2.4 2.9
1∶6000 7.2 -1.025 7.2
1∶8000 7.2 -0.63 11.6
实施例2 在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活SARS病毒
在本发明中还可以在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活SARS病毒。
将制备好的灭活剂,即经1∶100(体积比)稀释的福尔马林溶液,等量加入盛有待灭活SARS病毒的细胞工厂(购自丹麦NUNC公司)内,混匀,在搅拌下,经37℃原位灭活2.9~12.5小时后收获。
或者当采用β-丙内酯溶液作为灭活剂时,将1∶10稀释后加入,使得β-丙内酯溶液与总样品体积比为1∶6000~1∶8000。灭活温度2~8℃16~24小时。
实施例3 SARS病毒超时灭活或二次灭活
1)对由实施例2所得采用福尔马林为灭活剂处理得到的病毒灭活液,将其在与如实施例2所述相同的灭活条件下以首次灭活时间的3倍进行超时灭活。
2)对由实施例2所得采用β-丙内酯为灭活剂处理得到的灭活病毒液,进行二次灭活。再次加入与病毒样品总体积比为1∶4000~1∶6000(为两次加β-丙内酯工作浓度之和)的量进行二次灭活,第二灭活条件是在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时,室温作用2天或37℃水浴作用2小时,以将SARS病毒彻底灭活。
实施例4 SARS病毒灭活效果验证
将如实施例2或3中所述完成病毒灭活或者病毒超时灭活(或二次灭活)的SARS病毒液,分别取样(20~100ml),采用敏感细胞连续盲传3代,进行灭活效果验证试验,用标准的细胞病变检测法(CPE)或直接、间接免疫荧光法(IF),监测病毒是否被彻底灭活,验证其灭活效果,保证疫苗生产的安全性。
实施例5 经本发明所述方法灭活的SARS病毒之抗原性
采用反向间接血凝方法检测SARS病毒灭活前后的抗原性,抗原含量无明显差异,结果如表3所示:
表3 三批SARS病毒液灭活前后抗原性检测结果
抗原含量(血凝效价)
批号
灭活前 灭活后
F30307-008 1∶224 1∶192
F30308-022 1∶160 1∶128
F30308-024 1∶160 1∶192
上述结果表明,经过本发明前述实施例1-3中所述方法处理的SARS病毒,经灭活后仍具有适于制备疫苗的抗原性。
实施例6 灭活SARS病毒的纯化
将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作,以纯化所得病毒灭活液:
1)离心澄清,即以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,得到病毒澄清液;
2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01M PBS(pH7.0~7.6),获得病毒超滤液;
3)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,收集第一穿流峰即为病毒纯化液。洗脱液0.01M PBS。
或者,将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作,以纯化所得病毒灭活液:
1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;
2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01M PBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;
3)向步骤2)所的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度10-100单位Benzonase(默克公司),1-10mM Mg2+室温处理4小时以上,消化体系中Vero细胞残留DNA和体系的RNA;消化体系中Vero细胞残留DNA;
4)再次超滤;
5)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰即为病毒精纯液。
或者,将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作,以纯化所得病毒灭活液:
1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;
2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01M PBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;
3)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰;
4)向步骤3)中收集的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度10-100单位Benzonase(默克公司),1-10mM Mg2+室温处理4小时以上,消化体系中Vero细胞残留DNA和体系的RNA;
5)再次超滤,获得病毒精纯液。
实施例7 灭活病毒疫苗的制备
将经过实施例1-3所述方法灭活的病毒灭活液依照实施例6所述方法纯化后,将所得病毒纯化液进一步经过如下处理:
1)将病毒精纯液用选自0.2μm滤器或4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品(体积不限)60分,除菌,获得疫苗原液;
2)将疫苗原液用注射用水稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原(SARS抗原单位用SU表示,1SU是指能使小鼠产生64个中和抗体单位所需的抗原量),分装为灭活疫苗;
3)任选的,采用含有佐剂氢氧化铝的铝稀释液:氢氧化铝浓度为0.7-1.2mol/L,0.01MPBS,pH6.8-7.2,将疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原(SARS抗原单位用SU表示,1SU是指能使小鼠产生64个中和抗体单位所需的抗原量),氢氧化铝含量为0.35-0.62mol/L,pH6.8-7.2,分装为灭活疫苗;
4)或者任选的,用含有流感血凝素的流感疫苗原液(总蛋白100-300微克/毫升,H1N1、H3N2、B型流感病毒血凝素分别大于12微克)稀释上述SARS疫苗原液,得到以流感血凝素为佐剂的SARS疫苗。
实施例8 SARS疫苗的安全性评价、免疫原性和有效性试验结果
将如实施例7所制备的灭活病毒疫苗,按照40~100ug/1.0ml剂量通过肌肉注射接种恒河猴或按照20~40ug/1.0ml剂量通过腹腔注射接种小鼠,进行疫苗的安全性、免疫原性和有效性试验。结果接种疫苗组与未接种疫苗组(接种吸附剂)的动物,经观察均无临床症状,其粪便、排泄物均未检测到SARS病毒,组织器官也无病理改变,动物试验结果初步验证了灭活疫苗的安全性。
疫苗接种后10、15、30天采血,采用常规EIA法检测SARS病毒IgG抗体及常规细胞中和试验法检测保护性中和抗体,其结果IgG总抗体10天均已阳转,表明该疫苗具有良好的免疫原性,结果详见表4。
用10、15、30天猴免疫血清与不同SARS毒株中和后进行细胞中和试验,结果证实其免疫血清对不同SARS毒株均有良好的中和作用,其中和抗体效价平均可达1∶16-1∶32,即疫苗的有效性得以初步证实,结果详见表5。
表4 SARS灭活疫苗免疫接种后10、15、30天IgG总抗体检测结果
猴号 | 免疫接种后抗体效价(EIA法检测) |
10天 15天 30天 | |
12345 | + + ++ + ++ + ++ + ++ + + |
表5 SARS灭活疫苗免疫接种后10、15、30天中和抗体检测结果
猴号 | 免疫后不同时间中和抗体效价(细胞中和试验) |
10天 15天 30天 | |
12345 | 1∶16 1∶16-32 1∶321∶16 1∶16 1∶16-321∶16 1∶16 1∶321∶16 1∶16 1∶321∶16 1∶16 1∶32 |
动物预试验结果基本证实该本发明所制备的灭活疫苗,不仅具有良好的安全性和免疫原性,中和试验结果进一步证实了该疫苗的有效性。
Claims (13)
1.一种SARS病毒的灭活方法,其包括如下步骤:
1)在37℃以与待处理样品总体积比为1∶1000-1∶4000的福尔马林溶液为灭活剂处理浓度为1∶128-192(血凝效价)的SARS病毒样品液,2.9-12.5小时;或者
2)在2-8℃以与待处理样品总体积比为1∶6000-1∶8000的β-丙内酯处理浓度为1∶128-192(血凝效价)的SARS病毒样品液,16-24小时;
3)任选的,还包括二次灭活或超时灭活的步骤。
2.权利要求1所述的灭活方法,其中,
1)在37℃下用与待处理样品总体积比分别为1∶1000、1∶2000、1∶4000的福尔马林溶液处理2.9小时、6.0小时和12.5小时,得到完全灭活的SARS病毒灭活液;或者
2)在2-8℃用与待处理样品总体积比分别为1∶6000、1∶8000的β-丙内酯溶液处理SARS病毒样品16-24小时SARS病毒样品。
3.权利要求1所述的灭活方法,其中所述超时灭活是指以福尔马林溶液为灭活剂时,将所得灭活SARS病毒经过首次灭活时间的3倍的超时灭活;所述二次灭活是指以β-丙内酯为灭活剂时,加入与病毒样品总体积比为1∶4000~1∶6000(为两次加β-丙内酯工作浓度之和)的量进行二次灭活,第二灭活条件是在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时,室温作用2天或37℃水浴作用2小时。
4.一种按照权利要求1所述方法制备的SARS病毒灭活液。
5.一种纯化权利要求3所述的SARS病毒灭活液以制备纯化的灭活SARS病毒的方法,其包括选自如下方案:
A)纯化方案一:
1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;
2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01M PBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;以及
3)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰即为病毒精纯液;
B)纯化方案二
1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;
2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01M PBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;
3)向步骤2)所得的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶,优选为Benzonase;消化体系中Vero细胞残留DNA;
4)再次超滤;
5)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰即为病毒精纯液;
C)纯化方案三
1)将病毒灭活液进行离心澄清,具体的以2000~4000g离心力在2-8℃离心10~35分,吸上清,即为病毒澄清液;
2)超滤浓缩:将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上,等体积透析3-7次,透析液用0.01M PBS(pH7.0~7.6)获得病毒超滤液;
3)柱层析:将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析,洗脱液0.01M PBS,收集第一穿流峰;
4)向步骤3)中收集的经纯化的病毒灭活液中加入终浓度为10-100单位的核酸酶,优选为Benzonase;消化体系中Vero细胞残留DNA;
5)再次超滤,获得病毒精纯液。
6.一种按照权利要求5方法所得的经纯化的灭活SARS病毒精纯液。
7.一种灭活SARS病毒疫苗,其中含有免疫有效量的灭活SARS病毒,以及药学上可接受的载体,任选的,还含有合适量的佐剂。
8.权利要求7所述的灭活SARS病毒疫苗,其中含有至少一种选自保藏号为CGMCC 0962,0963,0964,0965和0966的经灭活的SARS病毒。
9.权利要求8所述的灭活SARS病毒疫苗,其中所述灭活的SARS病毒按照权利要求3和5所述方法制备。
10.权利要求7所述的灭活SARS病毒疫苗,其中所述佐剂选自Al(OH)3和流感血凝素。
11.一种制备权利要求7所述灭活SARS病毒疫苗的方法,包括
1)将权利要求6所述病毒精纯液用选自过滤除菌或辐照灭菌的方法除菌,获得疫苗原液;
2)将权利要求6的疫苗原液稀释到总蛋白10-50微克/毫升或10-100SU/毫升SARS抗原,分装为灭活疫苗。
12.权利要求11所述的方法,其中步骤1)中所述过滤除菌采用0.2μm滤器,辐照灭菌采用4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品60分钟。
13.权利要求11所述的方法,其中步骤2)采用的稀释液选自:注射用水,含有氢氧化铝浓度为0.7-1.2mol/L,0.01MPBS,pH 6.8-7.2的氢氧化铝稀释液,和含有流感血凝素的流感疫苗原液,其中总蛋白100-300微克/毫升,H1N1、H3N2、B型流感病毒血凝素分别大于12微克。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310114341 CN1616654B (zh) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | 一种sars病毒的灭活及纯化方法以及制备含有所述灭活病毒疫苗的方法及所述疫苗 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310114341 CN1616654B (zh) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | 一种sars病毒的灭活及纯化方法以及制备含有所述灭活病毒疫苗的方法及所述疫苗 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1616654A true CN1616654A (zh) | 2005-05-18 |
CN1616654B CN1616654B (zh) | 2010-09-15 |
Family
ID=34760176
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200310114341 Expired - Lifetime CN1616654B (zh) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | 一种sars病毒的灭活及纯化方法以及制备含有所述灭活病毒疫苗的方法及所述疫苗 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1616654B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102133398A (zh) * | 2010-09-15 | 2011-07-27 | 武汉中博生物股份有限公司 | 应用生物反应器工业化生产动物流感疫苗的方法 |
CN111575249A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-08-25 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法 |
CN111569058A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-25 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法 |
CN112546213A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-03-26 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种制备新型冠状病毒疫苗的方法及针对其有效性的评价方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021235923A1 (en) * | 2020-05-18 | 2021-11-25 | Rse On Ecr "Research Institute For Biological Safety Problems" Of Cs Mes Rk | Method of obtaining of the inactivated vaccine for covid-19 prophylaxis |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1569228A (zh) * | 2003-07-17 | 2005-01-26 | 北京华特森基因科技有限公司 | 一种sars疫苗及其制备方法和应用 |
-
2003
- 2003-11-12 CN CN 200310114341 patent/CN1616654B/zh not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102133398A (zh) * | 2010-09-15 | 2011-07-27 | 武汉中博生物股份有限公司 | 应用生物反应器工业化生产动物流感疫苗的方法 |
CN111575249A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-08-25 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法 |
CN111575249B (zh) * | 2020-06-12 | 2021-06-18 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法 |
CN111569058A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-25 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法 |
CN112546213A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-03-26 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种制备新型冠状病毒疫苗的方法及针对其有效性的评价方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1616654B (zh) | 2010-09-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Andre | Overview of a 5-year clinical experience with a yeast-derived hepatitis B vaccine | |
EP0339667B1 (en) | Hepatitis A,B,-combined adjuvanted vaccine | |
JP5095685B2 (ja) | 日本脳炎ウイルス群感染症に対する不活化ワクチンのための増強免疫原およびその製造方法 | |
CN102154325B (zh) | 针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途 | |
CN104099301B (zh) | 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法 | |
CN1579553A (zh) | Ii型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用 | |
CN110711247A (zh) | 一种含有BCG-CpG-DNA佐剂的狂犬病疫苗组合物 | |
CN102198270B (zh) | 一种含铝佐剂乙肝疫苗的制备方法 | |
CN108117583B (zh) | 一种免疫增强剂及其应用 | |
NZ574776A (en) | Proccess for producing poliovirus in culture using a dextran microcarrier for use in an inactivated poliovirus, diptheria, pertussis and tetanus vaccine | |
CN1616654A (zh) | 一种sars病毒的灭活及纯化方法以及制备含有所述灭活病毒疫苗的方法及所述疫苗 | |
CN112717128B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用 | |
CN106075423B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗 | |
CN109432413B (zh) | 一种森林脑炎病毒灭活疫苗及其制备方法 | |
CN1057532C (zh) | 纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法 | |
CN1843507B (zh) | 一种人用腮腺炎病毒组份疫苗及其制备方法和应用 | |
CN1250284C (zh) | 甲型肝炎灭活疫苗 | |
CN1990041A (zh) | 肾综合征出血热Vero细胞双价纯化疫苗及其工业化生产方法 | |
CN102174477B (zh) | 甲型肝炎病毒株sh及其二倍体细胞适应方法 | |
CN109602899B (zh) | 一种增强病毒抗原免疫原性的皮内注射技术及其在手足口病疫苗研究中的应用 | |
CN1911444A (zh) | 伤寒、副伤寒外膜蛋白疫苗 | |
CN1443844A (zh) | 新的甲型肝炎病毒毒株,制备甲肝灭活疫苗的方法及所得疫苗 | |
CN1775287A (zh) | 一种sars流感二价联合疫苗及其制备工艺 | |
CN1305527C (zh) | 乙型肝炎治疗疫苗及其制备方法 | |
CN106039302A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20100915 |
|
CX01 | Expiry of patent term |