CN1443844A - 新的甲型肝炎病毒毒株,制备甲肝灭活疫苗的方法及所得疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的甲型肝炎病毒毒株YN5，利用其以Vero细胞制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，以及由此方法制得的疫苗。本发明还涉及甲型肝炎病毒毒株的选育方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的甲型肝炎病毒毒株，利用其制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，以及由此方法制得的疫苗。本发明尤其是涉及一种利用Vero细胞制备甲型肝炎灭活疫苗的方法及由此方法制得的疫苗。本发明还涉及甲型肝炎病毒毒株的选育方法。
背景技术
甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染人体引起的一种急性肠道传染病。甲型肝炎是现已发现的严重影响人类健康的六种病毒性肝炎之一，且感染率为最高。我国是甲型肝炎高流行区，每年都有流行或暴发。1988年春上海暴发甲肝大流行，近30万人被感染发病，造成严重的社会影响和巨大的经济损失。对于甲型肝炎迄今人们尚无有效的药物及治疗手段，接种疫苗是迄今人类控制该疾病最有效和最经济的措施。
从70年代末，国内外相继开展甲肝疫苗的研制，欧美发达国家采用研制安全性可靠的灭活疫苗技术路线，但制造成本高昂；我国于1985年将甲肝减毒活疫苗研制列入国家“七五”攻关课题，至1992年获试生产批文，并投放市场。甲肝减毒活疫苗的广泛使用，为降低我国甲肝的发病率，控制暴发流行，起到了极其重要的作用。
然而甲肝减毒活疫苗存在着明显的缺点，最为突出的是毒力返祖和次传播问题，对接种者及其密切接触者构成潜在的安全隐患；其次对免疫功能低下或缺陷者高度危险；减毒活疫苗还存在热稳定性差、运输贮存条件要求苛刻等缺点。上述缺点在灭活疫苗中不复存在，且因灭活疫苗病毒蛋白纯度高，故免疫效果好，安全性高，这也是发达国家和地区迄今只使用甲肝灭活疫苗的重要原因。此外灭活疫苗是公认制备多价疫苗、联合疫苗的重要环节，而联合疫苗是世界卫生组织(WHO)与各国卫生当局所倡导的疫苗发展方向和策略。
现有的甲肝灭活疫苗(包括减毒疫苗)的甲肝病毒株所适应的细胞基质均为人二倍体细胞或人成纤维细胞，繁殖效率不高是其共同特点，而制备灭活疫苗需要大量纯化的病毒抗原，这是甲肝灭活苗制造成本高昂的根本原因。因此仍有必要开发能大规模产业化生产、节省时间、节省人力且降低成本的制备甲型肝炎灭活疫苗的方法及疫苗。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种新的甲型肝炎病毒毒株，命名为YN5，该毒株已于2001年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V200104。本发明的甲型肝炎病毒毒株具有在Vero细胞(ATCC NO：CCL-81)上高效稳定增殖的特性，增殖效率是其它甲肝毒株在人二倍体细胞增殖的10倍以上，且动物试验已证明YN5株具有良好的免疫原性，可以用作生产灭活疫苗的毒种。
本发明的另一方面涉及一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在培养液中静止或立体吸附培养细胞基质Vero细胞，使细胞
浓度达到105-107/ml；
(b)以感染剂量(M.O.I.)为0.01-0.2将本发明的甲型肝炎病毒毒
株YN5接种到上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养14-21
天；
(c)用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液；
(d)纯化病毒制备疫苗。
本发明的再一方面涉及一种选育甲型肝炎病毒毒种的方法，其特征是包括下述步骤：
(a)从临床甲型肝炎病人粪便中分离得到病毒，经生物学特性检查
确认为甲型肝炎病毒；
(b)经如下方法进行病毒的细胞培养适应：
(b1)先在二倍体细胞上盲传适应5-6代，然后在Vero上培
养适应35-40天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在
14-21天；
(b2)直接在Vero细胞适应培养，起初培养时间为35-40
天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在14-21天；
(c)选择经步骤(b)细胞培养适应后的病毒测试后作为生产疫苗的
毒种。
相比于现有技术，本发明采用甲型肝炎病毒YN5株与YN5-Vero细胞培养系统，可进行新型高效精制甲肝灭活疫苗(Vero细胞)的生产，并且，病毒产率高，是现有二倍体细胞甲肝病毒株产率的10倍以上，为大幅度降低生产成本，制备有效、廉价的甲肝灭活疫苗提供了保障。另外，本发明的疫苗为高纯度灭活疫苗，使甲肝灭活疫苗的安全性、有效性得以保证。
具体实施方式
本发明的疫苗生产方法使得能利用Vero细胞工业化大规模生产甲型肝炎灭活疫苗，从技术根本上解决了甲型肝炎病毒抗原难于大量获取的问题。采用本发明的甲型肝炎病毒YN5毒株、Vero细胞基质及相应的方法能大量获取甲肝病毒抗原。与其他甲肝毒株、细胞基质及其工艺技术相比，本发明方法中病毒繁殖的细胞基质为Vero细胞，是世界卫生组织(WHO)准允用于制备人用生物制品的细胞基质。与二倍体细胞相比，Vero细胞具有易培养，并可满足用发酵罐(微载体技术)大规模生产等明显优势，Vero细胞现已被国内外广泛用于生产人用精制狂犬疫苗、乙脑疫苗等升级换代产品。另外，本发明的YN5毒株具有在Vero细胞上高效稳定增殖的特性，增殖效率是其它甲肝病毒毒株在人二倍体细胞增殖的10倍以上；动物试验已证明YN5株具有良好的免疫原性。
在本发明的制备甲型肝炎灭活疫苗的方法中，步骤(a)所述的细胞基质为Vero细胞，该细胞例如可购自ATCC，培养液为有血清培养液例如含10％血清的MEM培养液，培养温度为本领域技术人员所熟知，通常为36.5-37.5℃。
步骤(b)的培养液为有血清培养液例如含2％血清的MEM培养液，培养温度为本领域技术人员所熟知，通常为34.5-35.5℃，培养过程中不出现细胞病变(CPE)。
步骤(d)的纯化病毒制备疫苗可采用本领域常规的方法，例如可采用如下方法进行：首先，病毒-细胞培养悬液用超声波粉碎细胞，至细胞破碎率达95％以上。然后用氯仿抽提细胞3-5次，每次振荡20-40min，然后3000rpm离心20-40min提取上清液，去除杂蛋白。接着用10％PEG(分子量：6000)和0.4M的NaCl溶液浓缩，10000rpm离心50-70min收集沉淀。将收集的沉淀用PBS悬浮，经甘油蔗糖梯度(浓度范围：从底层开始0.5ml 80％甘油(100mM NaCl，100mM Tris pH7.4)；1.8ml30％蔗糖；1.8ml 20％蔗糖；1.8ml 10％蔗糖(含10％SDS))。37000rpm离心6hr。之后柱层析进一步去除残余DNA和杂蛋白。得到的病毒用甲醛灭活，测抗原滴度，稀释至每毫升终抗原滴度为1∶1600。每毫升加佐剂0.5-1.25mg氢氧化铝，由此制成甲型肝炎灭活疫苗。
以下以实施例更详细地描述本发明。实施例1：甲型肝炎病毒毒株YN5的选育方法
(a)从临床甲型肝炎病人粪便中分离得到病毒，经生物学特性
检查确认为甲型肝炎病毒；
(b)在二倍体细胞2BS(来源：中国药品生物制品检定所)上盲
传适应6代；
(c)然后在Vero上培养适应40天，以后逐渐减少培养时间，直
到增殖高峰在14天。
其中，每次培养期满后，用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液，置-60℃至-80℃保存备用。接种前用超声波粉碎细胞，至细胞破碎率达95％以上。以感染剂量(M.O.I.)为0.01-0.2进行接种。培养液为含有2％新生牛血清、0.20％水解乳蛋白的MEM营养液(用7％NaHCO3调pH至7.4)。
最终获得一株具有希望特性的所需甲型肝炎病毒毒株，命名为YN5，该毒株于2001年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V200104。实施例2：甲型肝炎灭活疫苗的制备
自液氮容器内取出Vero细胞安瓿(来源：中国药品生物制品检定所)，1000rpm离心10分钟，弃去原保存液，加入含有10％新生牛血清、0.20％水解乳蛋白的MEM营养液(用7％NaHCO3调pH至6.8)置37℃培养，待细胞长成单层后，用PBS洗涤，胰酶-EDTA消化，加入上述营养液，以1∶2分种率，每5天传代1次，直至获得批量生产需用的足够细胞。
将上述细胞培养于浓度达到106/ml时，在pH7.4的培养液中按0.05MOI的分种率加入实施例1获得的甲型肝炎病毒毒株YN5，静止吸附培养14天。其间换2次维持液。培养期满后，用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液。该病毒-细胞培养悬液经超声波处理而粉碎细胞，至细胞破碎率达95％以上。之后用氯仿抽提4次，每次振荡40min，然后3000rpm离心40min提取上清液，去除杂蛋白。所得上清10％PEG(分子量6000)和0.4M的NaCl溶液浓缩，10000rpm离心70min收集沉淀。将收集的沉淀用PBS悬浮，甘油蔗糖不同梯度离心(浓度范围：从底层开始0.5ml 80％甘油(100mM NaCl，100mM Tris pH7.4)；1.8ml30％蔗糖；1.8ml 20％蔗糖；1.8ml 10％蔗糖(含10％SDS)。)37000rpm离心6hr。Sepharose-4FF凝胶过柱进一步去除残余DNA和杂蛋白。将纯化后的病毒用1∶4000甲醛灭活12天，分装成品为每毫升终抗原滴度为1∶1600。每毫升加佐剂1mg氢氧化铝，制成疫苗。
本发明的相关实验数据见以下列表。证明YN5毒株具有在Vero细胞上高效稳定增殖的特性，增殖效率是其它甲肝病毒毒株在人二倍体细胞增殖的10倍以上；动物试验已证明YN5株具有良好的免疫原性。
表1.YN5株不同代次增殖情况：
抗原滴度 感染性滴度
代次 (EIA) (1gCCID50/ml)
4 1∶2 未做
6 1∶8 4.23
10 1∶128 6.5
14 1∶640 7.33
18 1∶2560 8.23
20 1∶5120 8.50
23 1∶5120 8.67
表2.YN5株23代连续3次一步生长曲线：
表3.YN5株23代连续3次增殖情况：
感染性滴度
次数 抗原滴度 (1gCCID50/ml)
1 1∶5120 8.33
2 1∶5120 ≥8.5
3 1∶5120-10240 ≥8.5
表4.YN5株甲肝毒株与其他已知毒株增殖效力比较
毒株 YN5 TZ-84 L8
细胞基质 Vero 2BS KMB17
疫苗类型 灭活苗 灭活苗 灭活苗
增殖周期 14-21天 28天 28天
抗原滴度 ＞1∶5000 1∶256-512 1∶256-512
表5.YN5株甲肝灭活疫苗小白鼠效力试验结果
剂量 阳转率 MIU
试验组 阳转数
(EU/ml) (％)
1 3200 10/10 100％ 2500
2 1600 10/10 100％ 2000
3 800 8/10 80％ 1750
4 400 3/10 30％ 1250
史克苗 1440 10/10 100％ 1750Al(OH)3对照 0 0/10 0 0
Claims (6)
1、甲型肝炎病毒毒株，命名为YN5，该毒株保藏号为CCTCC NO：V200104。
2、一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在培养液中静止或立体吸附培养细胞基质Vero细胞，使细胞
浓度达到105-107/ml；
(b)以感染剂量(M.O.I.)为0.01-0.2将权利要求1的甲型肝炎病毒
毒株YN5接种到上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养
14-21天；
(c)用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液；
(d)纯化病毒制备疫苗。
3、如权利要求2所述的方法，其中所述的培养液为含有2-10％新生牛血清、0.20-0.30％水解乳蛋白的MEM营养液，该营养液pH为6.8-7.4。
4、根据权利要求2所述的方法制得的甲型肝炎灭活疫苗。
5、一种选育甲型肝炎病毒毒种的方法，其特征是包括下述步骤：
(a)从临床甲型肝炎病人粪便中分离得到病毒，经生物学特性
检查确认为甲型肝炎病毒；
(b)经如下方法进行病毒的细胞培养适应：
(b1)先在二倍体细胞上盲传适应5-6代，然后在Vero上培
养适应35-40天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在
14-21天；
(b2)直接在Vero细胞适应培养，起初培养时间为35-40
天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在14-21天；
(c)选择经步骤(b)细胞培养适应后的病毒测试后作为生产疫苗的
毒种。
6、如权利要求5所述的方法，其中培养用培养基为含有2-10％新生牛血清、0.20-0.30％水解乳蛋白的MEM营养液，该培养液pH为6.8-7.4。
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