CN1228085C - 森林脑炎纯化疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灭活森林脑炎病毒纯化疫苗以及其制备方法，特别是工业化制备方法。该疫苗包含有效量的灭活森林脑炎病毒和疫苗佐剂。用本发明的森“张”株P9-3病毒接种细胞，收获的病毒液经纯化手段除去大部分杂蛋白，可制备本发明的灭活森林脑炎病毒纯化疫苗。本发明的灭活森林脑炎病毒纯化疫苗，适用于各森林脑炎疫区及进入疫区的人员使用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及灭活森林脑炎纯化疫苗及其制备方法，特别是工业化制备灭活森林脑炎纯化疫苗的方法。本发明还涉及一种森林脑炎病毒，森“张”株P9-3。
背景技术
森林脑炎是由森林脑炎病毒引起的，以蜱类为主要传染源，以侵犯中枢神经系统为主的自然疫源性急性传染病，病死率在20-30％，是一种严重危害人民健康的病毒性传染病。森林脑炎在我国主要分布在东北的长白山、小兴安岭和大兴安岭地区，在云南及新疆也有森林脑炎自然疫源地存在。近几年随着林区经济的发展和旅游事业的兴起，进入林区的人群逐年增加，因此，对疫区高危人群和将进入疫区工作或旅游的人们进行特异性免疫接种，是预防感染、降低发病率，有效控制森林脑炎爆发流行的根本途径。
自1944年日本陆军北野政次首次成功地分离到一种森林脑炎病毒以后，国内外科研人员开始进行森林脑炎病毒的分离和疫苗的研制工作。50年代我国开始研制多种类型的森林脑炎疫苗，用于预防森林脑炎的疫苗。早期的原代疫苗如：1952年研制的鼠脑森林脑炎灭活疫苗，由于含有能引起变态反应的成份，疫苗接种后引起的变态反应性脑脊髓炎发生率高，1954年研制的鸡胚森林脑炎灭活疫苗，接种副反应比鼠脑疫苗低，但效果不肯定。为了降低副反应，改用细胞基质为鸡胚细胞、地鼠肾细胞的组织培养方法增殖病毒，收获病毒培养液后制备疫苗。但这些疫苗的抗原含量较低，杂蛋白多，存在致敏物质，导致接种副反应严重和免疫效果较差。
国外的第一个森林脑炎疫苗是1939-1940年前苏联学者用鼠脑制备的，1961年采用细胞培养(鸡胚成纤维细胞)技术开发了森林脑炎疫苗，并用于人的免疫。1973年研制开发了一种部分纯化的鸡胚细胞灭活疫苗(以羟磷灰石为吸附剂，色层分析法)，但主要缺点是首次接种后发现有头疼、发热、身体不适等副反应，儿童尤为多见。
综上所述，目前国内外研制的森林脑炎疫苗均需要进一步的改进和提高，而且，至今国内外均未公开森林脑炎疫苗中所使用的森林脑炎病毒。
发明内容
本发明的主要目的是：
1.提供一种以适应于小白鼠脑、毒力稳定的森“张”株为毒种，可工业化制备森林脑炎纯化疫苗的方法，尤其是以金黄地鼠肾细胞作为感染病毒的细胞基质，经连续流离心，超滤浓缩和柱层析等步骤进行纯化，制备灭活森林脑炎纯化疫苗的方法。
2.提供一种新选育分离的森林脑炎病毒株。
3.提供一种抗原含量高、免疫原性好、适合于各疫区使用、安全有效的人用灭活森林脑炎纯化疫苗。
本发明的其他目的，在下面对本发明的具体描述中体现。
森“张”株为1952年6月从某患者脑组织中分离得到的森林脑炎病毒株，经小白鼠交叉保护力试验及鉴别试验证明为森林脑炎病毒。为了得到抗原性广谱，免疫原性好的森林脑炎病毒疫苗株，本申请人进行了长期而广泛的研究。用森“张”株毒种在鼠脑中传代15次后，本申请人得到了一种森林脑炎病毒株，森“张”株P9-3，属于黄病毒属披膜病毒科，Flaviviridae-Togavivirus。该病毒株已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉的武汉大学，其保藏号为CCTCC V202004，保藏日期为2002年9月9日。该病毒株的病毒感染滴度达到并稳定在9.001gLD50/ml以上，病毒生物学活性稳定，抗原性广谱和免疫原性良好，经全面检定，证明毒种内无外源因子。
根据本发明，一种灭活森林脑炎病毒纯化疫苗，包含有效量的灭活森林脑炎病毒和佐剂。该灭活森林脑炎病毒来自本发明的森“张”株P9-3，CCTCCV202004。该佐剂是常用佐剂，例如Al(OH)3。该纯化疫苗还含有病毒稳定剂。该病毒稳定剂为常用病毒稳定剂，例如人白蛋白。
本发明还涉及一种灭活森林脑炎病毒纯化疫苗的制备方法，特别是工业化生产灭活森林脑炎病毒纯化疫苗的方法。
根据本发明，一种灭活森林脑炎病毒纯化疫苗的制备方法，包括通过细胞用森林脑炎病毒制备病毒液，以及用佐剂把病毒液配制成纯化疫苗。该病毒液的制备，包括
(1)在病毒培养液中，用森林脑炎病毒，森“张”株P9-3，CCTCC V202004，感染细胞，
(2)在感染细胞中增殖和/或繁殖病毒悬液形式的病毒液，
(3)收获(2)步骤中得到的病毒液，
(4)去除该病毒液中的剩余培养物和/或杂蛋白。
本发明的制备方法还包括灭活病毒液中病毒的步骤。该灭活步骤可以在去除该病毒液中的剩余培养物和/或杂蛋白步骤之前或之后进行。
有多种细胞和组织适用于本发明的感染步骤，例如，地鼠肾细胞，鸡胚细胞，鼠脑组织，鸡胚组织，优选金黄地鼠肾细胞。如果需要，感染步骤所用的细胞可由细胞培养液培养得到，优选把细胞培养成单层细胞。所用的细胞培养液，可以是常用的细胞培养液，例如，4-8％的小牛血清乳白蛋白水解物的Earle′s液，合适浓度的199液，MEM液等等。
用森“张”株P9-3感染细胞时，所用的感染剂量相当于感染复数(M.O.I.)小于0.5，优选0.02～0.5，对于病毒增殖和繁殖获得良好的产率。细胞的病毒感染是在病毒培养液的存在下进行。所用的病毒培养液，可以是含0.1～0.2％人白蛋白、0.005～0.01％半胱氨酸的Earle′s液；0.5～2.0％小牛血清、0.005～0.01％半胱氨酸的的Earle′s液；含0.1～0.2％人白蛋白或0.5～2.0％小牛血清的199液。
根据本发明，病毒液的收集可以多次进行。在第一次收集病毒液后，通过添加病毒培养液，使细胞和病毒连续不断的增殖，以便继续收集病毒液。通过多次添加病毒培养液，可以实现病毒液的多次收集。采用本发明的病毒株和本发明的培养方法，病毒液的收集可以在8次或以上。
本发明的多次收集病毒液的方法，特别有利于工业化生产本发明的灭活森林脑炎病毒纯化疫苗。
根据本发明，制备方法中的灭活步骤使用化学试剂作为灭活剂，例如，采用甲醛作为灭活剂。因此，使用毒性株用于病毒增殖和/或繁殖时，仍可生产灭活疫苗。采用适当浓度的灭活剂，在合适的温度和时间下，使病毒失去感染力，但保持病毒的抗原性和免疫原性。例如，灭活时，甲醛的浓度为1/2000～1/6000；灭活条件在37℃，2～3天；20～25℃，7～14天；4～8℃，14～21天，均可灭活病毒，本发明优选甲醛的浓度为1/4000，灭活温度和时间为20～25℃，16～24小时；4～8℃，14天。
根据本发明，可将多次收集到的病毒液合并后一起灭活。
本发明的纯化疫苗还含有常用防腐剂例如硫柳汞。
可以采用多种方法来去除灭活后病毒液中的残余培养液和杂蛋白，以得到本发明的纯化疫苗。例如：高速区带离心法、醋酸锌沉淀法、柱层析法等。灭活前或后的病毒液可经超滤浓缩和层析来纯化。层析可以是离子交换层析，吸附层析，凝胶过滤或分子筛，在超滤浓缩前，病毒液可先经离心或澄清膜处理，以去处细胞碎片和蛋白等杂质，本发明优选连续流离心的条件8000～12000转/分，4～8℃；超滤优选100Kd的超滤膜或澄清优选0.4um澄清膜；凝胶过滤或分子筛的洗脱速度为10～200ml/分钟，温度为4～25℃。
本发明优选的工业化生产灭活森林脑炎病毒纯化疫苗的特征在于，灭活的病毒液，用连续流离心机高速离心，经超滤浓缩，再经过Sepharose 4FF柱层析，得到的病毒液用于本发明的纯化疫苗。
灭活和纯化后的病毒液，加入适当的佐剂和/或载体，可制成本发明的纯化疫苗。常用的佐剂和/或载体为，例如，Al(OH)3。还可以加入适量病毒稳定剂，常用的病毒稳定剂为，例如，人白蛋白。
本发明的灭活森林脑炎病毒纯化疫苗，可用于预防森林脑炎病毒的感染。本发明的灭活森林脑炎病毒纯化疫苗，可以采用肌肉注射的方式给药，也可以采用其他合适的方式给药。
本发明还涉及将本发明的森林脑炎病毒用于制备本发明的灭活森林脑炎病毒纯化疫苗。
附图说明
附图1是本发明优选的制备灭活森林脑炎纯化疫苗的流程示意图。
附图2为本发明森林脑炎纯化疫苗的Sepharose 4FF柱层析图谱。I峰为森林脑炎病毒峰，II峰为杂蛋白峰。
具体实施方式
下面参照附图1，对本发明的工业化生产灭活森林脑炎病毒纯化疫苗的一种优选实施方案，作进一步的描述。本文中所涉及的原材料和设备，如无特别说明，均可从市场上购得。
1.制备地鼠肾细胞
用两周龄健康的金黄地鼠，经无菌操作取出肾脏消化，剪碎后加入pH7.6～8.0浓度为0.1～0.5％的胰酶，置4-8℃18-20小时或33～37℃，0.5～1.0小时消化后，弃去胰酶液，用含6-8％的小牛血清、0.1～0.2％乳白蛋白水解物的Earle′s液为细胞生长液分散细胞，制备成细胞悬液，分装于10～15立升细胞培养瓶，1000ml-1500ml/瓶，15～25对肾/瓶。将细胞培养瓶置于37℃恒温室内旋转培养2-3日，在细胞瓶的瓶壁上可形成均匀、致密的细胞单层。
2.病毒感染、病毒液收获、灭活
方法一：选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶，弃去细胞生长液，用Earle′s液或生理盐水冲洗2-3分钟后感染，接种的毒种的终浓度为毒种的10-4-10-6倍，感染复数为0.02～0.5，毒种稀释液为含0.1～0.5％人白蛋白、0.005～0.01％半胱氨酸的Earle′s液，将感染病毒后的细胞瓶置32-34℃恒温室内旋转培养16-20小时，弃去病毒液，加入含0.1～0.2％人白蛋白、0.005～0.01％半胱氨酸的Earle′s液，继续置32-34℃恒温室内旋转培养至60-72小时，视细胞病变情况收获病毒液，抽样作无菌试验和病毒滴定，将收获的病毒液加入1/2000～1/6000福尔马林液(灭活剂)和1/20000硫柳汞，置37℃，16～24小时后再于4-8℃灭活14日；或于4-8℃灭活21日
方法二：选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶用Earle′s液冲洗后感染，接种的毒种的终浓度为毒种的10-4-10-6倍，感染复数为0.02～0.5，毒种稀释液为含0.5～1.5％小牛血清、0.1～0.5％乳白蛋白水解物的Earle′s液，将已感染病毒的细胞瓶置32-34℃恒温室内旋转培养60-72小时，视细胞病变情况收获病毒液，收获的同时再加入含0.5～1.5％小牛血清、0.005～0.01％半胱氨酸的Earle′s液，置32-34℃恒温室内旋转培养24-48小时，视病变情况再次收获病毒液，如此连续收获病毒培养液，直至细胞脱落为止，各次收获液均抽样作无菌试验和病毒滴定，并按方法一的方法灭活。灭活后得到的病毒液即为疫苗的半成品(疫苗原液)。
3.疫苗原液的离心合并
将疫苗的半成品经无菌试验、灭活试验检定合格后，经连续流离心或澄清膜除去细胞碎片等杂质后合并于不锈钢密闭桶内待纯化。
4.疫苗的纯化
此方法适合于森林脑炎纯化疫苗的纯化。将经连续流离心已除去细胞碎片等杂质的疫苗半成品。用截留分子量100kd的超滤膜超滤浓缩，并用pH7.4～7.7、0.01MPBS缓冲液平衡，浓缩50-100倍，收集浓缩液。然后选择Sepharose 4FF介质，用pH7.4～7.7、0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析，用紫外监测仪(A280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰(I)为森林脑炎病毒抗原(参见附图2)，第二峰(II)为杂蛋白峰。抽样检测蛋白或抗原含量，根据蛋白或抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1-0.2％人白蛋白和0.45-0.55mg/ml的AL(OH)3佐剂。然后作无菌试验、热原试验，检定合格后进行分装，即为成品。成品检定包括：外观检查、无菌试验、效力试验、毒性试验、甲醛含量测定、硫柳汞含量测定、AL(OH)3含量测定、pH值测定等。
1.本发明森林脑炎纯化疫苗致敏性试验
三批纯化疫苗致敏性试验均合格，且阴、阳性对照均成立。阴性对照组：6只豚鼠攻击后无任何症状；阳性对照组6只豚鼠攻击后均出现过敏症状，有烦躁、咳嗽、抓鼻，继而出现四肢发软、侧卧、行动迟缓，攻击后30分钟后，死亡一只，另5只症状减轻；三批纯化疫苗，各批的6只豚鼠攻击后均无任何症状，3天内均健存。结果见表1。
表1本发明森林脑炎纯化疫苗过敏性试验结果
| 疫苗批号 | 豚鼠只数 | |||||
| 总数 | 0-I级 | II级 | III级 | IV级 | 3天后健存 | |
| 阴性对照阳性对照200107012001070220010703 | 66666 | 6-666 | -1--- | -3--- | -2--- | 65666 |
2.本发明森林脑炎纯化疫苗效力及热稳定性
每批疫苗，按0、7天程序，于腹腔免疫2次，免疫剂量为每只每次0.3ml，至14天用森“张”株P9-3病毒悬液腹腔攻击0.3ml/只，21天判定结果，疫苗免疫保护力指数均大于1.0×105的标准，且比现行标准高出10倍以上。疫苗于37℃放置1周、2周，效力试验检测结果很好，保护力指数仍大于1.0×105的标准，表明疫苗稳定性良好，结果见表2。
表2本发明森林脑炎纯化疫苗稳定性试验结果(攻击毒为森“张”株P9-3)
| 疫 苗 | 放置条件 | 对照组(LD50/ml) | 试验组(LD50/ml) | 保护力指数 |
| 200107012001070220010703 | 4℃原测37℃1周37℃2周4℃原测37℃1周37℃2周4℃原测37℃1周37℃2周 | 10-8.4010-8.4010-8.4010-8.4010-8.4010-8.4010-8.4010-8.4010-8.40 | 10-2.0010-2.4610-3.0010-1.8810-2.3110-2.8010-2.0010-2.3710-2.65 | 2.51×1068.71×1052.51×1053.31×1061.23×1063.98×1052.51×1061.07×1065.62×105 |
3.本发明森林脑炎纯化疫苗综合检定结果
表3本发明森林脑炎纯化疫苗检定结果
| 项目/批号 | 质量标准 | 20010701 | 20010702 | 20010703 |
| 病毒灭活试验蛋白质含量(Lowry’s热原质试验致敏性试验牛血清残留量异常毒性试验效力试验热稳定试验物理检查化学检定氢氧化铝(mg/ml)甲醛％(g/ml)硫柳汞％(g/ml)酸碱度(PH值) | 小白鼠应健存) ≤120(ug/ml)3只家兔升温均低于0.60℃总和豚鼠应无过敏症状且3天内健存≤50(ng/ml)小白鼠、豚鼠应健存且体重增加5.0×1055.0×105乳白色混悬液体无异物≤0.70≤0.01≤0.017.2-8.0 | 合格52合格合格＜10合格2.51×1068.71×105合格0.65＜0.01＜0.017.48 | 合格50合格合格＜10合格3.31×1061.23×106合格0.60＜0.01＜0.017.49 | 合格54合格合格＜10合格2.51×1061.07×106合格0.60＜0.01＜0.017.45 |
本发明制备的灭活森林脑炎纯化疫苗，可以解决现有疫苗抗原含量低、杂蛋白多、注射剂量大、接种后副反应重和人体免疫效果差、血清阳转率低等缺点，该疫苗适合于各森林脑炎疫区使用。
下面通过实施例，对本发明的内容作更进一步的描述。
实施例1
取两周龄健康的金黄地鼠，用水处死后用0.3～0.5％新洁尔灭消毒5-6次，无菌操作取肾脏，剪碎、洗净血液后加入pH 7.6～8.0的0.1～0.5％的胰酶，置4-8℃冷消化18-20小时，弃去胰酶液，用Earle′s液洗涤，轻摇分散细胞5-6次，收集各次细胞悬液，经两层纱布过滤，使之悬于含有6-8％的小牛血清、0.2％乳白蛋白水解物的Earle′s液的细胞生长液内，制备成细胞悬液，摇均后分装于10立升培养瓶，1000ml-1500ml/瓶。将细胞培养瓶置于37℃恒温室旋转培养3日，细胞长成均匀、致密的单层。
选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶，弃去细胞生长液，用Earle′s液冲洗2-3分钟后感染，将毒种用含0.1～0.2％人白蛋白、0.005～0.01％半胱氨酸Earle′s液稀释105倍，加入待感染的细胞瓶内，2000-2500ml/瓶，置32-34℃恒温室内旋转培养18小时，弃去病毒液，加入含0.1～0.2％人白蛋白、0.005～0.01％半胱氨酸的Earle′s液，继续置32-34℃恒温室内旋转培养至68小时，收获病毒液，抽样作无菌试验和病毒滴定，将收获的病毒液加入1/4000福尔马林液(灭活剂)及1/20000硫柳汞，置37℃，16～24小时后再于4-8℃灭活14日；或于4-8℃灭活21日，灭活后得到的病毒液即为疫苗的半成品。疫苗半成品经无菌试验、灭活试验检定合格后，经连续流离心或澄清膜处理除去细胞碎片等杂质后合并于100立升不锈钢密闭桶内，然后用截留分子量100kd的超滤膜超滤浓缩，并用pH7.4～7.7、0.01MPBS缓冲液平衡，浓缩100倍，收集浓缩液。然后用Sepharose 4FF介质，经pH7.4～7.7、0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析，用紫外监测仪(A280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，抽样检测抗原含量，稀释后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1～0.2％人白蛋白和0.45～0.55mg/ml AL(OH)3佐剂。然后作无菌试验、热原试验，检定合格后分装，即为本发明的纯化疫苗成品。成品检定包括：外观检查、无菌试验、效力试验、毒性试验、甲醛含量测定、硫柳汞含量测定、AL(OH)3含量测定、pH值测定等。
实施例2
取两周龄健康的金黄地鼠，用水处死后用0.3～0.5％新洁尔灭消毒5-6次，无菌操作取肾脏，剪碎、洗净血液后加入pH 7.6～8.0的0.1～0.5％的胰酶，置4-8℃冷消化18-20小时，弃去胰酶液，用Earle′s液洗涤，轻摇分散细胞5-6次，收集各次细胞悬液，经两层纱布过滤，使之悬于含有6-8％的小牛血清、0.2％乳白蛋白水解物的Earle′s液的细胞生长液内，制备成细胞悬液，摇均后分装于10立升细胞培养瓶，1000ml-1500ml/瓶。18对肾/瓶，将细胞培养瓶置于37℃恒温室旋转培养3日，细胞长成均匀、致密的单层。
选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶，用Earle′s液冲洗后感染，毒种用含0.5～2.0％小牛血清、0.005～0.01％半胱氨酸的Earle′s液稀释105倍，加入待感染的细胞瓶内，2000-3000ml/瓶，将感染病毒后的细胞瓶置32-34℃恒温室内旋转培养68～72小时，收获病毒液，收获的同时再加入含0.5～2.0％小牛血清、0.005～0.01％半胱氨酸的Earle′s液，2000～3000ml/瓶，置32-34℃恒温室内旋转培养24-48小时，再次收获病毒液，如此连续收获病毒培养液，各次收获的病毒液均抽样作无菌试验和病毒滴定，并按方法一的方法灭活。灭活后的病毒液即为疫苗半成品。
疫苗半成品经无菌试验、灭活试验检定合格后，经连续流离心除去细胞碎片等杂质后合并于100立升不锈钢密闭桶内，然后用截留分子量100kd的超滤膜超滤浓缩，并用pH7.4～7.7、0.01MPBS平衡浓缩液，浓缩40～100倍，收集浓缩液。然后用Sepharose 4FF介质，经pH7.4～7.7、0.01MPBS平衡后，进行柱层析，用紫外监测仪(A280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，抽样检测蛋白或抗原含量，稀释后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1～0.2％的人白蛋白和0.45～0.55mg/ml的AL(OH)3佐剂。然后作无菌试验、热原试验，检定合格后进行分装，即为本发明的纯化疫苗成品。成品检定包括：外观检查、无菌试验、效力试验、毒性试验、甲醛含量测定、硫柳汞含量测定、AL(OH)3含量测定、pH值测定等。
Claims (13)
1.一种灭活森林脑炎纯化疫苗，包含有效量的灭活森林脑炎病毒和疫苗佐剂，其中该灭活森林脑炎病毒来自森“张”株P9-3，CCTCC V202004。
2.权利要求1的灭活森林脑炎纯化疫苗，其中的佐剂为Al(OH)3。
3.权利要求1的灭活森林脑炎纯化疫苗，其中还含有病毒稳定剂。
4.权利要求3的灭活森林脑炎纯化疫苗，其中的病毒稳定剂为人血清白蛋白。
5.一种分离的森林脑炎病毒株，森“张”株P9-3，CCTCC V202004。
6.一种灭活森林脑炎纯化疫苗的制备方法，包含下列步骤：
(1)在病毒培养液中，用森林脑炎病毒，森“张”株P9-3，CCTCC V202004，感染细胞，
(2)在感染细胞中增殖和/或繁殖以病毒悬液形式的病毒液，
(3)收获(2)步骤中得到的病毒液，
(4)去除该病毒液中的剩余培养物和/或杂蛋白，
(5)在(4)步骤之前或之后灭活得到的病毒液，
(6)将(5)步骤中得到的病毒液用佐剂配制成纯化疫苗。
7.权利要求6的方法，其中所述细胞为金黄地鼠肾单层细胞。
8.权利要求6的方法，其中感染细胞时的病毒接种剂量，相当于感染复数M.O.I.小于0.5。
9.权利要求6的方法，其中所述(3)步骤收获病毒液后，添加培养液并重复(2)和(3)步骤，可进行多次收获病毒液。
10.权利要求9的方法，其中将收集的各次病毒液合并后再用化学试剂进行灭活。
11.权利要求6的方法，其中所述(4)步骤是通过超滤浓缩和/或柱层析进行。
12.权利要求11的方法，其中的柱层析为Sepharose 4FF柱层析。
13.权利要求11的方法，其中进行所述超滤浓缩前，对收获的病毒液进行连续流离心分离和/或澄清膜过滤收集病毒液，以去除细胞碎片和杂蛋白。
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2002
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