CN1297313C - 减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法 - Google Patents
减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法,它将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清,超滤浓缩,柱层析纯化及灭活等后处理工艺,将病毒液制备成纯度高、免疫原性及安全好、质量稳定的合格疫苗半成品,从而满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需要。本发明可大规模处理大量的病毒液,且生产工艺稳定,重复性好;用本发明生产的疫苗半成品,无外原因子污染,细胞DNA残留量少,灭活后的半成品经检查无活病毒存在,安全可靠,半成品抗原含量高,能够满足成品生产的需要;用本发明生产的疫苗半成品制备成Sabin IPV成品疫苗,其质量稳定,安全性及免疫原性良好,经检定全部符合国家生物制品规程的要求。
Description
技术领域
本发明涉及减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的后处理方法,属于医学生物
技术领域。
背景技术
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒I、II、III型引起的传播广泛且危害极大的急性传染病。临床症状引起肌肉特别是肢体松弛性麻痹,多发生于小儿,因此又称为“小儿麻痹症”。在疫苗问世前,该病在全世界范围内流行,当时我国的发病率为3.18/10万。50年代中后期,美国的两位科学家Dr.Salk和Dr.Sabin先后成功研制出脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV),从而为人类预防和消灭脊髓灰质炎提供了有力武器。实践证明这两种疫苗都是安全有效的。我国从1960年开始生产OPV供全国儿童服用。到目前为止总计供应了40多亿人份的三价OPV,取得了辉煌的成绩。然而,早期制造的IPV由于受到生产工艺的限制,抗原含量低,免疫效果不理想,尤其是随着全世界消灭脊髓灰质炎进程的推进,与OPV相关的病例(VAPP)和由疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(VDPV)而引起的病例正受到人们的关注,如2000年在多美尼加和海地,2001年在菲律宾以及2002年在马达加斯加发生的疫苗衍生株引起的麻痺病例,此外疫苗病毒毒株在免疫缺陷的人体内可长期存在,。为此,一些发达国家开始改变疫苗使用方案,采取先用IPV再用OPV的方案,进而过渡到仅使用IPV的方案,因为只有使用IPV才能避免疫苗相关病例的发生。但采用常规的方法,既不能满足大规模生产的需要,也不能处理大规模生产的病毒液,因此,有必要对现有技术加以改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能处理大规模生产的病毒液,制备出高质量的疫苗,满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗生产需要的方法。
本发明通过下列技术方案实现:一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法,其特征在于采用下列工艺步骤:
1、澄清:将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清,去除病毒液中的细胞碎片及杂质,并保持病毒液的无菌状态;
2、浓缩:将澄清过的病毒液,用10万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩200~400倍。
3、纯化:
a、凝胶过滤:浓缩的病毒液用层析柱纯化,即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱,缓冲液pH7.0-7.2,紫外吸收波长280测吸收值,收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液;
B、离子交换:凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化,即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱,缓冲液pH7.0-7.2,紫外吸收波长280测吸收值,收集第一峰即为纯化的病毒液;
4、除菌过滤:纯化的病毒液用0.22μm的滤膜除菌过滤,之后加入10倍浓缩M199,使病毒液中含有原倍的M199;
5、灭活:在过滤的病毒液中,按终浓度为1/4000加入福尔马林灭活剂,在35-37℃温度下灭活12-14天,每天取样观察,灭活至第6天时,将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌瓶中,继续灭活至12-14天,转入4℃保存,即为单价半成品。
病毒液在经过步骤3的纯化后,去除了细胞DNA及杂蛋白,使纯度达到要求。
本发明具有以下优点:
1、可大规模处理大量的病毒液,能够满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需求,且生产工艺稳定,重复性好(结果见表1、表2)。
2、用本发明生产的疫苗半成品,无外原因子污染,细胞DNA残留量少,灭活后的半成品经检查无活病毒存在,安全性好,半成品抗原含量高,能够满足成品生产的需要(结果见表3)。
3、用本发明生产的疫苗半成品制备的Sabin IPV成品疫苗,质量稳定可靠,安全性及免疫原性良好,经检定全部符合国家生物制品规程的要求(结果见表4)。
4、用本发明生产病毒液制备的疫苗,经25℃和37℃放置两周,以及4℃长期存放后,检测疫苗热稳定性,结果表明该疫苗稳定性良好,其有效期可达两年以上(结果见表5及表6)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
1、澄清:将550升发酵罐培养的病毒液350升,经孔径为0.75μm、0.45μm、0.22μm的三级滤柱过滤澄清,去除病毒液中的细胞碎片及杂质,并保持病毒液的无菌状态;
2、浓缩:将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中,用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升;
3、纯化:
A、凝胶过滤:在Phamacia Index70层析柱中,装Sepharose CL-6B层析填料,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平,取病毒浓缩液,加入层析柱中,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱,紫外吸收波长280测吸收值,收集第一峰(病毒峰)约600毫升;
B、离子交换:在Phamacia Index100层析柱中,装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平,将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱,紫外吸收波长280测吸收值,收集出现的洗脱峰约800毫升,即为纯化的病毒液,层析柱用1mol/L NaCl洗脱,之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用;
4、除菌过滤:先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗,滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中,再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中,之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜,并将滤液同样收集到上述瓶中;
5、灭活:在过滤的病毒液900毫升中,加入10%福尔马林2.25毫升,使福尔马林终浓度为1/4000,放入37℃孵箱中灭活,每天取样观察,灭活至第6天时,将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌已硅化1000毫升瓶中,继续灭活至12天,转入4℃保存,即为单价半成品。
实施例2
1、澄清:将550升发酵罐培养的病毒液350升,经孔径为1.0μm、0.6μm、0.45μm的三级滤柱过滤澄清,去除病毒液中的细胞碎片及杂质,并保持病毒液的无菌状态;
2、浓缩:将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中,用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升;
3、纯化:
A、凝胶过滤:在Phamacia Index70层析柱中,装Sepharose CL-6B层析填料,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平,取病毒浓缩液,加入层析柱中,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱,紫外吸收波长280测吸收值,收集第一峰(病毒峰)约600毫升;
B、离子交换:在Phamacia Index100层析柱中,装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平,将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中,用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱,紫外吸收波长280测吸收值,收集出现的洗脱峰约800毫升,即为纯化的病毒液,层析柱用1mol/L NaCl洗脱,之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用;
4、除菌过滤:先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗,滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中,再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中,之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜,并将滤液同样收集到上述瓶中;
5、灭活:在过滤的病毒液900毫升中,加入10%福尔马林2.25毫升,使福尔马林终浓度为1/4000,放入35℃孵箱中灭活,每天取样观察,灭活至第6天时,将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌已硅化1000毫升瓶中,继续灭活至14天,转入4℃保存,即为单价半成品。
用与实施例1相同的方法进行了九批生产规模的后处理,结果见表5和表6。
表1.九批生产规模澄清及浓缩结果
批号 | 0.1病毒收获液 | 1.1澄清 | 2.1浓缩 | |||
体积 | 滴度(logCCID50 | 体积 | 滴度(logCCID50 | 体积(L) | 滴度(logCCID5 | |
SISISISISISISISISI | 350300380353352352358356332 | 8.4007.8508.3808.0007.7508.6207.6257.8707.875 | 360340410404393399409411375 | 8.2507.8008.1307.8758.6258.3707.5008.1207.750 | 1.601.650.901.402.101.151.401.401.75 | 10.4009.85010.59010.00010.38010.8709.50010.1209.875 |
表2.九批生产规模纯化及除菌过滤结果
批号 | 3.1凝胶过滤 | 4.1离子交换 | 5.1除菌过滤 | |||
体积 | 滴度(logCCID50 | 体积 | 滴度(logCCID50 | 体积(L) | 滴度(logCCID5 | |
SISISISISISISISISI | 0.620.610.620.620.620.650.620.630.62 | 9.2509.6259.6258.3758.2508.2509.5009.2509.000 | 0.820.830.830.820.820.810.830.850.82 | 9.2509.6259.5008.2508.2508.2509.1258.8758.500 | 0.900.900.900.900.900.900.900.900.90 | 9.1259.5009.5008.2508.0008.1259.1258.5008.125 |
表3.六批疫苗半成品检定结果
项目 | SI0110 | SI0210 | SI0220 | SI0220 | SI0130 | SI02300 |
对照细胞培 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
对照细胞血 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
不同细胞传 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
鉴别试验 | I型 | I型 | II型 | II型 | III型 | III型 |
无菌试验 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
DNA残留量 | <100 | <100 | <100 | <100 | <100 | <100 |
灭活效果试 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
D抗原含量 | 1400 | 1200 | 160 | 160 | 600 | 700 |
表4.两批Sabin IPV成品检定结果
项目 | SI 20021101 | SI 20021201 |
外观无菌试验鉴别试验DAg含量大白鼠效力试验异常毒性试验蛋白质含量牛血清蛋白残留量pH | 橙红色透明液体阴性Polio I+II+IIII:30 II:32 III:45通过通过<10μg/剂量<50ng/剂量7.13 | 橙红色透明液体阴性Polio I+II+IIII:30 II:32通过通过<10μg/剂量<50ng/剂量7.13 |
表5减毒株IPV 25℃和37℃和热稳定性试验结果
(D抗原回收率%*)
批号 | 型别 | 25℃3周 | 37℃1周 | 37℃2周 |
SI001001SI002001SI003001 | IIIIII | 95100100 | 9010095 | 7510086 |
SI001002SI002001SI003002 | IIIIII | 8510093 | 8010093 | 5310071 |
*4℃DAg含量作为100%
表6减毒株IPV4℃稳定性试验结果
型别 | DAgU/剂量 | 大白鼠效力试验(ED50) | ||||
0月 | 12月 | 18月 | 24月 | 0月 | 18月 | |
IIIIII | 201630 | 201630 | 181630 | 181628 | 2.191.491.82 | 2.081.121.67 |
Claims (1)
1、一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法,其特征在于采用下列工艺步骤:
1)、澄清:将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清,去除病毒液中的细胞碎片及杂质,并保持病毒液的无菌状态;
2)、浓缩:将澄清过的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中,用10万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩200~400倍
3)、纯化:
凝胶过滤:在Phamacia Index70层析柱中,装Sepharose CL-6B层析填料,浓缩的病毒液用层析柱纯化,即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱,缓冲液pH7.0-7.2,紫外吸收波长280测吸收值,收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液;
离子交换:在Phamacia Index100层析柱中,装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料,凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化,即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱,缓冲液pH7.0-7.2,紫外吸收波长280测吸收值,收集第一峰即为纯化的病毒液;
4)、除菌过滤:纯化的病毒液用0.22μm的滤膜除菌过滤,之后加入10倍浓缩M199,使病毒液中含有原倍的M199;
5)、灭活:在过滤的病毒液中,按终浓度为1/4000加入福尔马林灭活剂,在35-37℃温度下灭活12-14天,每天取样观察,灭活至第6天时,将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌瓶中,继续灭活至12-14天,转入4℃保存,即为单价半成品。
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