CN1112934C - 流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗 - Google Patents

Abstract

一种流行性出血热多价纯化疫苗，其中该疫苗用下述方法制备而成：将不同血清型的流行性出血热病毒株分别接种于Vero细胞，培养后多次收液，合并即为原液，离心，超滤浓缩，纯化，灭活，稀释除菌，加入佐剂配制成多价纯化疫苗。

Description

流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗

技术领域：

本发明涉及一种流行性出血热多价纯化疫苗，具体地说本发明涉及用Vero细胞生产灭活的流行性出血热多价纯化疫苗。

背景技术：

流行性出血热(国际上统称肾综合征出血热)是危害我国人民最严重的自然疫源性传染病，由某些汉坦病毒(Hantavirus)引起，我国主要是汉滩病毒(Hantaan Virus，即上述的野鼠型或I型)和汉城病毒(Seoul Virus，即上述的家鼠型或II型)，安全有效的疫苗是减少发病率、控制爆发流行的关键之举。虽然我国已有三种动物原代细胞和乳鼠脑纯化灭活疫苗，并取得良好的近期防病效果，但是由于要建立大量正常的动物种群，不仅费时费力，质量也难以保证，而且由于原有疫苗每剂量的抗原含量有限，全程免疫后的抗体反应水平及阳转率偏低，长期的防病效果有待考验。因此，人们希望得到新的更安全、更有效的高质量疫苗，以满足日益增长的防病需要。

发明内容：

本发明涉及一种流行性出血热多价纯化疫苗，具体地说，本发明涉及用Vero细胞作为基质制备而成的流行性出血热多价纯化疫苗。该疫苗用下述方法制备：

将不同血清型的流行性出血热病毒株分别接种于Vero细胞，培养后多次收液，合并即为原液，原液经10000转/分连续流离心，PELLICON300K超滤浓缩，Sepharose 4 FF(BPG柱)纯化，β-丙内酯灭活，再经稀释除菌，加入佐剂，配制成多价纯化疫苗。其中所述的不同血清型的流行性出血热病毒株为野鼠型(I型)和家鼠型(II型)毒株。上述野鼠型(I型)毒株包括A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5、C4等，上述家鼠型(II型)毒株包括L99、R22等，这些毒株都经过Vero传代细胞长期传代适应，其滴度均达7.0Log/ml以上。

附图说明：

图1显示流行性出血热病毒流行株L99、R22、A9、P8-6、FT-14、84-Fli、H5、C4在Vero细胞上的传代适应(图中滴度为IFAT测定结果)，传代适应条件：1、原始滴度；2、在Vero细胞连传三代；3、用终末稀释法连续传5代，可以较好的提高病毒滴度；4、回传乳鼠，即腹腔接种，收取乳鼠脑，鼠脑悬液病毒滴度可达8.0LogTCID₅₀/ml；5、再在Vero细胞上适应传代。

图2显示的是用RT-PCR方法确定下列毒株的基因型的结果：L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84-Fli、H5及C4毒株。

图3为疫苗制备流程图。

图4显示纯化病毒样品中的病毒颗粒形态(负染色，30000×)。

图5显示纯化病毒样品的SDS-PAGE电泳结果，1、纯化样品84Fli；2、纯化样品L99；3、蛋白Marker，由上至下分子量依次为97.4KD、66.2KD、42.7KD、31.0KD、14.4KD。

具体实施方式：

1.毒株的选育及在Vero细胞上的传代适应：

出血热病毒有多种血清型，并且各血清型间毒力有着明显的差异。通过在Vero细胞(美国ATCC引进，中国药品生物制品检定所提供，生产疫苗时代次不超过150代)上利用终末稀释或空斑筛选以及在乳小白鼠中交替传代的方法，可以获得繁殖力强(即病毒滴度高)，抗原性和免疫原性好的疫苗候选株。我们用地鼠肾细胞传代12次的疫苗株病毒L99，再经Vero细胞连续3代，终末稀释5代，再经乳鼠脑3代及Vero细胞2代的病毒作为疫苗种子病毒，再连续2～4代作为II型疫苗生产用毒种。另外用84Fli毒株Vero细胞传代连续3代，终末稀释5代，再在乳鼠脑3代及Vero细胞2代作为疫苗种子病毒，再连续2～4代作为I型疫苗生产用毒种。种子病毒的滴度始终保持在10⁷TCID₅₀/ml以上。其他毒株包括R22、A9、PS-6、FT-14、H5和C4等采用上述类似的方法，均可达到上述目的。图1显示了我国流行性出血热病毒流行株L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84-Fli、H5、C4于下述5种传代适应条件下在Vero细胞上的传代适应后的滴度(图中滴度为IFAT测定结果)。传代适应条件：1、原始滴度；2、在Vero细胞连传三代；3、用终末稀释法连续传5代，可以较好的提高病毒滴度；4、回传乳鼠，即腹腔接种，收取乳鼠脑，鼠脑悬液滴度可达8.0LogTCID₅₀/ml；5、再在Vero细胞上适应传代，病毒滴度一般均达7.0LogTCID₅₀/ml以上，再传至4～6代，可用于疫苗的试制。

为了保证使用毒株的正确性，进一步用特异引物作RT-PCR扩增分型(说明书附图2.在Vero细胞上传代适应的L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84-Fli、H5及C4毒株，用型特异性引物进行RT-PCR，以进一步确定它们的基因型)。图2中电泳结果显示L99和R22株为II型，而A9、PS-6、FT-14、84-Fli、H5及C4毒株为I型。用上述毒株感染的Vero细胞提取全RNA，先用共用引物合成cDNA第一链，再用I和II型分型引物进行扩增。共用引物为：P1 CCGGATCCTAGTAGTAGACACCGC(+)；I型引物为：P8 GATGAAAAGCTGTTTGAT(+)，P3 TGTTAACCGGAATCG(-)；II型引物为：P8 GATGAAAAGCTGTTTGAT(+)，P4GCCCTGAAACTGG(-)。

2.原液生产、疫苗配制及效果测试：

以中国药品生物制品检定所引入早代Vero细胞种(130代左右)，每3～4天传一代，至第135代建立生产用种子细胞库，传至140～145代可以获得足够量的细胞用于生产。

将不同血清型的出血热毒株接种于Vero细胞，培养后多次收液，将收获的不同血清型毒株的细胞培养上清液分别进行合并，即为原液。对制得的疫苗原液进行毒力测试。结果为所述疫苗原液的毒力达到6.5～7.0LogTCID₅₀/ml；并且感染细胞的外源因子测定为阴性。

对制得的病毒原液进行离心、浓缩和纯化，用β-丙内酯灭活，然后加入佐剂配制成本发明所述的疫苗。

然后对该疫苗的保护效果进行测试。将该疫苗接种大白兔，28天后，测试大白兔体内中和抗体的滴度，其中75％的兔子的中和抗体滴度≥1：20。

3.通过上述疫苗的试制，形成一套易行而又稳定的生产工艺流程：

经全面检定合格的Vero细胞悬液分别接种经严格检定的I、II型生产用毒种，分装至转瓶中培养，2～3天成片后，用Hanks液喷淋，加含0.2％人白蛋白的199维持液，而后每3～4天收获一次，经无菌试验和毒力测定合格后合并。合并的原液10000r/m连续流离心，超滤浓缩，硫酸鱼精蛋白沉淀，7000r/m 30分钟离心，吸去上清，柱层析(BPG)纯化，灭活，半成品检定合格，稀释除菌，加入白蛋白、硫柳汞及Al(OH)₃，分装后进行成品全面检定[说明书附图3流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗生产工艺流程。(所谓多价，即包括不同型的流行性出血热病毒，至少含有I和II型病毒两种)]

4.上述生产工艺流程图(即生产过程)中，我们作了如下改进：

(1)病毒生产I、II型种子病毒分别与细胞混种的方法，缩短了生产周期及污染率；

(2)一定间隔的充分的喷淋，以尽可能去除残余牛血清；

(3)增加了疫苗原液连续流离心，去除更多的细胞杂质；

(4)纯化时，改变了洗脱液的pH值，提高了Al(OH)₃对病毒抗原的吸附度，有可能提高其免疫原性；

(5)病毒样品纯化后再进行β-丙内酯灭活，可减少污染及可能的抗原损失；

(6)单价疫苗单独进行浓缩和纯化，然后按抗原量稀释，配制成单价苗，而后适量合并成多价纯化疫苗，这样有更多调配抗原含量的余地。

以下的优先实施例对本发明作补充说明，但不意味着限制本发明的内容，在这些实施例中，为说明本发明，我们采用了自己分离的并在地鼠肾细胞生产的L99疫苗株，及第四军医大学唐都医院分离由我们在Vero细胞和乳小白鼠适应的84Fli毒株，分别在Vero细胞(从检定所引进)制备出原液苗，再经市售Millipore PELLICON 300K M.W.超滤浓缩器及Amersham Pharmacia Biotech公司Sepharose 4 FF介质组装的BPG柱，作为原液疫苗浓缩及纯化的重要手段，对于纯品疫苗的质量控制除常规检测外，还进行一些特殊的检测。

实施例1.选育繁殖力强，抗原谱广，免疫原性及抗原性强的病毒株

(1)选择了实验室收集和分离的多个病毒株或疫苗候选株，包括L99，R22，A9，FT-14，PS-6，H5，84Fli，C4等，在Vero细胞传代适应；(2)在Vero细胞采用终末稀释的方法传代；然后(3)回至乳小白鼠腹腔接种，收取乳鼠脑中病毒传代；最后(4)Vero细胞继续传代，达到相对较高的病毒滴度(如图1.)，同时对病毒的基因型(用RT-PCR技术)进行进一步确证(如图2.)。

实施例2.疫苗原液的制备

将液氮冻存的134代Vero细胞复苏和传代培养，至138代获得足够生产用量的细胞，消化成细胞悬液，与I型或II型病毒一定比例混合分种转瓶培养成牢固单层后，用缓冲液充分喷淋(有间隔)，加入0.2％人白蛋白199培养基(pH7.4～7.8)继续培养7～9天，每3～4天收液一次，进行无菌试验及毒力测定，无菌试验合格，病毒滴度大于6.50LogTCID₅₀/ml，即为合格疫苗原液。

实施例3.疫苗原液的浓缩及纯化

上述合格的疫苗原液合并，进行连续流离心机离心(10000r/m)，去除细胞碎片和杂质，然后用Millipore PELLICON 300K M.W.超滤浓缩至少50～100倍，再经装载有Sepharose 4 FF介质的BPG柱(全套由瑞典Amersham Pharmacia生物技术公司生产)，紫外检测第一峰即为所需要的纯化病毒峰，按收集的液量，加入β-丙内酯(1∶4000)灭活，测定有关抗原蛋白含量及ELISA滴度，用PBS(pH7.2～7.4)稀释至合适量(比疫苗原液高4～8倍)，同时检测残余牛血清含量，Vero细胞DNA含量及安全试验(盲传3代)，必要时检测β-丙内酯残留量，稀释的样品中立即加入0.3～0.5％人白蛋白，0.5mg/ml的Al(OH)₃及硫柳汞防腐剂等，此为纯化疫苗半成品。半成品的检定，实际是I型和II型疫苗的分别检定，内容如下所述。

实施例4.疫苗原液的毒力测定

在病毒培养进程中，用免疫荧光法检测来估计病毒在细胞中繁殖状况，IFAT的结果在+++以上。收获的原液进行了无菌试验及病毒毒力滴定。

半成品的检定：半成品分两类，即在加人白蛋白，Al(OH)₃和硫柳汞等以前及以后，以前包括：蛋白含量、抗原活性(ELISA滴度)、β-丙内酯含量、残牛血清蛋白含量及Vero细胞DNA含量的测定，安全试验；以后做无菌试验。而对加入成分的含量测定都放在成品的检定中。

成品的检定：成品是I型半成品和II型半成品(在加入人白蛋白等以后)适量合并，分装后的制品。需作全面检定，包括：无菌试验，毒性试验，热原试验，效力试验及Al(OH)₃，硫柳汞和总蛋白量等，另外还包括外观及pH等理化检定。

实施例5.纯化样品的特殊检定

下列检定，将不一定包括在以后的疫苗生产过程中：纯化样品中病毒颗粒形态观察及病毒蛋白SDS-PAGE电泳，以此判定病毒的特异性及纯度。病毒形态由本所形态室用负染色进行[如说明书附图4.纯化病毒样品中的病毒颗粒形态(负染色，30000×)]，电泳按本室常规操作进行[如说明书附图5.纯化病毒样品的SDS-PAGE电泳图1、纯化样品84Fli；2、纯化样品L99；3、蛋白Marker，由上至下分子量依次为97.4KD、66.2KD、42.7KD、31.0KD、14.4KD。]。

实施例6.疫苗保护效果的测试

选取4只2kg左右重的大白兔，将用上述方法制得的疫苗接种，28天后，测试大白兔体内产生的中和抗体的滴度，其中3只体内的抗体滴度≥1∶20以上。

Claims (11)

1.一种流行性出血热多价纯化疫苗，其中该疫苗用下述方法制备而成：

将不同血清型的流行性出血热病毒株分别接种于Vero细胞，传代培养，多次收液，合并即为原液，离心，超滤浓缩，纯化，灭活，稀释除菌，加入佐剂配制成多价纯化疫苗。

2.权利要求1所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述的不同血清型的流行性出血热病毒株为野鼠型(I型)和家鼠型(II型)毒株。

3.权利要求2中所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述的野鼠型(I型)毒株包括A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5、C4等，所述的家鼠型(II型)毒株包括L99、R22等。

4.权利要求3中所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述的毒株在接种前都已经经过Vero传代细胞长期传代适应。

5.权利要求3中所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述毒株的滴度均达7.0Log/ml以上。

6.权利要求1所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述的原液在10000转/分进行连续流离心。

7.权利要求1所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述的超滤浓缩是通过300K滤板进行的。

8.1权利要求7所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述滤板是PELLICON 300K滤板。

9.权利要求1所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述的纯化为柱层析纯化。

10.权利要求9所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中柱层析是在Sepharose 4 FF(BPG)柱上进行的。

11.权利要求1所述的流行性出血热多价纯化疫苗，其中所述的灭活采用β-丙内酯进行灭活。

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