CN101352569B - 二倍体细胞乙型脑炎疫苗及纯化乙型脑炎疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二倍体细胞乙型脑炎疫苗及纯化乙型脑炎疫苗的制备方法，该方法使用无血清培养基培养人二倍体细胞乙脑纯化疫苗，可使过敏反应大大降低，同时有利于纯化。
Description
技术领域：
本发明涉及一种乙型脑炎的纯化疫苗的制备方法，特别是在人二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种得到的乙型脑炎纯化疫苗的制备方法。
背景技术：
目前世界上大量生产的乙脑疫苗有三种，第一种是以日本为代表的用感染乙脑病毒的小白鼠脑组织经过研磨、乳化、浓缩、超速离心制备的纯化乙脑疫苗；第二种是中国生产的原代地鼠肾细胞培养的乙脑灭活疫苗和原代地鼠肾乙脑活疫苗，这两种疫苗的细胞基质均来源于普通级动物，无法保证不携带外源因子；第三种是北京生物制品研究所以Vero细胞为培养基质生产的冻干乙脑纯化灭活疫苗，但不能保证细胞基质的致肿瘤和细胞的DNA。
中国专利：2004100581129描述了一种人二倍体细胞-WI-38乙型脑炎纯化疫苗，该疫苗的制备采用的细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成。无血清培养基(Serum-free Media)被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体、病毒抗原和重组蛋白等。无血清培养基必须能够满足细胞的一系列营养及生理需求，而通常情况下这些营养及生理需求是由加入到培养基中的血清来予以提供的。大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白、纤连蛋白、胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反应器剪切力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂类和其他生长因子的载体等。本发明意外的发现，通过使用无血清培养基培养人二倍体细胞乙脑纯化疫苗，可使过敏反应大大降低，同时有利于纯化。
发明内容：
本发明提供一种人二倍体细胞乙脑纯化疫苗的制备方法。
本发明采用人二倍体细胞-WI-38来制备乙型脑炎纯化疫苗，该疫苗是在人二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种，经分离纯化得到的乙型脑炎疫苗。所述乙脑病毒毒种选自乙脑鼠脑毒种P3株或SA14-14-2株。本发明的疫苗是冻干注射剂或水针剂。
本发明的疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)、人用二倍体细胞的复苏；
(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；
(3)、在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种；
(4)、收获病毒液；
(5)、病毒液的灭活；
(6)、澄清超滤；
(7)、纯化；
(8)、稀释分装。
所述人用二倍体细胞的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由无血清培养液组成。可以补充适量的抗生素。所述人二倍体细胞的培养扩增是在转瓶内培养，培养方式为微载体培养、悬浮培养或细胞袋培养。
在本发明的乙脑纯化疫苗的制备工艺中，细胞培养所用的培养基是无血清培养基，采用纯化超滤纯化初步纯化，蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析进行更纯提纯。测试结果表明，经过本发明的三步提纯后，可使疫苗总蛋白含量减少约99％以上，疫苗免疫效果大大提高，副反应大大降低，加入氢氧化铝佐剂后使疫苗的效价提高20％，稳定性同时大大提高，接种时减缓病毒释放的速度，保持良好的抗体水平。通过纯化疫苗加入佐剂能增加疫苗的持久性，疫苗能够持久刺激机体产生抗体。
本工艺提供的人二倍体乙型脑炎纯化疫苗，是指在人二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种得到的乙型脑炎纯化疫苗。本工艺具体的制备方法包括以下步骤：
(1)、人二倍体细胞的复苏；
(2)人二倍体细胞的培养扩增；
(3)、在人二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种；
(4)、收获病毒；
(5)、灭活病毒制成粗疫苗；
(6)澄清过滤；
(7)、超滤纯化；
(8)、蔗糖密度梯度离心；(或DEAE-SepharoseFF阴离子交换)
(9)、Sepharose4FF柱层析纯化；
(10)、佐剂吸附加保护剂人血白蛋白(或不加佐剂吸附)
(11)、稀释分装。
本工艺使用的人二倍体细胞种来源于中国疾病预防控制中心，首先建立细人二倍体细胞种子库和人二倍体细胞工作库，并对细胞库细胞进行系统的检定。在制备疫苗之前，需先进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。可使用无血清培养基补充适量的抗生素配制而成的细胞营养液，培养条件为PH7.0-7.6在37±0.5℃温度下进行培养扩增。
各种用于制备疫苗的哺乳动物细胞均为附着依赖性细胞，细胞在一定的载体上生长，本工艺中细胞的培养方式为转瓶培养，包括微载体培养、悬浮培养、细胞袋培养。
为防止细菌污染，在配制细胞营养液的同时可加入适量的卡那霉素或庆大霉素。
培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，一般可以是1∶2-1∶4当细胞长成致密单层后，即可接种乙脑病毒，细胞维持液中最好加入0.4-0.5％(w/w)的人血白蛋白，同时调整PH7.2-7.8，培养温度32-37℃，并可加入适量的氨基酸和抗生素，可供使用的无血清培养液选自：
UltraCULTURETM培养基(通用无血清培养基)
12-725F UltraCULTURE MEDIUM(Serum-free general purpose medium)500ml988.80
PC-1TM培养基(通用无血清培养基)
77232 PC-1 Complete Serum-Free Medium 2x500ml 2,206.26
77230 PC-1 Complete Serum-Free Medium(powder plus supplement)10L12,566.00
344022 PC-1 Supplement(50X)10ml 875.50
UltraMEM Reduced Serum培养基(通用无血清培养基)
12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium(Protein-free basal medium withoutL-glutamine)500ml 449.08
12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium(Low-protein medium containingL-glutamine & ITES)500ml 519.12
X-VIVOTM无血清培养基
04-380Y X-VIVOTM 10(with Gentamycin and phenol red)1 liter 1386.38
04-380Q X-VIVOTM 10(with Gentamycin and phenol red)1 liter 1386.38
08-022A X-VIVOTM 10(with Gentamycin)
4 liter 6241.80
04-743Q X-VIVOTM 10(without Gentamycin or phenol red)1 liter 1948.76
04-418Y X-VIVOTM 15(with Gentamycin)
1 liter 1643.88
04-418Q X-VIVOTM 15(with Gentamycin and phenol red)1 liter 1602.68
08-055B X-VIVOTM 15(with Gentamycin)10 liter 16020.62
04-744Q X-VIVOTM 15(without Gentamycin & phenol red)
1 liter 1831.34
04-448Q X-VIVOTM 20(with Gentamycin and phenol red)1 liter 1643.88
然后在已经生长成致密单层的人二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种MOI0.1-0.00001及上述细胞维持液，培养72小时左右，即可收获病毒。
本工艺在人二倍体细胞上接种的乙脑病毒为在传代的人二倍体乙脑病毒种，有实验结果显示，乙脑病毒在人二倍体细胞上能够很好地生长繁殖，在人二倍体细胞传代乙脑病毒10代以内很稳定，并且制备人二倍体细胞乙脑疫苗方面，10代以内的细胞传代毒种的免疫原性没有明显改变，而10代以后的毒种的免疫原性则有明显的下降，也就是说，制备疫苗最好选用10代以内的传代毒种，10代以后的毒种不宜用于制备纯化疫苗。至于毒种则优选乙脑鼠毒种P3株在人用二倍体细胞的传代毒种。
乙脑病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，因此病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是第3-4天收获一次，对收获的病毒液及时测定病毒滴度，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应在107LD50/ml以上，因为只有高滴度的病毒液才能保证疫苗的高效力。
收获的病毒液用甲醛溶液或β-丙内酯灭活病毒得到的是粗疫苗。
灭活后的粗疫苗需要进行浓缩提纯制备成纯疫苗制品，本工艺选用Sepharose中空纤维纯化超滤的方法对得到的粗疫苗进行浓缩，一般是用截留10万-30万分子量的超滤器浓缩疫苗，浓缩至20倍以上，然后纯化疫苗。
以人用二倍体细胞制备生物制品安全性的关键是杂蛋白的含量。疫苗的总蛋白量必须小于15ug/ml。有关疫苗的纯化方法包括化学法和物理方法等可以有多种，经反复试验和研究，本工艺提出纯化方法：超滤纯化、超离纯化和Sepharose4FF柱层析纯化。
超滤纯化疫苗即把疫苗超滤浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS冲洗，再深缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗如此反复5-6次，杂蛋白可以去除93％以上，再经过蔗糖密度梯度离心法参考石慧颖1998年发表的大规模区带离心纯化的方法纯化Vero细胞乙脑疫苗的方法，用36％和45％(W/V)蔗糖溶液作密度梯度，23000rpm超速离心4小时后，经过对紫外吸收峰的抗原含量，蛋白浓度的分析，确定病毒抗原所在位置。然后再经过Sepharose 4FF纯化，而凝胶过滤层析是层析技术中最简单，条件最温和，对保持生物大分子的活性最有利的方法，适合分离分子量悬殊的物质，乙脑病毒的分子量在400万以上，与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大，故使用凝胶柱层析可以非常方便有效地去除疫苗中残留的小分子杂质，该凝胶过滤柱可以是Sepharose 4FF柱或其他凝胶，而检测结果表明，经三步层析柱纯化后，疫苗总蛋白含量减少约99％以上，而且比规程所要求的含量更低。纯化疫苗制成成品(即水针剂型)，加入保护剂人血白蛋和氢氧化铝佐剂。用人二倍体细胞作为疫苗的生产基质，并且以人二倍体细胞的传代毒种代替现有的鼠脑组织毒种，通过相应的工艺方法生产制备出高质量的乙脑疫苗。用本工艺制备的乙型脑炎纯化疫苗中不含鼠脑组织，纯度高，免疫效果大大提高，使用安全性高，并能实现乙脑疫苗的大规模工业化生产。
本工艺制备的疫苗经提纯后抗原活性明显提高，杂蛋白减少99％以上，疫苗的纯度大大提高。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心，使用38-50代，细胞营养液为无血清培养基中加入25IU/ml庆大霉素或25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2，用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶2分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，接种二倍体细胞乙脑病毒，使用乙脑鼠脑毒种P3株在二倍体细胞上传代的第二代工作毒种(P3-2)，毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培养液，PH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每3-4天收获一次，共收5次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒滴度达到107LD50/ml以上；合并病毒液加入甲醛溶液或β-丙内酯(终浓度1/2000)置于26±1℃，8天灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗。
超滤纯化的浓缩疫苗蔗糖密度梯度离心法和凝胶过滤柱Sepharose 4FF，经三步纯化，得到纯化疫苗，加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装，制成乙型脑炎纯化疫苗为水针剂型5ml或其他规格。
检定疫苗效力达到了中国乙脑疫苗参考品和日本乙脑疫苗参考品要求，其他各项检定均合中华人民共和国药典标准2005版生物制品规程的疫苗要求。
实施例2
二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心，使用38-50代，细胞营养液为无血清培养基中加入25IU/ml庆大霉素和25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2，用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶2分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，用PH7.2的Earl’s液冲洗细胞面，接种二倍体细胞乙脑病毒，使用乙脑鼠脑毒种AS14-14-2株在二倍体细胞上传代的第二代工作毒种(P3-2)，毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培养液，PH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每3-4天收获一次，共收5次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒滴度达到107LD50/ml以上；合并病毒液加入甲醛溶液或β-丙内酯(终浓度1/2000)置于26±1℃，8天灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗。
超滤纯化的浓缩疫苗过蔗糖密度梯度离心法和凝胶过滤柱Sepharose 4FF，经三步纯化，得到纯化疫苗，加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗半成品，分装，制成乙型脑炎纯化疫苗为水针剂型2ml或其他规格。
检定疫苗效力达到了中国乙脑疫苗参考品和日本乙脑疫苗参考品要求，其他各项检定均合中华人民共和国药典标准2005版生物制品规程的疫苗要求。
实施例3
用权利要求1方法制备的乙脑灭活疫苗经实验(包括给12名4-6岁儿童注射，未接种过乙脑疫苗者，接种2针乙脑灭活疫苗，两针间隔7-10天。)证明中和抗体阳转率为91.7％，无副反应发生。
实施例4
用权利要求1方法制备的乙脑灭活疫苗经实验给58名4-6岁儿童注射，未接种过乙脑疫苗者，接种2针乙脑灭活疫苗，两针间隔7-10天，过敏反应为0
而用2004100581129专利描述的方法制备的乙型脑炎纯化疫苗(注：该疫苗的制备采用的细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成)给45名儿童注射，有两名儿童出现红肿。
Claims (1)
1.一种人用二倍体细胞乙型脑炎纯化疫苗的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：
二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心，使用38-50代，细胞营养液为无血清培养基中加入25IU/ml庆大霉素或25IU/ml卡那霉素，并调整pH到7.2，用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶2分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，接种二倍体细胞乙脑病毒，使用乙脑鼠脑毒种P3株在二倍体细胞上传代的第二代工作毒种P3-2，毒种浓度MOI值为0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培养液，pH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每3-4天收获一次，共收5次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒滴度达到107LD50/ml以上；合并病毒液加入终浓度1/2000的β-丙内酯，置于26±1℃，8天灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗，经超滤纯化，蔗糖密度梯度离心和凝胶过滤柱Sepharose 4FF三步纯化，得到纯化疫苗，加入保护剂人血白蛋白和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装，制成乙型脑炎纯化疫苗为水针剂型5ml，其中，所述无血清培养基是通用无血清培养基UltraCULTURETM。
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