KR100968141B1 - 세포 배양물에서 바이러스의 증식 방법 - Google Patents

세포 배양물에서 바이러스의 증식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포를 바이러스로 감염시키고 감염 후에 바이러스의 증식과 동시에 표적된 추가적인 적어도 2배의 세포 증식을 허용하는 조건에서 세포는 세포 배양물에서 배양하는, 세포 배양물에서 바이러스를 증식하는 방법과 관련된다. 본 발명은 또한 약물과 진단제를 제조하기 위해서, 획득한 바이러스의 사용 또는 바이러스에 의해 발현된 단백질과 관련된다.
바이러스, 세포 배양물

Description

세포 배양물에서 바이러스의 증식 방법{MULTIPLICATION OF VIRUSES IN A CELL CULTURE}
본 발명은 세포를 바이러스로 감염시키고 감염 후에 바이러스의 증식과 동시에 표적된 추가적인 적어도 2배의 세포 증식을 허용하는 조건에서 세포를 세포 배양물에서 배양하는, 세포 배양물에서 바이러스를 증식하는 방법과 관련된다. 본 발명은 또한 약물과 진단제를 제조하기 위해서, 획득한 바이러스의 사용 또는 바이러스에 의해 발현된 단백질과 관련된다.
감염성 질병, 특히 바이러스 감염은 임상적으로 중요하다. 바이러스에 관한 연구와 백신의 제조를 허용하기 위해서 바이러스가 배양물에서 증식할 수 있는 수단으로 더 좋은 방법을 유용하게 하기 위한 필요는 그대로 남아있다.
대응하는 바이러스에 따라, 바이러스 증식에 대한 다른 숙주 시스템과 배양 조건이 당업계에서 사용된다. 표준 숙주 동물, 달걀의 배아, 일차 조직 세포 배양물 또는 확립된 영구적 세포주가 숙주 세포로 사용된다(Rolle and Mayr (editors), Microbiology, Infection and Epidermic Science, 1978; Mahy (editor), Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek (editors) Compendium of General Virology, 1985).
달걀의 배아에서 바이러스 증식은 비용과 시간이 많이 필요하다. 감염전에 알을 배양해야 하고 배의 활성에 대해 시험해야 한다. 증식되는 바이러스로 감염 후에, 더 배양하여 배는 마침내 죽는다. 알에서 분리된 바이러스는 오염물이 없고 농축된다. 배양된 알에서 바이러스의 증식은 멸균 조건에서 가능하지 않기 때문에, 오염 병원성 미생물은 임상적 또는 진단적 응용에 유용하기 때문에 분리주로부터 제거되어야 한다.
달걀에서 바이러스의 증식에 대한 대안책은 정의된 세포주의 진핵 숙주 세포에 의해 제공된다(Gregersen, J. P., Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser and Muller (editors), 2000, Seiten 257-281). 지속적 외부 바이러스 오염 또는 바이러스로부터 검증의 부재, 분명하지 않은 출처, 역사 때문에 많은 세포주는 백신이나 유사한 의학적으로 사용가능한 제제를 제조하는 데 적합하지 않다.
세포 배양물에서 바이러스의 증식에 대한 선행 기술문에서 사용된 방법은 모두, 세포가 초기에 바이러스가 없는 상태에서 배양하고 바이러스가 첨가된 후 세포의 현저한 증식이 없는 조건에서 증식되며 바이러스가 최고로 증식된 후 배양물을 수거하는 같은 기본적 계획을 가진다.
예를 들어, 원숭이의 신장세포에서 유래한 베로 세포는 백신 제조를 위한 바이러스 (폴리오 바이러스, 광견병 바이러스)의 증식에 사용된다. 이러한 세포는 다른 세포 은행 (예를 들어, American Type Culture Collection, ATCC)에서 유용하고 임상적 연구를 위한 시험된 세포 은행에서 유래한 World Health Organization (WHO)에 의해 유용하다.
이러한 베로 세포는 우유병, 플라스틱 배양 플레이트 또는 플라스틱 플라스크와 같은 성장을 위한 지지체 표면이 필요한 부착성주이다. 발효기 즉, 세포가 성장할 수 있는 표면이 있는 일반적으로 작은 플라스틱구에서 대응하는 세포의 배양물에서 소위 미세담체에서 성장한다.
부착성 BHK(Baby Hamster kidney)와 부착성 MDCK(Madine Darby Canine kidney) 세포와 앞에서 언급된 베로 세포에 추가로 다른 세포는 활성적으로 바이러스를 증식할 수 있고 약학적 산물의 제조를 위한 기질로 사용되고 있고 이들의 사용은 고려되고 있음이 알려져 있다. 인플루엔자바이러스에 추가로 MDCK 세포주 ATCC CRL34 (NBL-2)에서 소낭 구내염 바이러스 , 콕사키바이러스 B5 (B3 또는 B4가 아닌), 레오바이러스 타입 2와 3, 아데노바이러스 타입 4와 5, 우두-바이러스가 실험적으로 증식되었다. 하지만, 모든 대응하는 출판물은 부착 배양물(ATCC 산물 정보 참조)쪽으로 배타적으로 방식을 바꾸었다. 하지만, 진탕 배양은 림포이드와 많은 형질전환된 세포만이 이러한 시스템에서 지금까지 배양할 수 있는 많은 양의 세포양을 증식하는데 바람직하다 (Lindl (editors), Cell and Tissue Culture, 2000,pp. 173 ff). 단백질이 없는 배양 배지의 진탕에서 자랄 수 있는 MDCK세포주가 WO 97/37000 에 개시되어 있다. 대응하는 기주세포를 이용하는 인플루엔자 바이러스의 증식도 또한 기술되어 있다.
적절한 세포 또는 기주 시스템을 선택하는 것에 추가로, 바이러스 계통이 증식될 수 있는 배양 조건은 수용가능하게 높은 수율을 달성하는데 매우 중요하다. 바람직한 바이러스 계통의 수율을 최대화하기 위해서, 바람직한 바이러스 계통에 대한 선호적 환경 조건을 달성하기 위한 기주 시스템과 배양 조건이 특이적으로 변경되어야 한다. 다른 바이러스 계통의 높은 수율을 달성하기 위해서, 적정 성장 조건을 생성하는 시스템이 따라서 획득된다. 많은 바이러스는 특별한 기주 시스템에 제한되고 이들중 일부는 바이러스 수율에 대해서 비효율적이다. 효율적인 생산 시스템은 다른 숙주 시스템이 있는 중간 단계를 사용하고 대부분 동물이나 인간 기원의 혈청인 단백질 첨가물을 사용하여 대응하는 배양 시스템의 바이러스 집단의 적응에 기초한다.
혈청 또는 다른 성장 인자를 첨가하여 초기 증식한 후 혈청 또는 단백질 첨가물없이 거의 모든 세포 배양물이 적어도 특정 시간동안 저장될 수 있다는 것이 능숙한 이에게 알려져 있다. 예를 들어, 바이러스 감염의 시기 또는 혈청또는 단백질이 없는 배지로 수거하기 바로 전에 자의적인 세포 배양물은 변환될 수 있고 수거할 때까지 저장될 수 있다. 이는 외부 단백질을 회피하거나 감소시키면서 몇 년동안 백신 또는 진단 시험에 대한 바이러스 물질을 획득하기 위해 보편적으로 수행 되어 왔다. 혈청 조성분은 적절히 제거될 수 있기 때문에 혈청을 첨가하고 감염기간동안 이 수행없이 보관된 백신과 세포 배양물은 인간 또는 동물에서 사용하는데 있어서 더 큰 문제를 가진다(WHO-recommendations "Proposed requirements for MeasLes Vaccine" (Live), Requirements for Biological Subtances No. 12, Revised 1978 참조).
많은 바이러스는 오직 매우 불량히 증식될 수 있고 모든 단백질 포함하는 배지에서 증식할 수 있는 것은 아님이 알려져 있다. 배양시스템에서 증식에 대한 단백질분해 효소(프로테아제)의 활성에 의존하는 바이러스가 관련되어 있다. 이러한 프로테아제는 단백질에 의해 완전히 억제되기 때문에, 적어도 감염의 시기부터 또는 생산 시기부터 단백질의 첨가는 논리적으로 여기서 불가능하다. 프로테아제를 첨가하여 보통 증식해야만 하고 단백질 첨가물을 감염 배지에 첨가하지 않고 좋은 수율을 달성하기 위한 바이러스의 예는, 가능하다면, 인플루엔자바이러스와 로타바이러스이다. 파라믹소바이러스와 레오바이러스와 같은 다른 유형의 바이러스는 가능하면 단백질의 양이 적은 배지로부터 증식하는 동안 유익하다. (Ward et al. (1984) J. Clin. Microbiol. 748-753 "Efficiency of human rotavirus Propagation in Cell Culture"). WO 96/15231는 보통 단백질 첨가물없이 얻을 수 있는 배지가 사용되는 세포 배양물에서 Vero와 다른 세포의 배양을 제안한다.
예를 들어, 광견병-, 로타-, 폐렴- 또는 간염 A 바이러스와 같은 다른 바이러스는 배지 조성물과 배양 조건에 관계없이 증식하지 못하는 것으로 알려져 있다 (Provost and Hillemann, Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160: 213-221 (1979); and Rolle and Mayr, loc. cit.).
바이러스의 증식 후에, 대개는 배양물로부터 분리된다. 배지와/또는 세포로부터 증식한 후에 바이러스, 바이러스 발현 산물 또는 다른 단백질이 분리될 수 있는 수단으로 많은 방법이 선행기술문에 공지되어 있다(Gregersen, loc. cit.; Mahy , loc. cit.; Reimer C., et al., Journal of Virology, Dec. 1967, p. 1207-1216; Navarro del Canizo, A., et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 61, 1996, 399; Prior, C., et al., BioPharm, Oct. 1996, 22; Janson, Jan-C.and Ryden, L. (editors), Protein Purification, 1997; and Deutscher M. (editors), Methods in Enzymology, Vol. 182, 1990).
방법의 개략적 과정을 근거로 (세포 증식, 바이러스 증식, 수거), 선행기술문에 공지된 방법은 오직 제한된 바이러스 증식과 수거만을 허용한다.
본 발명에 내재하는 문제점은 더 많은 바이러스를 증식시키고 많은 양을 단순히 수거하는 세포 배양물에서 바이러스를 증식시키기 위한 방법을 제공하는 것으로 구성되어 있다.
이러한 문제점은 바이러스를 증식하는 방법으로 해결된다.
a) 세포를 바이러스로 감염시키고;
b) 감염 후에 바이러스의 증식을 허용하는 조건에서 세포 배양물에서 배양하고 동시에 표적하는 추가적, 적어도 2배로 세포가 증식된다.
놀랍게도, 배양하는 과정이 기본적으로 변경된다면 세포의 성장이 바이러스의 증식동안에 가능하다는 점에서 세포 배양물에서 바이러스의 증식을 위한 매우 개선된 방법을 획득한다. 더 많은 바이러스를 짧은 시간에 획득할 수 있는 잇점을 가지고 있다. 세포 배양물의 설치 산물도 또한 향상되었다.
본 발명에 따라, 세포 감염후에 세포가 적어도 2배 또는 5배, 바람직하게는 적어도 10배 증가하도록 세포 배양을 수행한다.
세포의 증식은 감염 후 적어도 7 일 동안에 배양을 수행할 수 있음을 의미하지만 바람직하게는 세포와 바이러스는 세포 배양물에서 적어도 21, 28 또는 35 일 동안에 증식된다.
본 방법에 따라, 바이러스와 세포의 증식 동안에 신선한 배지, 배지 농축물또는 배지 성분을 적어도 한번 첨가 또는 신선한 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분을 함유하는 배양 용기에 바이러스와 세포의 적어도 일부를 이동시키는 것이 이롭다. 하지만, 바이러스와 세포의 증식 동안에 적어도 한번 신선한 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분을 첨가하는 것이 바람직하다.
배지, 배지 농축물 또는 배지 성분의 첨가는 바람직하게는 적어도 한번 또는 여러번 반복한다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시예에 따르면 감염된 세포를 배양하는 동안 배양 배지는 신선한 배양배지로 치환되거나 신선한 배양 배지를 첨가하여 세포 부피는 증가한다. 아미노산, 비타민, 지방 부분, 인산, 다른 물질과 같은 배지 농축물 또는 배지 구성물로 배양 배지를 교환 또는 치환한다. 이러한 단계는 세포를 배양하는 동안 반복적으로 수행된다.
이는 배양 상청액으로부터 복합 바이러스 수거에 의해 특히 전체 배양물 부피를 증가시키고 신선한 배지를 첨가하여 세포 수를 계산해서 바이러스 수율에서 증가를 허용한다. 이 시스템의 수율이 상당히 향상되기 때문에 대응하는 복합 수거는 본 발명에 따른 방법의 중요한 잇점을 나타낸다.
본 발명의 방법에서 MDCK세포는 바람직하게는 바이러스의 증식에서 사용된다.
본 발명에 따른 방법에서 사용된 세포에서, 진탕 배양에서 자라는 성질을 가 진 세포가 관련되어 있다. 발효기에서 상업적 규모로 지지체 입자가 없을 때 자랄 수 있는 세포주는 다른 세포에 상대적으로 이것은 배양물의 조작, 배양물의 대량 생산, 바이러스의 증식동안에 상당한 잇점을 가진 것으로 지정되어 있다. 진탕 배양에 대해 MDCK 세포를 변경하는 방법이 선행 기술문 (WO 97/37000)에 공지되어 있다. MDCK세포는 세포주 MDCK 33016로부터 유래할 수 있다.
발명의 또다른 구체예에 따르면, 감염 전과 감염 후에 부착성이고 진탕 배양물로서 자라는 성질을 가진 세포가 사용된다. 이러한 구체예는 세포 배양시스템과 실험실 규모에서 상업적 생산으로 세포를 발달하기 위한 배지가 사용될 수 있다는 특별한 잇점을 가지고 있다. 각 세포 배양시스템의 안전만 점검하면 되기 때문에 대응하는 시스템은 약물 등록을 현저히 단순화한다.
바이러스는 단일 가닥 디옥시리보뉴클릭산(ssDNA), 이중가닥 디옥시리보뉴클릭산(dsDNA), 이중가닥 리보뉴클릭산 (dsRNA) 또는 단일 가닥 리보뉴클릭산으로부터 유래한 게놈을 가질 수 있다. 단일 가닥 디옥시리보뉴클릭산 분자는 메신저 RNA, RNA(+),또는 반대 극성 RNA(-)를 가진다.
바이러스는 선행 기술문에 공지된 바이러스가 될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 사용된 바이러스는 ATCC (American Type Culture Collection)또는 ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures)와 같은 다른 수집물에서 획득할 수 있다. 세포 배양물에서 이미 전증식된 존재하는 생성계통 또는 바이러스 계통은 이에 속한다. 특정 분리체가 설정될 수 있지만 이들은 대응하는 응용에 더 적합하다. 본발명의 구체예에 따르면, 방법에서 사용된 바이러스는 아데노바이러스, 오르쏘-, 파라믹소바이러스, 레오바이러스, 피코르나 바이러스, 엔테로바이러스, 플라비바이러스, 아레나바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스로 구성된 집단에서 선택된다. 아데노바이러스 , 폴리오 바이러스 , 간염 A- 바이러스 , 일본 뇌염-바이러스 , 중앙 유럽 뇌염 바이러스와 관련된(러시아 또는 다른)형태, 뎅기 바이러스 , 옐로우 피버 바이러스 , 간염 C 바이러스 , 루벨라 바이러스, 볼거리 바이러스 , 홍역바이러스 , 호흡 융합체 바이러스 , 우두바이러스 , 인플루엔자바이러스 , 로타바이러스 , 랍도바이러스 , 폐렴바이러스 , 레오바이러스 , 허피스 단순바이러스 1또는 2, 거대세포바이러스, 수두-대상포진바이러스, 개 아데노바이러스 , 엡스타인바르 바이러스 ,BHV-1 또는 거짓미친개병바이러스와 같은 소 또는 돼지 허피스바이러스가 사용될 수 있고 광견병 바이러스 , 로타바이러스 , 폐렴바이러스 또는 간염 A바이러스는 특히 바람직하다.
본 발명의 또다른 구체예에 따르면 바이러스의 게놈은 크기가 적어도 10 kd인 이종, 기능성 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 게놈에 예를 들어, 허피스, 우두 또는 아데노바이러스 게놈 (Galler R. et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 1997 Feb., 30(2): 157-68; Willemse MJ. et al., Vaccine 1996 Nov., 14(16): 1511-6; Efstathiou S.; Minson AC., Br. Med. Bull., 1995 Jan. 51(1): 45-55; Hammerschmidt W., Curr. Opin. MoL. Ther., 2000 Oct., 2(5): 532-9; Graham FL.; Prevec, L., MoL. Biotechnol., 1995, Jun; 3 (3): 207-20; Carroll MW., Moss B.; Curr. Opin. Biotechnol., 1997 Oct.; 8(5): 573-7; Wojcik J., Acta. MicroBiol. PoL., 1995, 44(2): 191-6; Ramirez JC. et al., J. ViroL., 2000 Aug.; 74(16): 7651-5; Hagen, Anna, et al., Biotechnol. Prog., 1996, 12, 406-408; Huyghe, Bernard, et al., Human Gene Therapy, 1995 Nov., 6: 1403-1416)에 근거한 선행 기술문에 이종 단백질의 발현에 대한 다양한 벡터가 공지되어 있다.
본 발명의 본문에서 바이러스 게놈이 서열의 첨가 또는 치환에 의해 변경되어 게놈은 크기가 적어도 10 kd인 즉, 바이러스에 원래 속하지 않은 이종 기능성 단백질을 암호화하는 바이러스의 증식에 대한 방법이 또한 포함된다. 본 발명에 따라, 단백질이 적어도 이 단백지에 대해 면역반응을 일으킬 수 있을 때 단백질은 기능성 단백질로 언급된다. 단백질은 면역 활성에 추가로 예를 들어, 효소 또는 싸이토카인으로서 생물학적 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 방법에서 사용된 바이러스는 바이러스 게놈에서 각 유전자에서 삭제를 가진다. 예를 들어, 병원성 인자를 암호화하는 백신으로 사용되는 바이러스는 고의적으로 삭제된다. 대응하는 삭제는 바람직하게는 500 또는 1000 뉴클레오티드를 포함한다.
자연적으로 본발명에 따른 방법에 의해 사용된 바이러스는 완전한 바이러스 게놈을 포함할 수 있다.
배지에서 혈청이 있거나 또는 없을 때 본 발명의 방법에 따라서 진탕 배양에서 바이러스는 증식한다. 세포 배양 조건은 생산된 산물의 의학적 사용의 등록을 상당히 단순하게 하기 때문에 혈청이 없을 때 특별한 잇점은 획득된다. 혈청 첨가물로 배양 배지에 분배하여 배지 오염물을 제거하기 위한 비싼 정제 단계가 회 피된다. 산물의 질에 관한 개선은 따라서 달성되고 비용은 이 이유때문에 회피된다.
배지는 본 발명의 본문에서 인간이나 동물 기원의 혈청으로부터 첨가물이 없는 혈청이 없는 배지로 언급된다.
배양물과 후속하는 사용물에 간섭 효과가 없는 특이적 단백질은 대응하는 배양물에 정의된 양으로 첨가될 수 있다. 이런 유형의 화학 배지는 화학적으로 규명된 배지로 언급된다. 당업계에서 능숙한 이에게 공지된 다른 과정으로부터 획득한 미토젠 펩티드, 인슐린, 트랜스페린 또는 지용성 단백질과 같은 선택된 단백질을 이 배지에 첨가한다. 본 발명의 본문에서 미토젠 펩티드는 식물 가수분해물, 예를 들어 다른 유용한 식물의 단백질에서 유래한 단백질 가수분해물 또는 분해물을 의미하는 것으로 이해된다.
특별히 바람직한 구체예에 따르면 하지만, 배지는 완전히 단백질이 없다. 단백질-없다는 것은 단백질, 성장 인자, 다른 단백질 첨가제, 비혈청 단백질을 배지하고 세포의 증식이 일어나는 배양물을 의미하는 것으로 이해된다. 그러한 배양물에서 자라는 세포는 자연적으로 단백질 자체를 포함한다.
알려진 혈청-없는 배지는 Iscove's 배지, Ultra-CHO-배지(BioWhittaker) 또는 EX-Cell(JHR Bioscience)를 포함한다. 보통 혈청-함유 배지는 10% 소태아혈청 또는 유사한 첨가제에 대해 보통 사용되는 Eagle's Basal Medium(BME) 또는 Minimum Essential Medium (MEM) (Eagle, Science 130, 432, (1959)) 또는 Dulbecco's 변경된 이글스 배지 (DMEM 또는 EDM)를 포함한다. PF-CHO (JHR-Bioscience)와 같은 단백질 없는 배지, ProCHO 4CDM (Bio Whittaker)또는 SMIF 7 (Gibco/BRL-Life Technologies)와 같은 화학적으로 규명된 배지와 Primactone, Pepticase또는 HyPepTM (모두 Quest International에서 유래한) 또는 락트알부민-가수분해물 (Gibco u. a. Hersteller)와 같은 마이토젠 펩티드가 적절하게 선행기술문에 공지되어 있다. 식물 가수분해물에 근거한 배지 첨가물은 바이러스, 마이코플라스마 또는 알려지지 않은 감염원으로 오염은 제거될 수 있다는 특별한 잇점을 가진다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면 감염된 MDCK세포를 배양하는 동안에 아미노산, 비타민, 지방 부분 또는 인산과 같은 신선한 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분이 첨가되었다.
본 발명에 따른 방법은 관주 또는 배치 시스템에서 수행될 수 있다. 배지가 지속적으로 공급되고 회수되는 배양시스템이 관주시스템으로 언급된다. 이의 대안책으로서, 세포는 접종에서 수거할 때까지 배지를 공급하지 않고 밀폐된 시스템으로서 시스템이 운영되는 배치 시스템에서 배양될 수 있다.
본 발명에서 사용된 세포주의 적절성 때문에 바람직한 응용(온도, 세포 밀도, pH값, 등.)에서 사용되는 세포 배양 조건은 넓은 범위에서 가변적이고 응용의 필요조건에 따라 변경될 수 있다. 다음 정보는 단지 지침서를 대표한다.
감염 전의 세포의 증식은 원심분리 또는 여과와 같은 보통의 지지 방법을 사용하여 관주 시스템에서 씨 배양 또는 작은 배양 용기로부터 수행될 수 있다. 그 러한 시스템에서 하루 당 3개의 발효기를 채우는 비율로 세포의 일차 배양동안에 배양 매체를 교체하는 것이 이롭다는 것이 증명되었다. 세포는 세포 밀도가 2×107될 때까지 증식될 수 있다. 배양하는 동안 세포수, 글루타민, 글루코스 또는 락테이트 양과 같은 변수를 수단으로 관주 비율을 바람직하게는 조정할 수 있다.
배치 시스템이 사용될 때, 37 ℃에서 약 8-25 ×105 세포/mL까지의 세포 밀도와 재생 시간 20 내지 30시간에 도달할 수 있다.
게다가, 세포는 본 발명에 따라 감염 전에 페드-배치 시스템에서 증식될 수 있다. 본 발명의 본문에서, 배양 시스템은 페드-배치 시스템이라 언급된다. 세포가 처음에 배치 시스템에서 배양하고 배지에서 양분(또는 양분의 일부)이 고갈되는 것은 농축된 양분의 조정된 피딩으로 보상된다. 페드-배치 시스템에서 세포는 약 1-10 ×106의 세포 밀도까지 증식될 수 있다.
감염 전에 세포를 증식하는 동안에 pH값 6.6과 pH 7.8 사이의 값 그리고 특별히 7.2와 pH 7.3 사이의 pH 값으로 배지의 pH값을 조정하는 것이 유익하다고 증명되었다.
감염 전에 세포를 30 내지 40 ℃사이의 온도 그리고 33 내지 37 ℃에서 배양한다. 감염 전에 배양하는 동안 25 내지 95% 그리고 특히 35 내지 60% 사이의 값에서 부분 산소 분압은 조정된다. 본 발명의 본문에서 언급된 부분 산소 분압 값은 대기의 포화에 근거한다.
본 발명에 따른 방법에서 배치-시스템에서 바람직하게는 8-25 ×105 세포/mL 또는 관주시스템에서 바람직하게는 5-20 ×106 세포/mL의 세포 농도에서 세포를 감염시키는 것이 이롭다고 증명되었다. 세포를 10-8내지 10, 배지의 pH값 0,0001 내지 0.5의 바이러스 투여량(MOI 값, "감염의 다양성"; 감염 시기에 세포당 바이러스 단위의 수에 대응)으로 감염시킬 수 있다.
배양 후에 관주, 배치 또는 Fed-배치 시스템에서 세포를 배양한다. 전에 사용된것과 같은 배양 조건이 사용될 수 있다(30 내지 40 ℃의 온도, 5% 내지 100%의 부분 산소 분압, pH 6.6 내지 pH 7.8의 배지의 pH값).
본 발명에 따른 바이러스 또는 바이러스에 의해 생성된 단백질의 수거와 분리를 포함하는 방법이 유용하다. 바이러스 또는 단백질을 분리하는 동안에, 세포는 분리, 여과 또는 미세여과와 같은 표준 방법으로 배양 배지로부터 분리된다. 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피와 같은 당업계의 능숙한 이에게 알려진 방법에 따라 바이러스 또는 단백질은 충분히 농축된다. 본 발명에 따르면 바이러스는 정제 동안 또는 후에 비활성화되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 정제 공정동안 어느 지점에서 β-프로피오락톤 또는 포름알데히드에 의해 바이러스는 비활성화된다.
본 발명에 따른 방법은 시약의 제조, 특히 백신과 진단제의 제조에 특히 적합하다.
시약의 제조는 바이러스 또는 단백질의 증식과 분리와 적절한 보조약, 보조 제, 버퍼, 희석제 및/또는 시약 담체와 혼합하는 것을 포함한다. 본 발명의 본문에서 보조약은 면역 반응을 증가시키는 물질을 의미하는 것으로 이해된다. 이들은 알루미늄 수산화물, 세균 세포 벽의 조성분, 기름 또는 사포닌과 같은 다양한 금속의 수산화물을 포함한다. 백신은 특히 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 적합하다.
로딩 감염이 있는 보호 실험 또는 중성화에 필요한 항체 적정의 결정과 같은 당업계에 능숙한 이에게 공지된 방법으로 대응하는 백신의 면역성 및/또는 효율성을 결정할 수 있다. 바이러스 적정, 혈응집 시험, 다른 유형의 항체 결정 또는 단백질 결정과 같은 당업계에 능숙한 이에게 공지된 표준 방법에 따른 항원의 적정 또는 양을 결정하여 생산된 바이러스의 양 또는 항체의 양을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 진단 조성분의 제조에 적합하다. 조성분은 방법에서 얻은 바이러스와 바이러스에 의해 생산된 단백질을 포함한다. 선행기술문에서 보편적인 첨가물과 검출시약을 조합하여, 이러한 조성분은 바이러스 또는 항바이러스 항체 검출에 적절한 진단 시험으로서 사용될 수 있다.
다음 실시예에서 모든 바이러스 적정물은 최종 희석 방법과 Spearman Kaerber에 따른 통계적 50% 종말점 결정에 따라 결정된다(참조 Horzinek, Compendium of general Viroloy, 2nd Edition, 1985, Parey Verlag, pp 22-33). 8 시험 배양물을 10-1 내지 10-8 의 바이러스 물질의 희석이 사용된 바이러스 희석 100 ㎕ 이 있는 미세적정 플레이트에서 감염시킨다. 시험 배양물로서 세포 독성 효과를 수단으로 현미경적으로 또는 바이러스 특이적 항체를 사용하는 면역 검출 방법으로 바이러스 적정물을 평가한다. 바이러스 특이적 항체의 결합은 플루오레신-라벨된 항체로 또는 침전가능한 염색약(Gregersen et al., Med. Microbiol. Immunol., 177: 91-100)과 바이오틴 라벨된 이차 항체와 스트렙타비딘/바이오틴/퍼옥시다아제 증폭제 복합체를 이용하여 면역형광성으로 가시화된다. 바이러스 적정의 단위는 배양물-감염 투여량50% (CID50)이다. 다른 유형의 바이러스에 사용되는 바이러스 특이적 검출 세포와 응용가능하면, 면역학적 검출 방법은 바이러스 특이적 실시예에 언급된다.
실시예1: 부착 배양물로서 세포 배양시스템의 조작
액체 질소에 저장된 씨드 세포 유리병 유래의 MDCK세포를 수욕에 담그어서 빨리 해동시키고 일반적으로 약 1 :100 인 약 1 × 105 세포/ml의 세포수를 가진 배양 배지(Ultra CHO with Supplement, BioWhittaker, Standard medium)에서 즉시 희석시킨다. 그다음 세포를 배지에서 분리하고 원심분리( 800G에서 10분)로 다시 신선한 배지에 모아 스피너 배양 플라스크(100㎖ 작동 부피, Bellco 또는 Techne)에 붓는다. 이러한 배양 일정량을 50-60 rpm으로 마그네틱 혼합기에서 37 ℃에서 배양한다. 세포 배양물을 세포수를 점검하여 조정한다. 최대 1.6 × 106 세포/ml에 대해 8 × 105의 세포수에 도달하면 신선한 표준 배지에 있는 세포를 희석하고 100 내지 1000㎖ 작동부피의 새로운 스피너 배양플라스크를 씨드하여 배양물을 이동하고 상기 기술된 바와 같이 혼합하는 동안 최대 또는 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 배양한다. 이러한 세포 경로에서, 대응하는 배양물의 희석은 1 : 4 내지 1 : 10의 범위에서 세포 성장의 유형에 맞게 변경시켜 3 내지 5일 내에 필요한 만큼의 최대 세포수에 도달하도록 한다. 대안책으로서 이러한 유형의 세포 배양물이 배지에 보충물을 첨가하지 않고 시도되었고 적어도 10 경로에 대한 문제없이 유지될 수 있다.
실시예2 : 부착 배양물로서 세포 배양시스템의 조작
설정된 진탕 배양물(실시예1 참조)은 다른 배지에서 희석되어 세포수는 약 1 × 105 세포/ml 이었고, 다양한 세포 배양 용기에 부었다(표 1 참조). 세포배양부피는 대응하는 배양용기 즉 씨딩 표면에 대해 약 4 mm 배양배지 또는 2.5 cm2 배양 표면에 대한 약 1㎖ 배지가 있는 보통 양에 대응한다. 배양물은 일반적으로 37 ℃에서 배양하지만 현저한 손실이 없는 배양 온도의 현저한 편차는 또한 가능하다(표 1 참조). 시험된 배양 시스템과 이들로 달성된 세포 성장에서 결과는 표 1 에 제시되어 있고 세포 시스템은 대략 같게 행동하고 다양한 배지와 배양 시스템에서 강건하게 행동한다는 것을 나타낸다.
이러한 방식으로 생산된 단일층-배양물을 미세적정 플레이트에서 바이러스 수거물을 적정하고 현미경 조절하에서 바이러스의 배양 또는 면역형광성 조사, 혈흡수 시험과 진탕 배양에서보다 부착 단일층배양에서 더 잘 수행될 수 있는 다른 바이러스학 또는 면역학적 표준 방법에 사용한다. 추가로, 그러한 배양물은 플라그 정제 또는 희석에 의해 순수 바이러스 계통을 회복하는데 특히 적절하다. 최종적으로, 부착 배양물은 작고 큰 규모로 바람직하게는 롤러병에서 많은 양의 바이러스 증식에 또한 사용된다.
Figure 112004010348824-pct00001
실시예3 : 씨드 바이러스 제조물의 바이러스 분리, 회복, 생산
바이러스 함유 기관, 조직 또는 조직액 표본, 인후 면봉, 대변 샘플과 같은 일차 분리체를 항생제(PSN: 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 50 ㎍/mL 네오마이신)를 첨가하여 표준배지 (다른 배지 또는 인산 버퍼도 가능하다)에 있는 아이스 수욕에 현탁시키고 필요하면 (막자사발, 외과용 메스 또는 Douncer 또는 Potter Homogenizer로 곱게 갈은)동질화한다. 획득한 진탕을 구멍크기가 0.45 ㎛인 (작고 코팅되지 않은 바이러스의 분리를 위해서는 0.2 ㎛) 보통 실험실 주사기 필터 어댑터로 여과한다. 여과액을 신선한 배양배지가 있는 작은 배양 플라스크 (25 cm, 실시예2 참조)에 접종한다. 수율을 증가시키기 위해서, 여러가지 배양물에 100 ㎕ 내지 1㎖의 접종원을 제공하고 37 ℃ 에서 배양한다. 상위 호흡 경로로부터 바이러스 분리체에 대해 추가 배양물을 낮은 배양 온도 33 ℃에서 준비하는 것이 추천할 만하다.
배양물에서 이미 증식한 순수 바이러스 분리체는 본발명의 실시예1 또는 2 에 따른 배양 시스템에서 직접 감염시키기 위해 사용된다. 하지만, 바이러스 조제물의 많은 바이러스 양이 여기서 추정될 수 있기 때문에, 100 ㎕또는 그 이하의 적은 접종양이 일반적으로 사용된다. 본 발명에 따른 배양 시스템에서 0.1과 0.01의 MOI (감염의 다수성)가 바람직하다. 결과가 만족스럽지 않을 때 MOI로 감염시키는 단계에서 10 부터 0,0001까지 인자 10으로 감소시키는 것이 반복된다.
감염된 배양물을 바이러스 관련된 세포 손상(CPE, 세포독성 효과) 에 대해 매일 현미경으로 검사하고 대조구 배양물과 비교한다. CPE를 야기하지 않는 바이러스에서 대안책으로서, 특이적 바이러스 항원 또는 이들의 유전자가 존재하는지(즉 바이러스 유형에 따른 특정 HA 시험; ELISA, PCR)로 검사한다. 3 내지 4 일 또 는 양성 결과(세포의 수축, 세포 죽음, 부착 배양물에 깔린 세포의 회전과 용해, 플라그 형성)후, 세포가 없는 원심분리된 배양 상청액은 샘플로서 동결되고 반면에 음성 또는 의심스런 결과가 나오면 전체 배양물을 세포수 1 ×105 세포로 신선한 배지로 조정하고 (진탕 배양물의 희석 또는 부착성 배양물을 각 세포의 후속하는 희석으로 트립신 처리) 새로운 배양물에서 더 배양한다. 이는 대부분의 배지에서 배양물을 1 : 4 내지 1 : 20 으로 희석하는 것과 대응하기 때문에 배양물의 수 증식의 대수 증식을 회피하기 위해서 그러한 배양물의 두번째 통과 후에 가능한 배양물의 최소한 오직 일부만 더 유지된다. 3-4번 더 경과한 후, 바이러스 분리체는 더 성공적으로 분리될 수 있고 적절한 바이러스 함유 시작물질로부터 검출될 수 있다.
대부분의 바이러스 유형에 대해서, 바이러스 양과 시작 물질의 질에 따라 바이러스 관련된 CPE는 배양후 2-7일 후 발견된다(바이러스 특이적 예 참조). 일부 바이러스는 ,하지만, 매우 느리게 증식하거나 CPE를 나타내지 않고 통과와 배양시간 또는 특정 시험을 연장하여 검출될 수 있다(필요한 방법은 특정 바이러스 실시예 아래에 작성되어 있다). 특별한 검출 시스템이 필요한 느리게 증식하고 CPE를 나타내지 않는 바이러스의 실시예로서, 간염 A 바이러스의 특별한 실시예가 언급된다. 여기에 기술된 검출 시험은 대응하는 항혈청을 사용할 때 다른 바이러스 특히 특정 CPE가 없는 것들의 검출에도 적절하다.
실용적으로, 새로 분리된 바이러스는 3배 플라그 정제 또는 제한된 희석 기 술에 의한 순수 분리물의 제조 후에 사용되어야 한다. 이에 필요한 방법은 선행 기술문에 따른 전문가의 교재로부터 인용한 것이다(B.W. Mahy: Virology- A practical approach; IRL Press, Oxford, 1985 참조).
적절한 바이러스 제조물이 일차 분리주로부터 또는 설정된 계통으로서 유용하다면, 생산 목적으로 동종 씨드 바이러스를 회복하기 위해서 이들은 스피너 배양물의 감염에 사용한다. 본 발명의 목적에 제한하지 않고. 첫번째 감염은 10 내지 0.00001, 바람직하게는 0.1 내지 0.0001의 MOI를 가진 100㎖ 배양 배지가 있는 작은 스피너 배양에서 처음에 권장된다. 선행기술된 생산 규모와 생산 작동수에 따라 추가적 바이러스 통과에서 필요한 크기의 배양 시스템의 씨드 바이러스를 생성하기 위해서 더 빠르고 높은 바이러스 값을 달성하기 위한 가장 바람직한 조건(특히 MOI와 수거 시간을 참고로)과 수익율이 선정되었다. 달성된 바이러스 수율과 기술된 생성 시간에 따라, 씨드 바이러스 통과의 규모는 소수의 스피너 배양부터 1000mL 규모 또는 작은 발효기부터 대략 10ℓ부피 또는 그이상이 될 수 있다. 수거된 바이러스는 여과 또는 원심분리로 세포 잔여물이 없고 생산에 적합한 적은 양으로 나누어서 가능하면 -70 ℃이하의 온도에서 저장한다.
실시예4: 생성 목적으로 부착 미세담체 배양물로서 시스템의 조작
부착성 MDCK세포를 실시예2와 표 1에 따라 BME 와 3% 소태아혈청 (FCS)이 있는 롤러 병에서 배양한다. 이러한 시스템에서 배양한 후 세포를 롤러병의 표면으로부터 분리한다. 당업계에서 능숙한 이에게 알려진 보통방법으로 적절한 트립신 용액으로 효소적으로 발생한다. 실시예1에 따른 대안책으로서, 진탕 세포는 스피 너 배양물에서 배양하고 미세담체를 직접 덮기 위해 사용된다.
생성 발효기는 Cytodex 3 유형의 미세담체로 채워져 있다(Pharmacia). 미세담체 (특정 무게 5ｇ/L)를 가압멸균하고 영양 배지로 조정한다. 방법은 세포를 미세담체의 표면에 부착하는 것을 보장한다. 이러한 방식으로 회복된 세포는 생산 시스템으로 이동되어 세포 밀도는 1 ×105 세포/mL이었다. 세포는 미세담체에 부착하였고 합류할때까지 또는 세포 밀도 3 ×106 세포/mL 를 달성하기 위해 배양하였다. 세포 배양단계 후에, 존재하는 영양배지는 신선한 영양 배지로 치환되었다. 이 목적으로, 단백질 없는 영양배지가 사용되었다. 2번 세척 싸이클을 작동하였다. 세척 싸이클은 교반기를 끄는 것, 미세담체를 설치, 소비된 영양배지의 제거, 신선한 영양배지의 첨가, 미세담체의 재현탁으로 구성되어 있다. 세척 단계 후, 세포 배양물을 트립신 (2.5 mg/L)과 혼합한다.
씨드바이러스로 세포 배양물을 감염시킨다. 이러한 씨드바이러스는 실시예3에 따라 획득되고 사용된다. MOI는 바이러스 특이적이고 값 0.01 내지 0.0001에 바람직하게는 값 0.01 내지 0.0001에 해당한다. 감염 단계 후, 감염 단계 시간은 특정 바이러스 (특정 예 참조)에 의해 결정되고 반면에 선택된 MOI에 의해 결정되어 교반기는 멈추고 미세담체는 침전하였다. 바이러스 함유 상청액을 분리하고 적절한 분리방법으로 세포 잔여물로부터 정제한다. 세포 분리를 위해서, 당업계에 알려진 보통 원심분리기 또는 분리기, 필터와 교차흐름 여과 단위가 사용된다.
실시예 5: 혈청없는 배지를 사용하여 생성부피 1000L 규모까지 진탕배양물로 서 시스템의 조작
생성부피 1000 L 진탕배양물을 작은 규모에서 1000㎖ 배양부피까지 스피너 병(Techne Co.)에서 배양한다(실시예1 참조). 스피너에서 세포 밀도는 1 ×105 세포/mL이었다. 세포를 배치 공정에서 배양하고 세포 밀도 1 ×106 세포/mL에서 신선한 배지에서 1 : 10 비율로 단순 희석에 의해 이동되었다. 혈청없는 배지 (UltraCHO, Biowhittaker)는 세포 배양에 대한 배지로 사용되었다. 부피 10 L로부터 영구적 변경과 온도 조정(세포 배양에 대한 조정 온도37 ℃), pH값(조정 범위 7.1 내지 7.3)과 산소 부분 압력(45 내지 55% pO2)을 갖춘 혼합된 발효기(분 당 30 혼합기 회전)가 사용된다(기술적 세부사항은 표 2 참조). 이동 비율 1 : 10 에 따르면 대규모 부피는 10 L, 100 L, 1000 L이다. 발효기는 최종 세포 밀도 1 ×106 세포/mL에 도달하고 3-4 일 후 초기 세포 밀도 1 ×105 세포/mL에 도달하였다. 1000 L 규모에서, 세포 밀도를 3 ×106 세포/mL로 증가시키기 위해서 Fed-배치는 글루코스 용액(100-200 g/L)으로 추가적으로 수행된다. 달성된 세포 수율은 표 2 와 비교하여 제시된다.
실시예6 : 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 생성부피 1000L 규모까지 진탕배양물로서 시스템의 조작
부피 1000 L를 생산하기 위해 진탕 배양물을 실시예5에 기술된 바와 같이 배양한다. 반면에, 화학적으로 정의된 배지(ProCHO4CDM)는 세포 배양의 대안책으로 사용된다. 이러한 배지에 맞게 바꾸기 위해서 3 내지 5번 수행하는 것이 유익하다. 달성된 세포 수율은 표 2 에서 비교된다.
실시예7: 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 생성부피 1000L 규모까지 진탕배양물로서 시스템의 조작
부피 1000 L를 생산하기 위해 진탕 배양물을 실시예5에 기술된 바와 같이 배양한다. 단백질없는 배지(SMIF7, Life Technologies)는 세포 배양물의 배지로 사용된다. 이러한 배지에 맞게 바꾸기 위해서 5 내지 10번 선통과를 작동하는 것이 유익하다. 달성된 세포 수율은 표 2 에서 비교된다.
Figure 112004010348824-pct00002
실시예8: 혈청없는 배지로 생성단계에서 시스템의 조작
실시예5에 따라 진탕 배양물을 생산규모로 배양한 후, 세포를 동등한 부피 3 ×1000 L 인 3개의 발효기에 분배하고 신선한 배지로 채웠다. 각 발효기는 선배양물의 1/3 부피와 신선한 배지의 2/3 부피를 받았다. 배양단계와 같은 배지가 사용되었다(UltraCHO, BioWhittaker). 채운 후, 세포 배양물을 트립신 10 mg/L와 혼합하였다. 씨드바이러스(인플루엔자 B/Harbin/7/94)로 세포 배양물을 MOI 0.001에서 감염시키고 33 ℃에서 96 시간 동안 세포 배양과 같은 발효조건에서 더 배양 한다. 세포 함유 상청액을 분리하고 세포를 분리기로 분리하였다. 추가적 여과 단계를 구멍 크기 0.45 ㎛ 인 카틀리지 필터를 통해서 추가적 미세 입자를 분리한다.
바이러스 수거물은 0. 5% 닭 적혈구로 HA 시험하고 부착성 MDCK세포에서 바이러스 적정하여 표준방법으로 바이러스 양에 대해 시험하였다: 측정된 HA양은 1024 유닛, 바이러스 적정은 108.2 CID50/mL이었다.
실시예9 : 화학적으로 정의된 배지로 생성 단계에서 시스템의 조작
실시예8에 기술된 바와 같이 생성세포를 제조한다. 하지만, 화학적으로 정의된 배지(ProCHO4CDM, BioWhittaker)를 신선한 배지로 사용한다. 채운 후에, 세포 배양을 2.5 mg/L 트립신으로 혼합하였다. 후속하는 감염을 실시예8에 기술된 바와 같이 수행하였다. 측정된 HA양은 1024U이고 바이러스 적정은 107.5 CID50/mL이다.
실시예10 : 단백질없는 배지로 생성단계에서 시스템의 조작
실시예8에 기술된 바와 같이 생성세포를 제조하였다. 하지만, 단백질없는 배지 (SMIF7, Life Technologies)가 신선한 배지로 사용되었다. 채운 후, 세포 배양을 2.5 mg/L 트립신으로 혼합하였다.
후속하는 감염을 실시예8에 기술된 바와 같이 수행하였다. 측정된 HA양은 1024U이고, 바이러스는 적정 농도 107.9 CID50/mL이었다.
실시예11: 화학적으로 정의된 배지로 배양하고 감염
실시예6에 기술된 바와 같이 세포를 배양하고, 실시예9에 기술된 바와 같이 감염시켰다. 감염된 배양물로부터 수거한 전체 세포를 화학적으로 정의된 배지에서 배양한다.
실시예12 : 화학적으로 정의된 배지로 배양하고 단백질 없는 배지에서 감염
실시예6 에 기술된 바와 같이 화학적으로 정의된 배지에서 세포를 배양하고 실시예10 에 기술된 바와 같이 단백질 없는 배지에서 감염시킨다.
실시예13 : 단백질없는 배지에서 배양하고 감염
실시예7에 기술된 바와 같이 세포를 배양하고 실시예10에 기술된 바와 같이 감염시킨다. 감염의 배양부터 수거까지 전체 세포를 단백질없는 배지에서 배양한다.
실시예14 : 바이러스 정제의 일반적인 기술
바이러스 증식 단계를 종결한 후에, 세포와 세포 단편을 분리하기 위해서 세포 배양 수확물을 구멍크기가 0.45 또는 0.5 ㎛ 인 깊은 베드 필터를 통해서 여과한다. 대안책으로서, 이러한 분리는 분리기로 수행한다. 정제된 수거물에 포함된 바이러스는 필요하면 격리 한계가 50,000 내지 1,000,000, 바람직하게는 100,000 내지 500,000 인 막을 사용하는 초원심분리으로 농축하고 정제하였다. 획득한 바이러스 농축물을 CS (Cellufine Sulfate, Millipore)으로 찬 크로마토그래피 칼럼에 로드한다. 오염물을 버퍼로 세척하여 제거한 후, 바이러스를 0.3 내지 3 M NaCl 용액으로 세척하였다. 용출물을 초원심분리으로 탈염하고 더 농축하였다. 대안책 또는 크로마토그래피 정제와 조합하여, 초원심분리으로 추가 정제 효과를 달성할 수 있다. 대부분의 바이러스를 구배를 후속 분획하여 수크로스 밀도 구배 원심분리로 부력 밀도에 따라 정제할 수 있다. 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤으로 바이러스 비활성화는 정제 단계내의 어느 지점에서도 도입될 수 있지만, 비활성화된 부피는 실질적으로 감소되었기 때문에 바람직하게는 농축후 또는 정제후에 사용된다.
실시예15 : 백신을 제제하기 위한 비활성화된 순수 바이러스 제조물의 회복
실시예 5, 6, 7 에 따라 플라비바이러스(중유럽 뇌염 바이러스, 계통K 23)를 0.2 MOI 접종 농도에서 다른 배지에서 배양하였다(세부사항은 실시예22 참조).
수거된 바이러스를 포함한 배양배지는 원심분리와 구멍 크기 0.45 ㎛인 필터를 통한 여과에 의해 생긴 세포 잔여물이 없었다. 안정성 이유로, 이 물질은 1 : 2000 또는 1 : 2500으로 희석하여 β-프로피오락톤을 첨가하고 2-8 ℃ 에서 24 시간동안 배양하여 여과한 후 비활성화되었다. 비활성화제를 37 ℃에서 2시간동안 가수분해한 후 비활성화된 제조물을 세포 배양시험에 의하면 0.03 감염성 유닛/mL 보다 적은 검출 한계까지 활성적 바이러스는 나타나지 않았다.
후속하는 정제 단계를 분석하기 위해서, 전체 단백질양을 결정하기 위해서 BCA[바이신코닉 산]검정 (Pierce)을 사용하였다. 특정 항원양은 E-당단백질 (Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38: 141-149)에 대한 특정 단일클론 항체와 토끼에서 정제된 바이러스에 대해 생산된 다클론 항혈청을 사용하여 샌드위치 ELISA로 결정하였다. 비활성화된 시작물질에 대한 값이 기준값으로 사용되었다(100%에 대응).
원심분리로 정제:
비활성화된 바이러스 제조물을 밀도 구배 초원심분리 (15-60% 수크로스)으로 80,000G에서 알려진 방법에 따라 정제하였다. 구배를 그다음 분획하고 분획물의 샘플에서 바이러스 피크를 확인하기 위해서 분획물의 표본 280 nm에서 흡광을 결정하였다. 흡광에서 급격한 증가는 30 내지 40% 의 수크로스 농도 지역에서 발견되었고 최대값은 34과 35%에서 나왔다. 이 지역으로부터, 특정 바이러스 단백질의 많은 양과 높은 순도 (전체 단백질에 대한 바이러스 단백질의 비율로 결정된) 도 또한 측정되었다. 시작물질에서 결정된 특정 항원 양의 50% 이상이 피크 부분에서 회복되었다.
크로마토그래피 정제:
비활성화된 바이러스 제조물(상기 참조)을 50 mM 인산 버퍼, pH 7.5의 다섯 칼럼 부피로 평형을 이룬 CS 칼럼에 적용시킨다. 비결합된 물질을 제거하기 위해 인산 버퍼 10 칼럼 부피로 세척하였다. 결합된 물질을 3 M NaCl을 첨가하여 같은 버퍼의 많은 양을 단계별로 혼합하여 같은 인산 버퍼로 용출한다. 특정 항원의 3.2 내지 3.9% 와 전체 단백질의 79 내지 83%이 바이러스 물질을 응용하는 동안에 흐름에서 분석적으로 회복되었다. 세척 버퍼에서, 전체 단백질의 6-11% 와 항원의 0-2.3% 가 발견되었다. 항원의 95% 이상이 컬럼 물질에 결합한다. 0.6 내지 1.8 M NaCl로 용출하는 동안 항원의 약 60.0% 이 회복되었고, 1.2 M NaCl로 용출하는 동안 가장 높은 순도가 달성되었다. 3 M NaCl까지 높은 염농도로 특정 순도가 낮 은 항원의 추가적 적은양(< 15%)을 용출하였다.
크로마토그래피와 초원심분리을 조합하여 정제:
0.6과 1.2 M NaCl용출 후에 조합된 용출물은 2.5 시간동안 80,000 G에서 초미세여과하였다. 바이러스 펠릿을 50 mM 인산 버퍼 pH7.5에서 재현탁하고 분석한다. 이 조제물의 전체 단백질 농도는 초기양의 0.7% 으로 감소되고 순도의 정도는 이 단계에서 10배 증가하였다.
이러한 바이러스 조제물을 상기 기술된 바와 같이 구배 정제하였다. 분획한 후, 직접 구배 정제한 후 달성된 바와 같은 매우 유사한 구배 프로필을 발견하였다. 하지만, 바이러스 피크의 정상은 약간 이동하였고 지금은 37% 수크로스이다.
실시예16 : 바이러스 분리주의 회복과 인간 허피스바이러스의 바이러스 증식
튜버큘린 주사기가 있는 물집 단계(입술 허피스-물집)에서 신선한 허피스 발진의 멸균 구멍으로 조직액 최소량을 획득하고 항생제를 첨가하고 구멍크기가 0.45 ㎛인 필터를 사용하여 여과하여 표준배지에서 실시예3에 따라 현탁하였다. 여과된 물질을 표준배지에 부착성 MDCK 33016 세포가 있고 배양 표면이 25 cm2 인 배양 플라스크에 접종하고 37 ℃에서 배양한다. 4일 후 상청액 샘플을 얻고 7일 후 배양물의 전체 상청액을 얻어 -70 ℃ 이하에서 얼린다. 4일 후에 얻은 샘플을 1 : 10로 희석하고 10 ㎍/mL 트립신을 포함하는 표준배지에서 10단계에 있다. 이러한 희석액 100 ㎕을 표준배지에 있는 MDCK 33016 세포로 도입한다. 37 ℃에서 배양한 13일 후에, 첫번째 배양 단계의 소수 배양물에서 CPE가 발견되었다. 이러 한 배양물의 상청액을 수거하고 다시 희석하여 새로운 배양물에 접종하였다. 6-9일 후에 더 분명한 CPE가 전형적 허피스 바이러스 플라그로서 이 세번째 바이러스 통과의 여러 희석 단계에서 발견되었다. 175 cm2 배양 표면의 같은 시작물질을 가진 직접적으로 감염된 배양물은 배타적으로 같은 전형적 플라그를 보였다. 배양 상청액을 수거하는 것에 추가로, 16 시간동안 3% 포름알데히드용액으로 남아있는 세포를 고정한 후 30 분 동안 1% Triton ×-100으로 배양하고 특정 HSV-1에 대한 FITC-라벨된 단일클론 항체로 표준방법에 따라 면역형광 조사를 한다(Biosoft Produktnummer 17-088). 플라그 영역에 있는 세포만 면역형광성을 가진 것이 발견되었다. 이 검증과 특이적 PCR 검정으로, 분리주는 허피스 단순 바이러스 1으로 확인되었다.
클론된 바이러스를 진탕 배양물의 표준배지에서 더 증식하고 실시예3에 기술된 바와 같이 충분한 바이러스 적정(> 10 감염성 유닛/mL)에서 씨드 바이러스를 생산하기 위해 사용한다. 씨드 바이러스 제조물은 바이러스 적정 값 107내지 108 CID50/mL을 포함한다. 당업계에서 능숙한 이에게 알려진 방법에 따라 HEP-2또는 베로 세포에서 바이러스 적정물을 결정하지만 적정물의 평가가 전형적인 플라그에 대해 수행되는 부착성 MDCK세포에서도 결정할 수 있다. 씨드바이러스 제조물 은 -70 ℃ 또는 그 이하에서 일정량으로 나누어 얼리고 생성세포의 감염에 사용된다. 대응하는 산물을 등록하는 동안 문서화 요구는 현저히 감소하고 씨드바이러스의 수용이 개선되었기 때문에 후생산에 대해 배지와 첨가물의 견지에서 같은 MDCK세포와 배양 조건을 사용하는 가능성은 중요한 잇점이다.
실시예17: 인간 허피스바이러스의 생성
실시예 8 내지 13에 따라 허피스 단순바이러스 1(선행하는 실시예에서 분리체로 기술된)으로 생성세포의 감염에 대해 MOI 0.1 내지 0.01과 수거후 배양시간 48 내지 96 시간이 선택되었다. 하지만, 최적 수거 시간이 항상 발견되지는 않기 때문에 수율이 변할 수 있는 배양시간이 더 길거나 짧은, 높거나 낮은 MOI가 또한 사용될 수 있다. 일반적으로, 경제적 이유와 후속하는 작동을 촉진시키기 위한 배양수율은 현저하게 108이하, 50% 배양-감염성 유닛/mL (CID50/mL)가 되도록 앞에서 언급된 조건은 바람직하다. 이 이상으로, 이 시간 계획은 정상적 작동 리듬에서 변경될 수 있다. 0.0001이하의 낮은 MOI와 연장된 배양 시간으로 항상 수율이 낮기 때문에 차선이다.
실시예18 : 플라비바이러스의 증식
세포 밀도가 1-1.5 ×106 세포/mL인 MDCK 33016 세포의 진탕배양물을 중앙 유럽 뇌염 바이러스 (계통 K23, Niedrig et al., 1994, Acta ViroLogica 38: 141-149)로 표준 조건(표준배지, 37 ℃ 배양과 감염온도)에서 감염시킨다. 이전 실시예로부터 벗어나서, 매우 가변적인 MOI가 감염에서 사용된다. 게다가, 감염 배양물이 화학적으로 정의된 배지 또는 단백질 함유 첨가물이 없는 배지에서 부분적으로 보관되었다. 다른 변수가 변하여도 높은 수율이 시스템으로 달성될 수 있고 복합 수가가 가능하다는 것을 보여주는 다른 배양과 수거 방법이 사용되었다. 이 러한 변화는 표 3 에 요약되어 있다. 바이러스는 A 549세포 (ECACC Nr. 86012804)에서 적정되었고 CPE를 참고하여 5 일 후에 평가되었다. 각 수거동안에 세포에 새로운 배지가 공급되고 더 자랄수 있도록 같은 배양물의 반복된 수거는 배양 배지의 교환과 수반한다는 사실은 주목할 만하다. 이러한 수거없이, 배양물은 활성적으로 남아있지 않고 긴 기간동안 생산적이다. 짧은 간격으로 자주 배지를 교환하는 것이 배양물의 높은 대사 산물을 보상할 수 없기 때문에, 감염 시간의 4또는5일 후에 추가 배지 첨가물과 배양물이 증가한다.
Figure 112004010348824-pct00003
실시예19 :피코르나 바이러스의 증식
5% 소태아혈청과 중탄산염(실시예2 참조)를 첨가한 MEM-배지에서 간염 A바이러스 (HAV, 계통 HM 175, ATCC VR-1358)로 간염시키는 동안 부착성 MDCK-33016 배양물을 배양한다(실시예2 참조). 실험의 본문에서, 추가적 "Munich" 바이러스 분리체가 사용되었다(Frosner et al. 1979; Infection 7: 303-305참조). 희석된 바이러스를 신선하게 제조된 배양물에 접종하고 37 ℃에서 배양한다. 배양물을 3내지 4일동안 교대로 순환하며 1 : 4 로 더 통과시킨다. MDCK-33016 세포의 진탕 배양물을 실시예1에 따라 표준배지에서 배양하고 HM 175 로 접종한 후 33 ℃에서 더 배양하고 매주 1 : 10 통과시킨다. 진탕 배양물에 있는 부착성 세포를 35일동안 감염시킨 후 더 유지한다. 활성 바이러스 복제를 CPE (계통 HM 175)를 수단으로 또는 이미 기술된 방법(바이러스 적정, Seite 93 in Gregersen et al. 1988; Med. MicroBiol. ImmunoL. 177: 91-100 참조)에 따라 검출한다. 정제된 IgG로서 항-HAV 항체는 편위로서 바이러스 특이적 항체로 사용된다(F 86012로 지정, Dade Behring에 의해 공급). 산물 No. 39015 (Sigma Co.)이 바이오틴 라벨이 있는 항-인간 IgG로서 사용된다. 이러한 시스템으로 활성적 바이러스 증식의 특이적 검출로 현미경에서 낮은 비율로 인식할 수 있는 갈색-분홍색이 나타나는 세포를 생성한다. 반면에, 바이러스-음성 세포는 색이 나타나지 않거나 엷은 색만 나타난다. 제조 후 3주에서 바이러스 적정하는 것은 인간 이배수체 세포(MRC-5)가 배양시스템으로 사용되는, 같은 검출 방법으로 평가된다.
상기 기술된 모든 감염 지역에서, 양 바이러스 분리주를 사용하여, 활성적 HAV-복제가 MDCK세포에서 검출될 수 있다. 매우 빠른 바이러스 복제가 진탕배양물에서 계통 HM 175으로 검출되었다. 감염 후 7일에, 상청액에서 측정된 바이러스 적정물은 105.4 CID50/mL이고; 이러한 배양물을 단순 희석으로 매주 1 : 10 통과시키고 7일 후 형성된 배양물에서 유사한 바이러스 적정물을 생성하였다. 배양 후 그리고 2개의 추가적인 세포 통과 후, 세포가 없는 배지의 하나의 표본에서 바이러스 적정물이 결정되었다. 전체 배양물의 표본을 가지고 여기에 담긴 세포를 -20 ℃에서 2배로 얼리고 해동하여 파괴하였다. 세포가 적정되기 전에 세포 조성분을 원심분리로 제거한다. 이 지역에서 획득한 바이러스 수율은 표 4 에 요약되어 있고 특정 수율에 부작용이 없이 매주 양이 많이 증가하여도 부피당 상당한 바이러스 적정물을 수거할 수 있는 배양물의 10배 증식이 가능하다는 것을 제시한다. 세포가 결합한 바이러스에 대해서도 놀라운 바이러스의 상당한 부분이 상청액에서 발견된다(표 4 참조).
Figure 112004010348824-pct00004
실시예20: 랍도바이러스의 증식
실시예1에 따라 표준배지에서 진탕 배양물이 배지의 ㎖당 1 ×106 세포 밀도를 가진 세포 배양병에 씨드되었다. 배양물을 키운 후, 2개의 배양물을 MOI가 0.01이고 MOI가 0.001인 하나의 배양물이 있는 광견병 바이러스(계통 Pitman-Moore, 백신 바이러스 계통 )으로 감염시켰다. 배양물을 37 ℃에서 배양하고 트립신으로 4 또는 3 일 간격으로 분리한후 1 : 10 비율 또는 1 : 8 비율( 3 일 후)로 통과시키고(4 일 후) 이러한 방식으로 18 일 동안 유지한다(표 5 참조). 감염 성공은 각 통과에서 후속한다. 배양물에 3.5% 포르말린 용액이 제공되고 실온에서 용액에서 3일동안 배양한다. 포르말린 용액을 제거한 후, 배양물을 PBS로 3번 세척하고 PBS에 있는 1% Triton X100으로 실온에서 25 분 동안 배양한다. 용액을 제거한 후 이것을 PBS로 3번 씻고 광견병 바이러스에 대한 FITC-라벨된 항체(50 ㎕ 1 : 400 희석된 토끼 항광견병 IgG FITC, Dade Behring, OSHY 005)를 적용하였다. 37 ℃에서 90 분 배양한 후, 이것을 PBS로 다시 씻고 배양물을 역전된 형광성 현미경으로 평가하였다.
대안책으로서, 상기 기술된 바와 같이 포르말린/트리톤 전처리한 후 면역형광법으로 평가된 MRC-5 세포에서 표준방법에 따라 배양물 상청액의 바이러스 적정을 수행한다. 이러한 시스템으로 달성된 바이러스 적정물을 수단으로, 배양물 수거의 ㎖당 얼마나 많은 백신 항원이 함유되어 있는가에 대한 배향을 허용하는 인간백신 (Rabivac)에 대한 MRC-5 배양물을 사용하여 대응하는 생산 방법에서 수율과의 상호 관계를 설정하였다(표 5 참조).
4일 후, 일정량 (MOI 0,01과 0,001)은 양성 결과와 유사한 감염 경로를 보였지만, 낮은 MOI에서 감염 경로- 약 1,2 내지 0,5 Log CID50에서 11일까지 적은 바이러스 적정물에서 인식가능한-는 약간 감소하였다. 11일에 배양물의 세번째 통과부터, 초기 세포 파괴된 매우 강한 특이적 면역형광성이 모든 배양물에서 발견되었고 대부분의 세포가 18일에 다섯번째 통과에 의해 파괴될 때까지 면역형광성이 더 증가하여 감염이 종결되었다. 특정 바이러스의 양은 지속적으로 14일까지 증가하여 세포 파괴가 증가한 결과로 다시 감소하였다. 이 감염 경로의 결과는 다음 표에 요약되어 있고 적정 간격으로 그리고 반복적으로 세포의 재증식을 지속하여도 적응이 없는 매우 빠른 바이러스 증식(광견병 바이러스의 알려진 느린 바이러스 증식에서 측정된)이 항원 수율이 높게 수거될 수 있는 이러한 세포에서 예상된다는 것을 제시하였다.
Figure 112004010348824-pct00005
유사한 방식으로, 0.0001 의 MOI가 추가적으로 사용되는 실시예1에 따라 같은 바이러스를 직접 진탕 배양물에 접종한다. 표준 배지가 전체 감염 경로에서 사 용되었고 배양물은 1 : 8 또는 1 : 10 비율로 일주일에 두번 이동되었다. 신선한 배지에 있는 세포를 단순 희석하고 씨딩을 새롭게 하여 이동한다. 상기 기술된 바와 같이 MRC-5세포에서 바이러스 적정에 대해 감염 성공은 후속한다. 4일 후 모든 세 개의 MOI에서 감염은 배양물 상청액에서 양성 바이러스 적정을 산출했다. 통과에서 통과로 7일 후 초기 희석 손실 후 바이러스 적정물은 상승하였다. 다시 수행된 기하급수적 희석에도 불구하고 진탕 배양물에서 대량의 세포 파괴가 나타나지 않았다. 감염은 8번째 통과까지 후속하였고 (감염 후 28일) 다시 중단되었다.
이러한 감염으로부터 바이러스 표본은 씨드 바이러스로 동결되었고 표준 배지에서 그리고 상기 기술된 바와 같이 같은 통과 조건에서 100㎖로 시작하는 진탕 배양물의 새로운 감염에 대해 사용되었다. 이 경우에 MOI는 0.000025으로 감소하였다. 감염은 6 세포 통과(21 일)동안 유지되었다. 배양물 상청액의 ㎖ 당 약 0.3 백신 투여량을 보인 전환된 바이러스 적정물은 거대한 통과 희석에도 불구하고 천천히 증가하는 바이러스 적정물을 가진 이 감염 경로의 말에서 측정되었다. 전체 배양물 부피와 이의 일부가 아닌 것이 다른 통과를 통과했었다면, 배양물의 약 150,000 백신 투여량에 대응하는 바이러스 수확물인 약 500 L가 6통과 후에 수거될 수 있을 것이다.
실시예21: 파라믹소바이러스의 증식
파라믹소바이러스의 대표로서, ATCC VR-288 계통이 사용되었다. 바이러스가 매우 빠르게 복제하기 때문에 세번째 날이 수거하는 시간으로 선택되었다. MDCK 33016 세포는 또한 혈청이나 바이러스 첨가가 없고 중탄산염이 있는 MEM배지에서 더 효율적인 바이러스 복제가 되는 파라믹소바이러스에 대한 적절한 적정 시스템인 것으로 증명되었다.
5일 후에 평가를 하고 적정하였다. 37℃에서 감염 후 더 배양된 배양물은 107.4CID50/㎖의 수율을 보였고; 감염 온도가 감염 시간 지점으로부터 33℃로 감소한다면 같은 적정물이 측정되었다.
이 바이러스로 부착 배양물과 진탕 배양물을 직접 비교한다. 부착 배양물에서 최대 수율은 감염 시간 96h 후 106.6CID50/㎖, 진탕 배양물은 비교하여 더 좋은 결과를 보였고 72시간 후 107.3CID50/㎖의 더 많은 수율을 보였다.
대안책으로서, 실시예2에 따른 부착성 MDCK 33016 세포는 5% FCS가 있는 MEM배지로 같은 집단(PI-3, ATCC VR-93)의 다른 바이러스로 감염시켰다. 37℃에서 1주일동안 배양한 후, 상청액은 CV-1세포(ECACC 87032605)에서 적정한 후 약 106 CID50/㎖을 함유하고 기니픽 적혈구로 양성적혈구응집과 특정 항체(Biosoft Co.에서 유래한 항-PI-3 MAb-FICT)로 양성 면역형광성을 보였다.
같은 바이러스 계통(PI-3, ATCC VR-93)을 MDCK 33016 배양물에서 감염시키는 동안 실시예12와 같은 유사한 방식으로 화학적으로 정의되고 단백질이 없는 배지에서 사용되었다. 감염일 3,5,9,12일에, 배양물 부피의 22%가 제거되고 신선한 배지로 대체되었다. 7일에, 세포를 포함한 배양물 배지의 50%가 제거되고 새로운 배지 로 대체되었다. 전체적으로, 감염동안 배양물 부피는 완전히 한 번 이상 교체되었고 배지 보충으로 희석에 따라 세포를 더 증식시킬 수 있는 기회를 제공하였다. 사용된 방법은 전체적으로 오직 초과량만 제거되는 배양물의 1:2:4통과에 대응한다. 특히 초기상에서 가능한, 배양물의 상당히 높은 통과 또는 희석은 여기서 완전히 사용되지 않았다.
다음 바이러스 수율이 측정되었다.
감염 일: 3 5 7 9 12 14
log CID50/㎖: 7.9 8.05 8.25 7.45 6.7 7.0
(중복 시험으로부터 평균 값)
실시예22: 레오바이러스의 증식
표준 배지에서 MDCK 33016의 진탕 배양물이 레오바이러스 유형 3(Bio Doc, Hannover에서 획득한)으로 MOI 0.01에서 감염시켰고 33 또는 37℃에서 3일 또는 5일 동안 더 배양하였다. 배양물 상청액의 표본을 5일과 7일 후에 얻어서 3% FCS가 있는 MEM배지에서 BHK세포를 이용하여, 제공된 시스템에서 적정하였다. 적정물의 평가는 7일 후에 한다.
37℃에서 5일후 진탕 배양물의 바이러스 수율은 108.1 CID50/㎖이고, 33℃에서 108.0 CID50/㎖이었다. 7일 후 양쪽 온도에서 적정물은 108.0 CID50 /㎖이었다.
같은 바이러스 계통을 MDCK 33016 배양물에서 MOI 0.01에서 감염시키는 동안 실시예12와 유사하게 화학적으로 정의되고 단백질이 없는 배지에서 사용되었다. 감염일 3,7,10일에, 배양물 부피의 22%가 제거되고 신선한 배지로 대체되었다. 7일에, 세포를 포함한 배양물 배지의 50%가 제거되고 새로운 배지로 대체되었다. 전체적으로, 감염시키는 동안 배양물 부피는 완전히 교체되었고 배지 보충으로 희석에 따라 세포를 더 증식시킬 수 있는 기회를 제공하였다. 사용된 방법은 전체적으로 오직 초과량만 제거되는 배양물의 1:2통과에 대응한다. 특히 초기상에서 가능한, 배양물의 상당히 높은 통과 또는 희석은 여기서 완전히 사용되지 않았다.
다음 바이러스 수율이 측정되었다.
감염 일: 3 7 10 14
log CID50/㎖: 5.4 7.1 6.6 6.6
(중복 시험으로부터 평균 값)
실시예23: 폐렴바이러스의 증식
5% FCS와 중탄산염을 첨가한 MEM배지에 있는 부착성 MDCK 33016 배양물 (실시예2 참조)을 인간 RSV-A(계통 A-2;ATCC VR-1302)으로 감염시키는 동안 사용하였다. 바이러스를 1:100으로 희석하고 신선하게 준비된 배양물에 접종하고 배양물을 37℃에서 배양한다. 1주일 후, 배양물 상청액 1㎖을 새로운 배양물에 이동하고 다시 7일동안 배양하였다. MA-104세포에 있는 수거된 배양물 상청액(ECACC 85102918)은 적정물을 평가하는 동안 CPE를 수단으로 바이러스 적정 105.5 CID50/㎖을 나타냈다.
바이러스 계통 A-2, ATCC VR-1302가 MDCK 33016 배양물에서 실시예12와 유사하게 화학적으로 정의되고 단백질이 없는 배지에서 사용되었다. 감염일 3,5,7,9일에, 배양물 부피의 22%를 신선한 배지로 대체하였다. 7일에, 세포를 포함한 배양물 배지의 50%가 제거되고 새로운 배지로 대체되었다. 전체적으로, 감염동안 배양물 부피는 완전히 한 번 이상 교체되었고 배지 보충으로 희석에 따라 세포를 더 증식시킬 수 있는 기회를 제공하였다. 사용된 방법은 전체적으로 오직 초과량만 제거되는 배양물의 1:2:4통과에 대응한다. 특히 초기상에서 가능한, 배양물의 상당히 높은 통과 또는 희석은 여기서 완전히 사용되지 않았다.
다음 바이러스 수율이 측정되었다.
감염 일: 3 5 7 9 12 14
log CID50/㎖: 7.85 8.5 7.55 6.55 4.45 n.t.
(중복 시험으로부터 평균 값)
n.t.:시험되지 않은 표본, 일부는 비멸균.
바이러스 계통 RSV-B, ATCC VR-1401아 동등한 구역에서 시험되었다. 바이러스 적정동안, 전형적인 융합체 바이러스가 잘 발달하고 측정이 촉진되기 때문에 Hep-2세포(서브라인 Hep-2C, Paul Ehrlich Institute, 공식적으로 Frankfurt가 제공한)가 사용되었다.
다음 바이러스 수율이 측정되었다.
감염 일: 3 5 7 9 12 14
log CID50/㎖: 3.7 4.75 7.45 6.3 3.2 3.75
(중복 시험으로부터 평균 값)

Claims (37)

  1. a) MDCK(Madine-Darby Canine Kidney) 세포를 바이러스로 감염시키는 단계; 및
    b) 감염 후에, 바이러스의 증식과 동시에 목적으로 한 감염 세포의 추가적인 증식을 허용하는 조건에서, MDCK 세포를 세포 배지에서 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 바이러스는 플라비바이러스, 광견병 바이러스, A형 간염 바이러스, 로타바이러스, 또는 파라믹소바이러스이고,
    상기 바이러스의 증식 및 세포의 증식 동안에, 신선한 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분을 적어도 한 번 추가하거나, 바이러스 및 세포의 적어도 일부를 신선한 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분을 함유하는 배양 용기로 옮기는 것을 특징으로 하는 약물 및 진단제의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 감염 후에 세포의 적어도 5배 증식을 야기하는 조건에서 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 감염 후에 세포 배양물에서 세포를 적어도 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분의 추가나 다른 배양 용기로 세포 및 바이러스를 옮기는 것을 적어도 1회 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분의 추가나, 다른 배양 용기로 세포 및 바이러스를 옮기는 것을 수회 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 바이러스 및 세포가 증식하면 배지를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 바이러스 및 세포의 증식 동안에, 배지를 계속해서 제거하고, 신선한 배지, 배지 농축물 또는 배지 성분을 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서, 감염 전에 세포를 부착 배양하거나 또는 진탕 배양물로서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 감염 후에 세포를 부착 배양하거나 또는 진탕 배양물로서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, MDCK 세포는 세포주 MDCK 33016으로부터 기원되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 바이러스는 ssDNA, dsDNA, RNA(+), RNA(-) 또는 dsRNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 삭제
  15. 제 1항에 있어서, 플라비바이러스는 일본뇌염 바이러스, 중앙유럽 뇌염 바이러스 및 관련된 동방(러시아 또는 기타) 형태, 뎅그열 바이러스 및 황열병 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 바이러스는 크기가 적어도 10kd인 이종기능성 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 배지는 혈청이 없는 것을 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 배지는 화학적으로 규명된 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 배지는 단백질이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 바이러스의 증식은 관류 시스템에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 바이러스의 증식은 배치 시스템에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, MDCK 세포를 바이러스의 증식을 위해서 30 내지 40℃의 온도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, MDCK 세포를 바이러스의 증식을 위해서 35 내지 60%의 산소 부분압에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 배지의 pH 값은 바이러스의 증식을 위해서 pH 6.8 내지 pH 7.8인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 바이러스를 10-8 내지 10의 MOI 값으로 감염에 의해 MDCK세포로 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 바이러스 또는 바이러스에 의해 발현된 단백질을 배양 상청액 또는 수거된 세포로부터 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 세포는 MDCK 세포이고, 배양 배지의 적어도 일부를 바이러스 또는 단백질의 정제를 위해서 MDCK 세포의 적어도 일부로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 분리는 딥 베드 필터 또는 분리기에 의해서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 정제는 바이러스의 농축을 위해서 초원심분리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 정제는 크로마토그래피법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 26항에 있어서, 바이러스는 정제하는 동안에는 불활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 삭제
  33. 제 1항에 있어서, 바이러스나 단백질을 적절한 보조약, 보조물, 버퍼, 희석액 또는 약물 담체와 혼합하는 것을 특징으로 하는 약물 또는 진단제의 제조 방법.
  34. 제 2항에 있어서, 감염 후에 세포의 적어도 10배 증식을 야기하는 조건에서 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 3항에 있어서, 감염 후에 세포 배양물에서 세포를 적어도 21일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 감염 후에 세포 배양물에서 세포를 적어도 28일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 감염 후에 세포 배양물에서 세포를 적어도 35일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
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