KR101370512B1

KR101370512B1 - 무단백 배지에서 부유 배양되는 mdck 유래 세포주 및 상기 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시키는 방법

Info

Publication number: KR101370512B1
Application number: KR20130065229A
Authority: KR
Inventors: 황미희; 박국진; 신덕향; 이현; 김수인; 조은영; 김미숙; 안동호
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2014-03-06
Also published as: US20160108367A1; US10017743B2; WO2014196795A1; EP3006562A1; JP6166842B2; EP3006562A4; JP2016520329A; EP3006562B1; CN105378072A

Abstract

본 발명은 무단백 배양배지에서 부유 배양할 수 있는 MDCK 유래 신규 세포주, 및 상기 MDCK 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시켜 백신을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 MDCK 유래 신규 세포주는 무단백 배지에서 부유 배양할 수 있는 세포로서, 세포성장에 문제가 없고 다양한 바이러스에 대해 높고 고른 생산성을 나타낼 뿐만 아니라, 바이러스 항원 변이를 적게 유발하면서 종양 형성능이 낮아 백신용 바이러스 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

무단백 배지에서 부유 배양되는 MDCK 유래 세포주 및 상기 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시키는 방법{MDCK-DERIVED CELL LINES SUSPENSION-CULTURED IN A PROTEIN-FREE MEDIUM AND METHOD FOR PROPAGATING VIRUS USING THE SAME}

본 발명은 무단백 배양배지에서 부유 배양할 수 있는 MDCK 유래 신규 세포주, 상기 MDCK 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시켜 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 독감 백신 생산에는 유정란이 사용된다. 그러나 유정란을 사용할 경우 제품생산에 적합한 닭을 사육하고 관리해야 하며, 유정란의 생산 범위 안에서 독감 백신 생산을 조정해야 할 뿐만 아니라, 난단백을 완전히 제거할 수 없어 난단백 알러지를 갖고 있는 사람은 접종 받을 수 없다는 단점이 있다.

이러한 단점이 있는 유정란을 대체하기 위해 오래전 부터 세포배양을 이용하여 독감 바이러스 백신에 대한 연구가 진행되어 왔다. 세포배양은 무한 공급이 가능한 동물세포에 독감 바이러스를 배양하여 만들기 때문에 짧은 시간에 대량 공급이 가능할 뿐 아니라 계란 알러지가 있는 사람도 접종이 가능하며 유정란에서 분리 되지 않는 독감 바이러스도 세포에서는 분리 가능하다는 이점이 있다. 또한 세포에서 바이러스를 증식시킬 경우 유정란에서보다 바이러스 항원의 유전자 변이를 적게 유발한다고 알려져 있다.

이러한 동물 세포주는 일반적으로 동물 유래 혈청 및 다른 동물 유래 단백질을 이용하는데, 이 경우 동물에서 유래된 알지 못하는 다른 유해 인자가 제품에 포함될 확률이 높아지게 된다. 그러므로 백신의 생산에 있어서는 동물유래 혈청 뿐만 아니라 다른 첨가물도 동물유래의 물질은 사용하지 않는 것이 더욱 안전하다.

개의 신장에서 수립한 세포인 MDCK(Madin Darby canine kidney) 세포주는 표면 부착성이 매우 강한 세포로서, 동물유래의 혈청을 사용하여 배양을 해왔으며 대량으로 배양하기 위해서는 많은 공간이 필요하고 이에 따른 많은 비용이 소모된다. 또한 부착성 MDCK 세포주는 높은 종양원성이 나타난다는 보고가 있다.

이에 따라, 동물 유래의 혈청과 단백질이 함유되지 않은 배양배지를 이용하여 부유배양에 적응 시킨 MDCK를 확보하고 종양원성 또한 부착 MDCK 보다는 현저히 낮은 신규 현탁 배양 MDCK 세포주의 개발이 요구된다.

따라서, 본 발명의 목적은 무단백 배양배지에서 부유 배양가능하고 바이러스 항원 변이를 적게 유발하면서 종양 형성능이 낮아 백신용 바이러스 생산에 유용한 MDCK 유래 신규 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 MDCK 유래 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시켜 백신을 제조하는 방법; 바이러스의 감염여부 진단하는 방법; 또는 항체 제조용 또는 항체 생성 평가용 항원의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 무단백 배양배지에서 부유 배양할 수 있는 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00297)를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은

1) MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00297)에 바이러스를 감염시키는 단계;

2) 상기 바이러스에 감염된 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주를 배양하는 단계; 및

3) 상기에서 수득한 세포 배양물에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스를 증식시켜 백신을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 MDCK 유래 세포주는 무단백 배양배지에서 부유 배양할 수 있는 세포로서, 세포 성장에 문제가 없고 다양한 바이러스에 대해 높고 고른 생산성을 나타낼 뿐만 아니라, 바이러스 항원 변이를 적게 유발하면서 종양 형성능이 낮아 백신용 바이러스 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1 및 2는 후보 세포주 A의 부유배양 적응 중 세포 상태, 및 생장곡선을 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 후보 세포주 B의 부유배양 적응 중 세포 상태, 및 생장곡선을 나타낸 것이다.
도 5 및 6은 각각 후보 세포주 A 및 B의 계대배양 결과를 나타낸 것이다.
도 7 내지 9는 후보 세포주 A 및 B에서의 H1N1, H3N2 및 B 타입의 인플루엔자 바이러스 생산성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 무단백 배양배지에서 부유 배양(suspension culture)할 수 있는 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00297, 이하 "후보 세포주 B"로도 명명됨)를 제공한다.

동물 유래 물질을 포함하지 않는 무단백 배양배지에서 부유 배양되는 본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주는 세포 성장에 문제가 없고 종양 형성능이 낮으며 다양한 바이러스에 대해 높고 고른 생산성을 나타낼 수 있다.

뿐만 아니라, 무단백 ProCHO5 배지에서 부유 배양되는 본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주는 상용 무혈청 배지인 EX-CELL MDCK 배지에서 부유 배양되는 다른 MDCK 세포주(후보 세포주 A)와 비교하여 최대 128배 높은 HA 역가 및 최대 10⁵배 우수한 PFU 역가를 나타내므로, 인플루엔자 바이러스 생산능이 매우 우수하다(표 5 내지 10). 또한 후보 세포주 A와는 다르게 3번 계대배양하여도 바이러스 HA 항원의 아미노산 서열에 변이를 나타내지 않고(표 12), 종양 형성능이 상대적으로 낮으며(표 13), 본 발명의 세포주에서 생산한 인플루엔자 백신은 마우스에서 우수한 항체 형성능(표 14)을 나타내므로 백신용 바이러스 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명자들은 상기 MDCK 유래 후보 세포주 B를 "MDCKS-MG"로 명명하여 2013년 5월 15일 한국세포주연구재단에 기탁번호 KCLRF-BP-00297로 기탁하였다.

본 발명에서 "무단백 배양배지"는 동물 유래 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지에서 특히 분자량 10KDa 이상의 단백질이 전혀 첨가되지 않은 배양 배지로서, 본 발명에 따른 무단백 배양배지는 혈청 및 단백질이 전혀 첨가되지 않은 ProCHO5 배지인 것이 바람직하다.

본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주는, 예를 들어 (a) 부착성 MDCK 세포(ATCC, CCL-34)를 해동한 후 혈청 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 단계 a)에서 수득한 세포를 부착 상태로 계대 배양시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 b)에서 수득한 세포를 계대할 때마다 혈청의 함량을 낮춰가면서 ProCHO4 배지(FBS 2%)에서 ProCHO5 배지(무혈청)로 교체하여 5% CO₂ 배양기에서 120 내지 130rpm으로 교반하는 방식으로 부유 배양에 적응시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주의 제조방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.

단계 (a)

먼저, 모세포로 사용된 부착성 MDCK 세포주에 대한 정보는 다음과 같다:

MDCK (Madin-Darby Canine Kidney, ATCC).

단계 (a)에서는 상기 MDCK 모세포(ATCC, CCL-34)를 해동시킨 후, 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 EMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 환경 하에서 배양한다.

단계 (b)

단계 (b)에서는, 상기 단계 (a)에서 수득한 세포를 3-4일 후에 0.25% 트립신 EDTA를 이용하여 플라스크 바닥에서 현탁하여 수득한 후, 세포양을 1:4 내지 1:50 의 비율로 부착 상태로 계대 배양할 수 있다. 세포성장속도에 따라 계대 비율이 달라질 수 있지만, 바람직한 계대 비율은 1:4 내지 1:30이다.

단계 (c)

단계 (c)에서는 상기 단계 (b)에서 수득한 세포를 계대할 때마다 혈청의 함량을 낮춰가면서 ProCHO4 배지(FBS 2%)에서 ProCHO5 배지(무혈청)로 교체하여 5% CO₂ 배양기에서 120 내지 130rpm으로 교반하는 방식으로 부유 배양에 적응시킨다.

예컨대, ProCHO4 배지(FBS 2%)에서 0-24일, ProCHO4 배지(FBS 1%)에서 24-32일, ProCHO4 및 ProCHO5 혼합배지(50:50, FBS 1%)에서 32-36일, ProCHO4 및 ProCHO5 혼합배지(33:67, FBS 0.5%)에서 36-39일, ProCHO4 및 ProCHO5 혼합배지(20:80)에서 39-42일, 및 ProCHO5 배지(무단백)에서 42일 이상 5% CO₂ 배양기에서 120 내지 130rpm으로 교반하는 방식으로 혈청 함량을 감소시켜 가면서 부유 배양에 적응시킨다.

상기 ProCHO5 배지는 L-글루타민(Lonza)을 포함할 수 있으며, L-글루타민을 함유하는 상용화된 제품으로는 Gluta-Max (invitrogen), GlutaminePlus (atlantabio), CellBoost (HyClone), RS-CHO (Sheffield) 등을 들 수 있다.

상기 제조방법에 따라 제조된 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주는 장기 계대 배양하여도 계대별로 동등한 수준의 세포 성장율(도 6) 및 약 97% 이상의 높은 생존율을 나타낸다. 또한, 글루코스, 락테이트, 글루타민 및 글루타메이트와 같은 물질대사 면에서나 바이러스 생산능에도 계대별 차이를 거의 나타내지 않는다. 이에, 본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주는 바이러스를 증식시키는 데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 바이러스, 예를 들어 상기 방법에 의해 제조된 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 본 발명의 MDCKS-MG 세포주를 이용하여 제조된 바이러스는 백신, 바이러스 감염 여부 진단, 항체 제조용 항원 또는 항체 생성 평가용 항원으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 MDCKS-MG 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시켜 백신을 제조하는 방법; 바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법; 및 항체 제조용 항원 또는 항체 생성 평가용 항원을 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 1) MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00297)에 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 상기 바이러스에 감염된 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주를 배양하는 단계; 및 3) 상기에서 수득한 세포 배양물에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스를 증식시켜 백신을 제조하는 방법을 제공한다.

이에 따라, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 백신을 제공한다.

상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스, HSV-1, HV-2, 홍역 바이러스, 레오 바이러스 2형 및 3형, RS 바이러스, 광견병 바이러스, 황열 바이러스, 아데노 바이러스 4형, 라사 바이러스, 백시니아 바이러스, 파보 바이러스, 콕사키 바이러스 B3, B4 및 B5형, 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스이다.

상기 인플루엔자 바이러스는 나선형 RNA 바이러스 중 올소믹소바이러스(Orthomyxovirus)에 속하는 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 인플루엔자 바이러스 A형, 인플루엔자 바이러스 B형 또는 인플루엔자 바이러스 C형일 수 있으며, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형일 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 인플루엔자 바이러스는 A/WS/33, IVR-116, IVR-148 또는 IVR-145와 같은 H1N1 바이러스; A/Hongkong8/68, NYMC X-161B, NYMC X-157 또는 IVR-147와 같은 H3N2 바이러스; 또는 B/Lee/40, B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006 또는 B/Brisbane/60/2008와 같은 B형 바이러스일 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에서, MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주에 바이러스를 감염시키는 방법은 무균의 바이러스 액을 적당량, 예를 들어 0.01 MOI의 양을 섞어 감염시킬 수 있으며, 상기 인플루엔자 바이러스 감염된 MDCK 세포를 배양하는 조건은 상기에서 언급한 바와 같은 세포주의 배양 조건과 동일하다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주에 인플루엔자 바이러스를 계대 감염시킨 후, 계대 감염된 바이러스의 주요 표면항원인 HA 및 NA에 대한 아미노산 서열을 확인함으로써 바이러스의 유전적 안정성을 비교하였다. 그 결과, 후보 세포주 A에서 감염된 바이러스와는 다르게, 본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주에서 계대 감염된 바이러스의 HA 및 NA에 대한 아미노산 서열은 3번 계대 감염까지 유전자 변이 없이 안정하다는 것을 알 수 있었다(실시예 4).

또한, 본 발명의 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 후 이를 배양시켜 인플루엔자 바이러스주를 생산하였다. 이렇게 생산된 인플루엔자 바이러스를 정제하여 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하였다. 제조된 바이러스 백신을 6주령의 암컷 BALB/C 마우스에 투여한 후 혈청 내 HI 역가(titer)를 분석한 결과, 백신을 투여한 마우스에서 항체 형성능이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주는 백신용 인플루엔자 바이러스의 제조에 유용하게 사용될 수 있다(실시예 6).

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 후보 세포주 선별 과정

1.1. 부착성 MDCK 세포 해동

동결보존된 부착성 MDCK 세포(입수처: ATCC, CCL-34)를 해동하여 15 mL 혈청배지(10% FBS가 첨가된 EMEM 배지)(입수처: Lonza)에서 배양하였다. LN2 탱크에 보관된 세포를 꺼내 37℃ 워터 배스(water bath)에 넣어 녹였다. 혈청 배지가 첨가된 T75 플라스크에 재부유(resuspension)한 세포액을 첨가하여 37℃ 및 5% CO₂배양기에 넣어 배양하였다.

1.2. 부착 배양(Adherent culture)

상기 1.1에서 수득한 세포를 3-4일 후에 1:4 내지 1:30 비율로 계대 배양하였다. 모세포의 계대(passage)는 55이었다. 상기 계대 배양은 다음과 같은 과정에 의해 수행되었다.

상기 1.1의 배양기에서 T75 플라스크를 꺼내어 이로부터 배지를 제거하고 세척하였다. 세포에 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 세포가 떨어지면 원하는 비율이 되도록 혈청배지로 파이페팅(pipetting)을 통해 재부유하였다. 계대배양은 1:4 내지 1:30 비율로 3-4일마다 수행하였다.

부착 배양은 부유 배양으로 적응시키기 전까지 수행되었다.

1.3. 부유 배양 적응(Suspension adaptation)

상기 1.2에서 수득한 부착 세포를 EX-CELL MDCK(Sigma), UltraMDCK(Lonza) 및 VP-SFM (Invitrogen) 등의 6가지 상용 무혈청 배지를 이용하여 부유 배양에 적응시켰다. 이 중 2종의 배지가 부유 배양에 적합한 것을 확인하였으며, 이로부터 10종 이상의 다양한 세포주를 확보하였다. 부유 배양에 가장 적합한 후보 MDCK 세포주 2종(후보 세포주 A 및 B)을 선별하였다. 후보 세포주 A 및 B의 구체적인 부유 배양 적응 과정은 다음과 같다.

1.3.1. 후보 세포주 A의 부유 배양 적응 과정

상기 1.1 및 1.2에 기재된 과정에 따라, 동결 보존된 부착성 MDCK 세포(입수처: ATCC, CCL-34)를 해동시킨 후 3번의 부착 상태로 계대 배양하였다. 이어, 5% FBS가 포함된 Ex-cell MDCK 배지(Sigma, 6mM L-글루타민 포함, 이하 "Ex-cell"로 지칭함)에 5e+05cells/mL의 농도로 재부유한 후, 125 mL 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 넣어 배양기에서 120-130rpm으로 교반시켜 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 부유 배양하였다(working volume(이하 W.V.): 10mL, 초기세포접종농도: 5e+05cells/mL, p80).

3-4일에 한번씩 초기세포 접종농도를 5e+05cells/mL 이상이 되도록 맞춰 주었으며, FBS 농도는 5%부터 시작하여 계대할 때마다 줄여나갔다. 후보 세포주 A의 부유배양 적응 배지 혼합 요약표를 하기 표 1에 나타내었다.

기간(일)	FBS 농도(%)
0-3	5
3-6	2.5
6-9	1
9-13	0.5
13-	0 (Serum-free)

후보 세포주 A의 부유배양 적응 경과는 다음과 같다:

13일째가 되면서 세포성장이 일어나기 시작했으며 15일째부터 생존율도 90% 이상으로 세포상태가 좋아졌다. 23일째 4배 이상의 세포수를 3회 연속 도달하였으며 생존율도 90% 이상을 나타내었다. 30일째 4배 이상의 세포성장을 보이며 97% 생존율을 갖는 세포주를 확보하였다. 이로써 후보 세포주 A의 부유 배양 적응이 완료되었다.

도 1에 후보 세포주 A의 부유배양 적응 중 6일차 및 41일차의 세포 상태를 나타내었으며, 도 2에는 후보 세포주 A의 생장곡선을 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 6일째 세포상태는 스웰링(swelling)과 응집(aggregation)이 있으며 죽은 세포가 많이 보였으나, 41일째 세포상태는 거의 동일한 크기의 세포 모양과 높은 생존율을 보였다.

1.3.2. 후보 세포주 B의 부유배양 적응 과정

상기 1.1 및 1.2에 기재된 과정에 따라, 동결보존된 부착성 MDCK 세포(입수처: ATCC, CCL-34)를 해동시킨 후 3번의 부착 상태로 계대 배양하였다. 이어, 2% FBS가 포함된 ProCHO4 배지(Lonza, 4 mM L-글루타민 포함, 이하 "ProCHO4"로 지칭함)에 5e+05cells/mL의 농도로 재부유한 후, 500 mL 에를렌마이어 플라스크에 넣어 배양기에서 120-130rpm로 교반시켜 오비탈 쉐이커에서 배양하였다(W.V.: 130mL, 초기세포접종농도 : 7e+05cells/mL, p76).

3-4일에 한번씩 초기세포 접종농도를 5e+05cells/mL 이상이 되도록 맞춰주었으며, FBS 농도는 2%부터 시작하여 계대할 때마다 줄여나갔다. 후보 세포주 B의 부유배양 적응 배지 혼합 요약표를 하기 표 2에 나타내었다.

기간(일)	ProCHO4 (%)	ProCHO5 (%)	FBS 농도 (%)
0-24	100	0	2
24-32	100	0	1
32-36	50	50	1
36-39	33	67	0.5
39-42	20	80	0 (무혈청)
42 이상	0	100	0

후보 세포주 B의 부유배양 적응 경과는 다음과 같다:

21일째 되면서 세포성장이 일어나기 시작했으며, 생존율도 90% 이상으로 세포상태가 좋아졌다. 24일째 2번의 더블링 후 FBS 농도를 1%로 줄였으며, 32일째에는 ProCHO4에서 ProCHO5로 배지 전환을 위해 적응시켜 나가면서 ProCHO4(2% FBS 함유)에서 ProCHO5(무혈청배지, Lonza, Cat# 12-766Q)로 변경시켰다. 56일째까지는 세포성장이 떨어져서 3-4일에 한번씩 W.V.을 낮추면서 계대 배양하였고, 이 시기에 생존율은 30%대로 떨어졌다. 59일째가 지나면서 더디지만 세포 성장이 일어나기 시작했으며 생존율도 80% 정도로 회복하였다. 95일째 세포성장이 안정적인 상태를 찾아가며 더블링하기 시작하였으며 90% 이상의 생존율을 나타냈다. 99일째는 세포가 4배 이상의 세포성장을 보이며, 99% 생존율을 갖는 세포주(W.V. 200mL 이상)를 확보할 수 있었다.

도 3에 후보 세포주 B의 부유배양 적응 중 24일차 및 126일차의 세포 상태를 나타내었으며, 도 4에 이의 생장곡선을 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 24일째 세포 상태는 응집이 많으며 죽은 세포도 보였으나, 126일째에는 거의 동일한 크기의 세포 모양과 높은 생존율을 나타내었다.

실시예 2: 후보 세포주의 비교 분석 및 생산 세포주 결정

2.1. 장기 계대배양을 통한 세포주 안정성 비교

2.1.1. 후보 세포주 A

상기 후보 세포주 A의 계대별 세포 성장성을 확인하기 위하여, 100일간 3-4 일에 한번씩 세포수가 5e+05cells/mL이 되도록, 상기 후보 세포주 A를 원심 분리하여 배양액을 제거한 후 새로운 배지를 넣어주는 방식으로 계대 배양하였다. 후보 세포주 A의 계대배양 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 35계대 이상(p85+35, 부유 배양 전까지의 세포 계대수(passage)가 85번 있었고 부유 후에는 35번의 계대 배양함) 장기 계대배양했을 때에도 후보 세포주 A는 계대별로 거의 동등한 수준의 세포 성장을 보였다.

2.1.2. 후보 세포주 B

상기 실시예 1에서 부유 배양 적응이 완료된 후보 세포주 B의 계대별 세포 성장성을 확인하기 위하여, 274일간 3-4일에 한번씩 세포수가 5e+05cells/mL이 되도록, 상기 세포주 B를 원심 분리하여 배양액을 제거한 후 새로운 배지를 넣어주는 방식으로 계대 배양하였다. 후보 세포주 B의 계대배양 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 51계대 이상(p89+51, 부유 배양 전까지의 세포 계대수가 89번 있었고 부유 후에는 51번의 계대 배양함)까지 장기 계대배양했을 때에도 45계대(p89+45)까지는 계대별로 동등한 수준의 세포 성장을 보였다.

2.2. 계대별 배가시간 및 최고세포농도 비교

후보 세포주 A 및 B의 세포농도와 세포생존율을 이용하여 배가시간(Doubling Time, T_d)을 측정하고 최고세포농도를 확인하였다.

이때, T_d는 매일 측정한 세포수를 기준으로 하기 식에 따라 log phase에서 계산하였으며, 최고세포농도(Maximum Viable Cell Density, VCD_max)는 매일 측정한 세포수의 최고값으로 나타내었으며, 대부분 4-7일 사이에 최고세포농도를 나타내었다. 세포생존율은 헤모사이토미터(hemocytometer)로 측정하였다.

[수학식]

상기 식들에서,

μ는 특이적 성장 속도(specific growth rate)이고;

x는 세포수이고;

dt은 시간 변화량이고;

dx'은 세포수 변화량이고;

In2은 세포수가 두배되는 값이고;

μmax은 특이적 성장 속도 최대치(maximum of specific growth rate)이다.

후보 세포주 A에서는 p85+7에서 p85+45까지의 계대에서 T_d와 최고세포농도가 동등한 수준이었으며, 평균을 냈을 때 T_d는 약 28시간, 최고세포농도는 5.28±0.79e+06 cells/mL, 세포생존율은 97% 이상이었다.

후보 세포주 B에서는 p89+2에서 p89+33까지의 계대에서 T_d와 최고세포농도가 동등한 수준이었으며, 평균을 냈을 때, T_d는 약 38시간, 최고세포농도는 2.60±0.62e+06 cells/mL, 세포 생존율은 97% 이상이었다.

계대		T_d(h)	VCD_max/AVG (cells/mL)	생존율(%)
후보 세포주 A	P85+7~45	28.2±2.4	5.28±0.79e+06	97±1.9
후보 세포주 B	P89+2~33	37.9±6.1	2.60±0.62e+06	97±1.3

2.4. 후보 세포주의 인플루엔자 바이러스 생산성 비교

후보 세포주 A 및 B를 이용하여 11종의 인플루엔자 바이러스, 즉 H1N1 바이러스(A/WS/33, IVR-116, IVR-148 및 IVR-145), H3N2 바이러스(A/Hongkong8/68, NYMC X-161B, NYMC X-157 및 IVR-147) 및 B 바이러스(B/Lee/40, B/Malaysia/2506/2004 및 B/Brisbane/60/2008)를 증식시켰다.

후보 세포주 A 및 B를 인플루엔자 바이러스로 감염시키기 위하여, 각각 EX-CELL MDCK 배지(sigma) 및 ProCHO5 배지(입수처: Lonza)에 0.01 MOI 및 10μg/mL TPCK-트립신을 첨가하였으며, 5% CO₂ 존재 하에서 흔들면서 33-37℃에서 부유 배양하였다. 이후 7일간 매일 각각의 시료를 파이펫을 이용하여 1mL씩 샘플링한 후, HA 분석(Heamagglutination assay)와 PFU(Plaque-forming unit)을 통해 후보 세포주 A 및 B의 생산성을 확인하였다.

HA 역가 및 PFU 역가는 문헌[Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza, WHO]에 공지된 방법에 따라 측정하였다.

그 결과, 4종의 H1N1 바이러스 및 4종의 H3N2 바이러스에서 후보 세포주 A에 비해 후보 세포주 B가 더 빨리 더 높은 역가를 보였다(도 7 및 8). 특히 IVR-147은 후보 세포주 A에서는 HA 역가가 측정되지 않았다. 또한, 4종의 B 바이러스에서도 후보 세포주 A에 비해 후보 세포주 B가 더 빨리 더 높은 역가를 보였다(도 9).

한편, 후보 세포주 A의 11종의 인플루엔자 바이러스에 대한 HA 역가의 결과값을 1로 하고 후보 세포주 B의 HA 역가값을 비율로 나타낸 결과를 하기 표 4 내지 6에 나타내었다. 그 결과, 후보 세포주 B의 생산성이 후보 세포주 A의 값과 동등하거나 높은 수준이었으며, 특히 IVR-147 바이러스의 경우에는 128배 높은 것을 확인할 수 있었다.

HA 역가	H1N1
strain	A/WS/33	A/New Caledonia/20/99	A/Brisbane/59/2007	A/Solomon Islands/3/2006
Reassortant	-	IVR-116	IVR-148	IVR-145
후보세포주 A	1.0	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	4.0	1.0	1.0	2.0

HA 역가	H3N2
strain	A/Hong Kong/8/68	A/Wisconsin/67/2005	A/New York/55/2004	A/Brisbane/10/2007
Reassortant	-	NYMC X-161B	NYMC X-157	IVR-147
후보세포주 A	1.0	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	1.0	2.0	2.0	128.0

HA 역가	B
strain	B/Lee/40	B/Malaysia/2506/2004	B/Brisbane/60/2008
후보세포주 A	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	8.0	2.0	4.0

또한, 후보 세포주 A의 11종의 인플루엔자 바이러스에 대한 PFU 역가의 결과값을 1로 하고 후보 세포주 B의 PFU 역가값을 비율로 나타낸 결과를 하기 표 7 내지 9에 나타내었다. 그 결과, 11종의 바이러스에서 후보 세포주 B가 후보 세포주 A보다 동등 수준 이상이었으며, 특히 B/Brisbane/60/2008 바이러스의 경우에는 최대 10⁵배 높은 결과를 보임을 알 수 있었다.

PFU 역가	H1N1
strain	A/WS/33	A/New Caledonia/20/99	A/Brisbane/59/2007	A/Solomon Islands/3/2006
Reassortant	-	IVR-116	IVR-148	IVR-145
후보세포주 A	1.0	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	17.2	5.8	6.9	11.1

PFU 역가	H3N2
strain	A/Hong Kong/8/68	A/Wisconsin/67/2005	A/New York/55/2004	A/Brisbane/10/2007
Reassortant	-	NYMC X-161B	NYMC X-157	IVR-147
후보세포주 A	1.0	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	5.9	1.2	1.2	39333.0

PFU 역가	B
strain	B/Lee/40	B/Malaysia/2506/2004	B/Brisbane/60/2008
후보세포주 A	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	19864.9	2.0	125250.0

2.5. 선정된 생산세포주와 부착성 MDCK의 인플루엔자 바이러스 생산 비교

후보 세포주 B와 혈청을 포함하는 배지를 사용한 부착성 MDCK를 이용하여 9종의 인플루엔자 바이러스, 즉 H1N1 바이러스(IVR-116, IVR-148 및 IVR-145), H3N2 바이러스(NYMC X-161B, NYMC X-157 및 IVR-147) 및 B 바이러스(B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006 및 B/Brisbane/60/2008)를 증식시켰다.

후보 세포주 B 및 부착성 MDCK를 인플루엔자 바이러스로 감염시키기 위하여, 각각 ProCHO5 배지(입수처: Lonza) 및 10% 우혈청이 포함된 EMEM(Lonza)에 바이러스 0.01 MOI 및 TPCK-트립신 10μg/mL을 첨가하였다. 5% CO₂ 존재 하에서 부유 배양하는 후보 세포주 B는 흔들면서 33-37℃에서 부유 배양하였고, 부착성 MDCK는 같은 조건에서 흔들지 않고 배양하였다. 배양 후 2일 및 3일째에 각각의 시료를 파이펫을 이용하여 1mL씩 샘플링한 후, HA 분석 및 PFU을 통해 후보 세포주 B와 부착성 MDCK의 생산성을 확인하였다.

HA 역가 및 PFU 역가는 문헌[Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza, WHO]에 공지된 방법에 따라 측정하였다. 결과 비교는 2일과 3일중에 높은 역가를 보이는 것을 최고 역가라 생각하여 이를 비교하였다.

그 결과, 3종의 H1N1 바이러스에서는 HA 역가는 후보 세포주 B가 같거나 최고 2배 높은 역가를 보였다. PFU도 2배 이상 높거나 0.3배 낮은 정도를 보였으나 이정도의 차이는 실험 오차에 포함되는 수준이므로 비슷한 역가를 보인다 할 수 있겠다. 3종의 H3N2 바이러스에서는 후보 세포주 B가 부착성 MDCK에 비해 HA에서는 8배 이상의 역가를 보이고, PFU는 100배 이상의 역가를 나타내었다. 특히 B 타입 B/Brisbane/60/2008은 후보 세포주 B에서는 PFU 역가가 10⁸배 이상 높았다(표 10).

HA 역가	H1N1
strain	A/New Caledonia/20/99	A/Brisbane/59/2007	A/Solomon Islands/3/2006
Reassortant	IVR-116	IVR-148	IVR-145
부착성 MDCK	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	1.0	2.0	2.0
HA 역가	H3N2
strain	A/Wisconsin/67/2005	A/New York/55/2004	A/Brisbane/10/2007
Reassortant	NYMC X-161B	NYMC X-157	IVR-147
부착성 MDCK	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	16.0	8.0	16.0
HA 역가	B
strain	B/Malaysia/2506/2004	B/Florida/4/2006	B/Brisbane/60/2008
부착성 MDCK	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	2.0	16.0	4.0
PFU 역가	H1N1
strain	A/New Caledonia/20/99	A/Brisbane/59/2007	A/Solomon Islands/3/2006
Reassortant	IVR-116	IVR-148	IVR-145
부착성 MDCK	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	0.7	2.1	0.7
PFU 역가	H3N2
strain	A/Wisconsin/67/2005	A/New York/55/2004	A/Brisbane/10/2007
Reassortant	NYMC X-161B	NYMC X-157	IVR-147
부착성 MDCK	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	956.1	102.1	831.0
PFU 역가	B
strain	B/Malaysia/2506/2004	B/Florida/4/2006	B/Brisbane/60/2008
부착성 MDCK	1.0	1.0	1.0
후보세포주 B	6.2	10806.5	17892857.1

2.6. 생산 세포주의 선정

상기 결과를 바탕으로 후보 세포주 B를 본 발명의 생산 세포주로 선정하고, "MDCKS-MG"로 명명하여 2013년 5월 15일 한국세포주연구재단에 기탁번호 KCLRF-BP-00297로 기탁하였다.

실시예 3: 바이러스 유전적 안정성 비교

인플루엔자 바이러스는 숙주 내에서 증식 중 유전정보의 변화가 생기면 변화된 유전자 서열로 증식하게 되는데, 변이된 부분이 주요 표면항원인 HA 또는 NA 항원일 수 있다. 이에 따라 변화된 표면항원이 유도한 항체는 기대했던 백신의 효과에 미치지 못할 수 있다.

이에 따라, 후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주 (이하, 후보 세포주 B로도 지칭함)에서 계대 감염한 바이러스의 주요 표면항원인 HA와 NA에 대한 아미노산 서열을 확인하여 변화가 있다면 항체 형성에 영향이 있는지를 확인하였다.

구체적으로, NCBI에 등재된 기본 유전서열("Ref.")을 참고로 하여, 유정란에서 생산된 인플루엔자 바이러스와 후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주에서 생산된 인플루엔자 바이러스의 유전적 서열을 비교하였다.

먼저, 유정란에서 유래한 바이러스는 NIBSC로부터 입수하였고, 이의 HA 및 NA 항원의 아미노산 서열을 확인하였다. 후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주에 H1N1 바이러스(IVR-116, IVR-148, IVR-145 및 NYMC X-181), H3N2 바이러스(NYMC X161B, NYMC X-157, IVR-147 및 NYMC X-187) 및 B 바이러스(B/Malaysia/2506/2004 및 B/Brisbane/60/2008)를 3번의 계대 감염시킨 후, 후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주의 계대1 및 3에서 수득한 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 항원의 아미노산의 서열 변화를 확인하였다(표 11 및 12).

아미노산 서열은 코스모진텍사에 의뢰하여 분석하였으며, 기준 바이러스의 아미노산 서열과 비교하여 차이가 있는 아미노산과 이의 위치(aa site)를 하기 표 11에 나타내었다. 유정란에서 유래한 바이러스는 egg란에 나타내었다.

하기 표 11에 나타난 바와 같이, 후보 세포주 A에서 3계대까지 감염한 바이러스의 HA 아미노산 서열은 3가지의 균주(IVR-116, IVR-145 및 NYMC X-181)에서 변경된 것을 확인할 수 있었다. 그러나, MDCKS-MG 세포주에서는 변화한 아미노산이 없었다.

또한, 표 12에서 나타난 바와 같이, NA 아미노산 서열은 변이가 일어난 아미노산이 없었으며, 후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주와 처음 감염에 쓰인 유정란에서 유래한 바이러스의 아미노산 서열과 큰 차이를 나타내지 않았다. 이로부터 MDCKS-MG 세포주는 바이러스 증식에서 3번째 계대 감염까지 바이러스의 유전자 변이가 없다는 것을 확인하였다.

HA 아미노산 서열 비교

	strains	Seg- ment	aa site	Ref.	Egg	후보 세포주 A P1	후보 세포주 A P3	MDCKS-MG 세포주 P1	MDCKS-MG 세포주 P3
H1N1	A/New Caledonia/20/99 (IVR-116)	HA	150	A	A	A	E	A	A
	A/Brisbane/59/2007 (IVR-148)	HA	변이없음	-	-	-	-	-	-
	A/Solomon Islands/3/2006 (IVR-145)	HA	456	S	S	S	F	S	S
	A/Solomon Islands/3/2006 (IVR-145)	HA	540	R	L	L	L	L	L
	A/California/7/2009 (NYMC X-181)	HA	240	R	R	Q	Q	R	R
H3N2	A/Wisconsin/67/2005 (NYMC X-161B)	HA	변이없음	-	-	-	-	-	-
	A/New York/55/2004 (NYMC X-157)	HA	219	T	A	A	A	A	A
	A/New York/55/2004 (NYMC X-157)	HA	524	K	E	E	E	E	E
	A/Brisbane/10/2007 (IVR-147)	HA	210	L	P	P	P	P	P
			213	Q	K	K	K	K	K
			505	D	N	N	N	N	N
	A/Victoria/210/2009 (NYMC X-187)	HA	변이없음	-	-	-	-	-	-
B	B/Malaysia/2506/2004	HA	변이없음	-	-	-	-	-	-
B	B/Brisbane/60/2008	HA	212	N	S	S	S	S	S

NA 아미노산 서열 비교

	strains	Seg- ment	aa site	Ref.	Egg	후보세포주 A P1	후보세포주 A P3	MDCKS-MG P1	MDCKS-MG P3
H1N1	A/New Caledonia/20/99 (IVR-116)	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
	A/Brisbane/59/2007 (IVR-148)	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
	A/Solomon Islands/3/2006 (IVR-145)	NA	157	T	A	A	A	A	A
	A/California/7/2009 (NYMC X-181)	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
H3N2	A/Wisconsin/67/2005 (NYMC X-161B)	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
	A/New York/55/2004 (NYMC X-157)	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
	A/Brisbane/10/2007 (IVR-147)	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
	A/Victoria/210/2009 (NYMC X-187)	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
B	B/Malaysia/2506/2004	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-
B	B/Brisbane/60/2008	NA	변이없음	-	-	-	-	-	-

실시예 4: 종양원성 비교( mouse - in house tumorigenesis )

MDCK 세포는 종양 형성능이 높은 세포주로 알려져 있다. 종양 형성능은 숙주의 몸에 세포 그대로가 들어갔을 때 종양이 형성되는 것이기 때문에 생산세포로 이용 시에는 종양형성능이 없거나 적은 것이 용이하다.

후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주의 종양 형성능을 비교하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. 후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주를 각각 10³, 10⁵ 및 10⁷cells/mL로 그룹당 10마리씩 누드마우스(Balb/c nu/nu)의 피하에 이식한 후 11주간 종양의 형성을 관찰하였다. 종양 형성의 유무는 크기가 100 mm³ 이상부터 종양이 생겼다고 판단하였다. 이때, 음성 대조군은 PBS를 사용하고, 양성대조군은 Hela 세포(ATCC)에 10⁷cells/mL 농도로 이식한 후 종양 형성을 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

표 13에서 보는 바와 같이, 후보 세포주 A에서는 세포수 10⁵에서 2마리, 10⁷에서는 9마리가 종양이 형성되고, 양성대조군인 Hela 세포에서도 9마리가 종양이 형성된 반면, 본 발명의 MDCKS-MG 세포주에서는 세포수 10⁷에서만 1마리가 형성됨을 확인하였다. 따라서 MDCKS-MG 세포주의 종양원성이 세포주 A에 비해 현저히 낮았음을 확인할 수 있었다.

후보 세포주 A 및 MDCKS-MG 세포주의 종양형성 개체수

	투여세포수	종양형성 개체수
PBS	-	0/10
Hela	1.00e + 07	9/10
후보세포주 A	1.00e + 03	0/10
	1.00e + 05	2/10
	1.00e + 07	9/10
MDCKS-MG 세포주	1.00e + 03	0/10
	1.00e + 05	0/10
	1.00e + 07	1/10

실시예 5: 면역원성 확인 ( mouse - in house study )

백신의 가장 중요한 역할은 면역성을 갖게 하는 항체 형성능이다. 인플루엔자 바이러스 백신의 항체 생성을 확인하기 위한 가장 대표적인 방법은 HI assay라는 생물검정법이다. 이에, MDCKS-MG 세포주에서 증식된 인플루엔자 바이러스의 항체 형성능을 확인하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.

상기 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방식으로 본 발명의 MDCKS-MG 세포주에서 증식시킨 A/California/7/2009 (NYMC X-181), A/Victoria/210/2009 (NYMC X-187) 및 B/Brisbane/60/2008 (yamagata lineage) 3종의 인플루엔자 바이러스를 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리하였다. 이때, 보다 순수한 바이러스를 얻기 위해 수크로스의 농도를 20%, 25% 및 30%로 농도구배를 달리하여 첨가하였으며, 바이러스층만을 분리하였다. 투석을 통해 수크로스를 제거한 후 트리톤 X-100을 이용하여 바이러스를 분쇄하고, 마지막으로 제균 필터로 여과하여 바이러스 백신을 수득하였다.

한편, 한 군당 6주령의 암컷 BALB/C 마우스 8마리씩으로 하여 상기에서 수득한 3㎍, 1㎍ 및 0.1㎍의 바이러스 백신을 각각 근육주사로 투여하였다. 3주 간격으로 2번씩 백신을 투여하였으며, 첫 백신투여 후 7주째의 마우스 혈청을 이용하여 HI 분석을 수행하였다. 이때, 혈청을 얻기 위해 안와정맥에서 주사기를 이용하여 채혈한 후 6000rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 수득하였다.

HI 분석은 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방식으로 문헌[Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza]에 기재된 방식에 따라 수행되었다. HI 역가가 40 이상인 마우스 수/전체 마우스 수, 항체가의 기하 평균값(Geometric Mean Titre, GMT) 및 그룹내 HI 역가 범위를 하기 표 14에 나타내었다.

표 14에서 보는 바와 같이, 바이러스 백신을 1㎍ 이상 투여한 그룹에서는 HI 역가가 40 이상인 마우스가 한 그룹에서 70% 이상이 되는 것을 확인할 수 있었으며, 이로써 본 발명의 백신이 항체 형성능이 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 MDCKS-MG 세포주는 우수한 항체 형성능이 있으며, 백신용 인플루엔자 바이러스의 제조에 이용 가능하다.

마우스 혈청에 대한 HI assay

바이러스	측정값	항원 투여량
바이러스	측정값	3	1	0.1
H1N1	HI 역가가 40 이상인 마우스 수/전체 마우스 수	8/8	8/8	2/8
	GMT	160	207	20
	그룹내 HI 역가 범위	80-320	80-640	10-80
H3N2	HI 역가가 40 이상인 마우스 수/전체 마우스 수	7/8	8/8	7/8
	GMT	103	226	95
	그룹내 HI 역가 범위	20-320	160-320	20-320
B	HI 역가가 40 이상인 마우스 수/전체 마우스 수	8/8	8/8	6/8
	GMT	73	47	40
	그룹내 HI 역가 범위	40-160	40-80	10-80

한국세포주연구재단

KCLRFBP00297

20130515

Claims

무단백 ProCHO5 배양배지에서 부유배양시킬 수 있는 마딘-다비 개 신장(Madin Darby canine kidney, MDCK) 유래 MDCKS-MG 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00297).
삭제
제1항에 있어서,
상기 세포주가 바이러스를 증식시키는 것을 특징으로 하는, MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주.
제3항에 있어서,
상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형(Herpes simplex virus-1, HSV-1), 헤르페스 바이러스 2형(Herpes virus-2, HV-2), 홍역 바이러스, 레오 바이러스 2형 및 3형, 호흡기 세포융합(Respiratory syncytial, RS) 바이러스, 광견병 바이러스, 황열 바이러스, 아데노 바이러스 4형, 라사 바이러스, 백시니아 바이러스, 파보 바이러스, 콕사키 바이러스 B3, B4 및 B5형, 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주.
제4항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스가 A/WS/33, IVR(Initiative for Vaccine Research)-116, IVR-148, IVR-145, A/Hongkong8/68, NYMC(New York Medical College) X-161B, NYMC X-157, IVR-147, B/Lee/40, B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006 또는 B/Brisbane/60/2008인 것을 특징으로 하는, MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주.
1) MDCK 유래 MDCKS-MG 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00297)에 바이러스를 감염시키는 단계;
2) 상기 바이러스에 감염시킨 MDCKS-MG 세포주를 배양하는 단계; 및
3) 상기 2)에서 수득한 세포 배양물에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는,
바이러스를 증식시켜 백신을 제조하는 방법.