KR20120024464A - 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 - Google Patents

무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120024464A
KR20120024464A KR1020110085902A KR20110085902A KR20120024464A KR 20120024464 A KR20120024464 A KR 20120024464A KR 1020110085902 A KR1020110085902 A KR 1020110085902A KR 20110085902 A KR20110085902 A KR 20110085902A KR 20120024464 A KR20120024464 A KR 20120024464A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mdck
virus
serum
cells
cell
Prior art date
Application number
KR1020110085902A
Other languages
English (en)
Inventor
박용욱
이건세
이봉용
박만훈
김훈
김윤희
이수진
Original Assignee
에스케이케미칼주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에스케이케미칼주식회사 filed Critical 에스케이케미칼주식회사
Priority to CN201510201640.3A priority Critical patent/CN104862267B/zh
Priority to ES11823761.9T priority patent/ES2695044T3/es
Priority to BR112013005298-8A priority patent/BR112013005298A2/pt
Priority to DK11823761.9T priority patent/DK2614140T3/en
Priority to PT11823761T priority patent/PT2614140T/pt
Priority to EP11823761.9A priority patent/EP2614140B8/en
Priority to RS20181032A priority patent/RS57656B1/sr
Priority to LTEP11823761.9T priority patent/LT2614140T/lt
Priority to TR2018/15631T priority patent/TR201815631T4/tr
Priority to PCT/KR2011/006589 priority patent/WO2012033328A2/en
Priority to CN2011800429238A priority patent/CN103154238A/zh
Priority to HUE11823761A priority patent/HUE040534T2/hu
Priority to AU2011299761A priority patent/AU2011299761B2/en
Priority to PL11823761T priority patent/PL2614140T3/pl
Priority to JP2013527024A priority patent/JP6067560B2/ja
Priority to SI201131565T priority patent/SI2614140T1/sl
Publication of KR20120024464A publication Critical patent/KR20120024464A/ko
Priority to US13/785,757 priority patent/US20130183741A1/en
Priority to US14/711,489 priority patent/US9447383B2/en
Priority to HRP20181422TT priority patent/HRP20181422T1/hr
Priority to CY181101058T priority patent/CY1120911T1/el

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/16152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/16252—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 ATCC CCL-34 세포주로서 기탁된 MDCK 세포로부터 유도되고, 혈청 없이 배양이 가능하며, 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주, 바람직하게는 종양형성능이 낮거나 없는 것을 특징으로 하는 세포주 MDCK Sky1023, MDCK Sky10234, 및 MDCK Sky3851에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 MDCK 세포를 성장시키는 배양 방법 및 상기 MDCK 세포를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ＭＤＣＫ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법{MDCK Cell Lines Suspension-cultivated Without Serum and Methods for Preparing Vaccine Virus With Those Cell Lines}
본 발명은 혈청 없이 배양 가능하며, 담체에 부착하지 않고 부유 배양이 가능한 MDCK 신규 세포주, 이러한 세포주를 제조하는 방법, 및 이러한 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 백신의 생산을 위해서는 유정란, 마우스 뇌, 일차 세포 혹은 확립 세포가 사용된다. 이러한 전통적인 방법들은 몇 가지 문제를 가지고 있다. 예를 들어, 유정란을 사용할 경우 닭의 사육, 백신 생산 계획에 따른 수정란의 관리, 계란 단백질 유래 성분 제거를 위한 정제의 어려움 등의 문제가 있다.
세포 배양의 경우 일반적으로 증식 인자로 소태아 혈청을 첨가해준다. 혈청의 경우 프리온이나 바이러스에 의한 오염이 있을 수 있고, 제품간 품질의 차이가 날 수 있다. 게다가 호주나 뉴질랜드에서 유래된 고품질 혈청의 경우 매우 비싸기 때문에 제조 비용이 증가된다.
MDCK 세포주는 다양한 바이러스가 증식할 수 있는 확립 세포주이다. 그러나 MDCK 세포주는 표면에 대한 부착성이 매우 강하기 때문에 대량 배양을 위해서는 매우 넓은 면적의 배양 용기나 담체가 필요하고 이는 많은 비용이 든다. 따라서 시설 또는 담체에 대한 비용이 막대하며 담체에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요하며 이로 인해 세포의 손실 및 손상이 있다. 따라서 저렴하고 안전하게 동물세포 배양을 통한 백신을 제조하기 위해서는 무혈청 및 부유 배양이 가능한 세포주가 필요하다.
미국 등록특허 제6,825,036호는 무혈청 배양 및 담체가 없는 부유배양에서 증식할 수 있는 MDCK 세포주에 대해 개시하고 있다. 상기 미국특허는 부유 배양 적응을 위하여 2가지 접근법을 사용하였는데, 제 1접근법은 spinner flask에서 직접 부유배양을 시도하였으며 이 경우 세포 밀도가 산업화에 필요한 수준인 1.0 × 106 cells/ml에 도달하지 않았고, 제 2접근법의 경우 비드 담체 배양 단계를 먼저 거치면서 배양 규모를 확장한 후에 담체 부재 하에 증식할 수 있는 세포주를 수득하였다. 따라서, 세포주 수득 과정이 상대적으로 복잡하다.
또한, 원래의 MDCK 세포주들은 종양원성이 있다는 여러 보고들이 있으며, 이 때문에 백신을 생산하기 위한 세포주로 사용하는 데 있어서 잠재적인 종양원성에 대한 우려가 존재한다. 따라서 무혈청 배양 및 부유배양이 가능할 뿐 아니라 바람직하게는 종양형성성을 현저하게 낮추거나 비발암성의 특징을 갖는 세포주의 개발이 필요하다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능하다는 장점이 있고, 백신용 바이러스 증식에 사용될 수 있는 원래의 MDCK 세포주에 비해 종양형성능이 현저히 낮거나 없는 MDCK 세포주를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 세포주를 이용하여 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK (Madin Darby Canine Kidney) 세포로부터 유도되고, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 특정 MDCK 세포주를 제공한다.
상기 바람직한 특성인 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주는 다음과 같은 단계를 거쳐 제조될 수 있다. 구체적으로, S1) MDCK 세포주를 무혈청 배지에 적응시켜 무혈청 배양이 가능한 세포주를 제조하고, S2) 무혈청 배양이 가능한 세포주를 담체 적응단계 없이 부유 배양에 바로 적응시켜 담체 없이 부유 배양이 가능한 세포주를 선별하는 방법으로 제조할 수 있다.
더욱 자세하게는, (a) ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 MDCK 세포를, 화학적으로 정의된 무혈청 배지에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 적응된 부착성인 상기 MDCK 세포를, 화학적으로 정의된 무혈청 배지 중에서 담체 적응단계를 거치지 않고 바로 부유배양 적응을 유도하여 담체 없이 부유 상태에서 생장하도록 적응시킨 MDCK 세포를 제조하는 방법 및 이러한 방법을 통해 얻어진 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주를 제공한다.
바람직하게, 상기 방법을 통하여 신규 확립된 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주는 MDCK Sky1023 (DSM ACC3112), MDCK Sky10234 (DSM ACC3114), 및 MDCK Sky3851 (DSM ACC3113)이며, Braunschweig, Germany에 소재하는 기탁기관인 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 2011년 1월 27일자로 각각의 기탁번호로 기탁하였다.
본 발명에 있어, 용어 "무혈청 배지"는 혈청이 실질적으로 첨가되지 않은, 본 발명에 따른 확립세포주가 배양될 수 있는 배지를 의미하며, 용어 "실질적으로 첨가되지 않은"은 혈청을 0.5 (v/v) % 이하 포함하는 것을 의미하며, 바람직하게는 0.1 (v/v) % 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 (v/v) % 이하, 가장 바람직하게는 전혀 포함하지 않는 것을 의미한다.
미국 등록특허 제6,825,036호는 2가지 접근법을 사용하여 무혈청 배지에서 MDCK 세포주의 부유배양을 시도하였다. 제 1접근법은 spinner flask에서 직접 부유배양을 시도했으며 이 경우 세포밀도가 산업화에 필요한 수준인 1.0×106 cells/ml에 도달하지 않았다. 제 2접근법의 경우 담체 배양 단계를 거친 후에 담체 부재 하에 증식할 수 있는 세포주를 수득하였다.
그러나, 본 발명에서는 담체 적응 단계를 거치지 않고 spinner flask에서 직접 배양을 시도하여 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 신규 세포주를 확립하였다. 또한 미국 등록특허 제6,825,036호에서 확립된 B-702 세포주의 경우 약 1주일 내에 1.0×106 cells/ml에 도달하였으나 본 발명에서 확립된 세포주의 경우 약 3일 내에 1.0×106 cells/ml 이상으로 도달하며 증식능이 훨씬 우수하였다.
기존에 알려진 MDCK 세포주의 경우 종양원성에 대한 여러 보고들이 있다. 그러나 본 발명에서는 기존 MDCK 세포주 대비 종양형성능이 현저히 감소하거나 아예 종양형성능이 관찰되지 않는 세포주를 확립하였다. 구체적으로, 세포주, 세포 파쇄물, 및 세포 DNA를 이용한 누드마우스에서의 종양 형성능 확인 시험 결과 본 발명에서 신규 확립된 MDCK 세포주들은 기존 MDCK 세포주에 비해 종양형성능이 낮거나 없는 것으로 나타났고, 이러한 검증을 통해 백신 생산에 사용 가능한 안전성이 우수한 세포주, 더욱 바람직하게는 무혈청 및 부유배양이 가능한 MDCK 세포주를 확립할 수 있었다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포주를 이용하여 증식될 수 있는 바이러스는, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스, 백시니아바이러스 등이 있으며, 본 발명에 따른 세포주는 이러한 바이러스들 중 인플루엔자 바이러스의 생산에 더욱 적합하다.
보다 구체적으로, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 MDCK 세포를 이용하여 약 1×104개 내지 약 1×106개 cells/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계; (b) 약 40-100 rpm의 교반 속도, 약 6.5-7.5의 pH 및 약 35-100%의 용존 산소량(DO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 유지 하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 일회용 생물반응기 시스템에서 상기 MDCK 세포를 약 5×106개 이상 cells/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계; (c) 상기 증식된 MDCK 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; (d) 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 MDCK 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하며, 바람직하게, 본 발명의 이러한 방법은 상기 단계 (b) 동안에는 상기 세포 배양물에 신선한 배지의 추가 또는 배지를 일부 제거하여 신선한 배지로 대체하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 항원을 제공하며, 이러한 바이러스 항원을 포함하는 면역원성 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능하며 종양형성능이 낮거나 없는 장점이 있는, 바이러스 증식에 효율적으로 사용될 수 있는 신규 MDCK 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 세포주를 이용하여 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명에 따른 MDCK 세포주들을 스피너(spinner) 플라스크에서 부유 배양한 결과로, 계대에 따른 세포 농도 증가 형태를 보여준다.
도 2는 인플루엔자 바이러스의 대표적인 정제공정 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 MDCK 세포주에서 증식된 바이러스 정제 시료를 이용한 동물 실험 혈청의 HI test 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 무혈청 부유배양 MDCK 세포주의 제조
MDCK 세포주 CCL-34는 ATCC에서 분양 받았다. T-25 플라스크 내 10% 혈청을 포함한 EMEM 배지에서 배양 온도 37℃이고 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 세포를 확장한 후 상기 배지에 무혈청 배지를 50% 포함한 배지에 배양을 하고 세포의 이상이 없는지 확인하였다. 세포의 성장에 이상이 없을 경우 무혈청 배지 75% 포함한 배지에서 배양을 해주고 상기 방법을 반복하여 100% 무혈청 배지에 적응된 세포주를 확보하였다. 무혈청 배양에 사용된 배지는 예를 들면 EX-CELL MDCK (Sigma), UltraMDCK (Lonza), VP-SFM (Invitrogen) 등을 들 수 있다.
무혈청 배지에 적응된 세포주를 T-플라스크에서 충분히 확장한 후 스피너(spinner) 플라스크(Corning)에서 부유 배양 적응을 시작하였다. 교반속도는 40~80rpm이고 배양 온도 37℃이고 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 배지의 pH가 낮아지거나 세포가 일정 수준이상으로 자랐을 경우 배지 교환을 해주거나 계대 배양을 해주었다. 3~6개월의 부유 배양 적응을 거친 후 세포 농도가 2×106 cells/ml 이상이 되었다. 세포의 생존율은 95% 이상이고 단일 세포로 부유 배양이 되는 것을 확인하였다. 부유 배양에 사용된 배지는 예를 들면 EX-CELL 302 CHO (Sigma), UltraCHO (Lonza), SMIF-6 (Invitrogen) 등을 들 수 있다. 상기 방법으로 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주 3종을 확보하였으며 각각 MDCK Sky1023, MDCK Sky10234, 및 MDCK Sky3851로 명명하였다.
<실시예 2> 세포주의 증식성 평가
무혈청 배양 MDCK 세포주를 하기 표 1의 조건 하에서 배양하여 그 증식성을 평가하였다. 대조군으로서 10% 혈청을 포함한 배지에서 성장하는 MDCK 세포(ATCC CCL-34)를 사용하였다.
본 발명 세포주들 대조군(ATCC CCL-34)
배양배지 EX-CELL MDCK(Sigma), UltraMDCK(Lonza), VP-SFM(Invitrogen) EMEM(Lonza)
첨가물 L-글루타민(Lonza) 2% v/v L-글루타민(Lonza) 2% v/v, 우태아 혈청(Lonza) 10% v/v
배양조건 37℃, 5% CO2, 습윤하 37℃, 5% CO2, 습윤하
배양부피 T-75 flask (15ml) T-75 flask (15ml)
배양 개시 당시의 세포 농도는 약 1.0×105 cells/ml이었으며, 계대 조건은 세포 농도가 약 1×106 cells/ml에 도달하였을 때, 혹은 배양 3일 내지 4일경과 후에 계대 배양을 수행하였고, 개시 세포 농도는 1×105 cells/ml로 다시 조정하였다.
본 발명에서 만들어진 무혈청 MDCK 세포주들은 혈청 배지에서 성장하는 MDCK 세포주와 비교했을 때 동등한 수준의 세포 성장율을 보였다.
<실시예 3> 세포주의 증식 형태 및 계대 안정성 평가
무혈청 배양 및 부유배양 적응된 세포주 3종에 대하여 스피너(spinner) 플라스크에서 연속적으로 배양하여 세포 증식 형태 및 계대에 따른 안정성을 확인하였다. 배양 개시 세포 농도는 약 4×105 cells/ml로 하였고 배양 약 3일 내지 4일 경과 후 세포 농도는 약 2×106 cells/ml 이상까지 도달하였다. 배양 조건은 하기와 같다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
개시 세포 농도: 4×105 cells/ml
배양 규모: 50ml spinner flask
Spinner 회전수: 60 rpm
배양 조건: 37℃, 5% CO2, 습윤하
계대 조건: 배양 3~4일 경과 후
<실시예 4> 바이러스 증식 평가
본 발명의 상기 MDCK 세포들을 이용하여 부유 배양 조건에서 바이러스를 증식시켰다. 본 실험에 사용된 바이러스는 2010/2011년 인플루엔자 백신 균주였으며, 배양 조건은 하기와 같다.
세포 농도: 2×106 cells/ml
배양 규모: 1000ml spinner flask
Spinner 회전수: 60 rpm
배양 조건: 34℃, 5% CO2, 습윤하
배양 기간: 3일
통상적으로, 인플루엔자 바이러스의 배양 시 37℃ 보다 34℃에서 더 증식이 잘 된다고 알려져 있으며, 이를 실험을 통하여 확인하였다. 또한, cells주를 이용한 바이러스 배양 시 감염을 위하여 트립신을 배양배지에 포함하였다. 인플루엔자 바이러스의 역가 측정은 heamagglutination assay를 수행하여 측정하였다. 3일간 배양 후, 대부분의 세포가 사멸하였으며, 배양 상층액을 회수하고 바이러스 역가를 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이 대부분 1024 이상의 HA 역가(titer)를 나타냈다. 이러한 바이러스 증식은 발육중인 계란 또는 10% 혈청에서 배양된 MDCK 세포의 것과 유사한 수준이었다. 따라서, 본 발명의 MDCK 세포주가 무혈청 및 부유 배양 상태에서 바이러스를 효율적으로 제조할 수 있음이 판명되었다.
바이러스 MDCK Sky1023 MDCK Sky10234 MDCK Sky3851
A/California/07/2009(H1N1) 512 1024 2048
A/perth/16/2009(H3N2) 1024 1024 4096
B/Brisbane/60/2008 4096 2048 4096
<실시예 5> 증식된 바이러스의 항체 형성능 확인
본 발명의 상기 MDCK 세포에서 증식된 인플루엔자 바이러스의 항체 형성능을 확인하기 위하여 배양액으로부터 바이러스를 정제한 후 마우스에 접종하여 항체가를 확인하였다. 정제공정 흐름도를 도 2에 나타냈으며, 대략의 정제공정은 하기와 같다.
먼저 바이러스 배양액을 원심분리하여 세포 잔존물을 제거하고 0.45 마이크로미터 크기의 필터를 이용하여 여과하였다. 300kDa cut-off 크기의 한외여과 필터를 이용하여 농축 한 후 포르말린으로 바이러스를 불활화하였다. 이 후 바이러스 배양액을 수크로오스 농도구배를 이용한 초원심분리를 이용하여 바이러스를 분리하였고, Triton X-100을 처리하여 바이러스를 분쇄한 후 한외여과를 통하여 농축 및 세정제(detergent)를 제거하였으며, 0.2 마이크로미터 크기의 필터로 제균 및 여과하여 백신 원액을 획득하였다.
효력 확인을 위한 동물실험은 본 발명의 MDCK 세포주인 MDCK Sky1023, MDCK Sky10234, 및 MDCK Sky3851 3개의 세포주를 이용하여 증식된 A/California/07/2009(H1N1) 바이러스주의 정제 원액을 사용하였으며, 대조군으로서 08/09년도(IVR-148, NYMC X-175C, B/Florida/4/2006)의 인플루엔자 백신을 사용하였다. 시험군은 총 6군으로 하여 한 시료당 마우스 5마리씩 접종하였으며 항체가는 5마리의 혈청을 합하여 HI (Heamagglutination inhibition) test를 수행하여 측정하였다.
시료를 마우스에 주사하기 전에 모세관을 이용하여 안와정맥총에서 0주차 혈청을 얻기 위해 채혈하였다. 채혈 후 마우스 뒷다리에 각각 100㎕씩 총 200㎕를 IM 경로로 주사하였고, 2주 후 2주차 혈청을 얻기 위해 안와정맥총에서 동일한 방법으로 채혈하고 0주차에 주사하였던 시료를 동량으로 재접종하여 boosting 시켰다. 2주 후 4주차 혈청을 얻기 위해 안와정맥총에서 채혈하였다.
HI 시험을 수행하기 위하여 하기와 같은 방법으로 혈청을 처리하였다. 마우스로부터 채혈하여 모두 합친 혈청에서 30㎕씩 따로 혈청을 취하여 RDE 90㎕를 넣고 37℃에서 18시간 이상 방치하였다. RDE를 불활화시키기 위하여 56℃에서 30분 이상 방치하였다. 이어서 0.85% 생리식염수(saline) 120㎕를 넣고 닭 적혈구를 총량의 1/20 부피인 15㎕씩 넣고 잘 부유시킨 후 4℃에서 1시간 방치하였으며, 이 때 30분 간격으로 가라앉은 혈구를 재부유 시켜주었다. 이 후 1200rpm에서 10분간 원심분리한 후 혈청만 따로 분리하였고, 이렇게 얻어진 혈청으로 HI test를 수행하여 항체가를 측정하였다.
그 측정 결과를 표 3에 나타내었다. 모든 실험군에서 HI 역가가 40 이상 측정되었다. 즉, 본 발명의 MDCK 세포로부터 배양된 바이러스가 기존 백신과 유사하게 동물에 주사하였을 때 바이러스에 대한 항체가 형성됨을 확인할 수 있었다. 이 결과로 미루어 보아, 본 발명의 MDCK 세포주가 바이러스 백신의 제조에 사용 가능하다는 점을 확인할 수 있었다.
실험군 세포주 접종 항원량 HI titer
1 MDCK Sky1023 15ug/마리 80
2 MDCK Sky10234 15ug/마리 160
3 MDCK Sky10234 7.5ug/마리 160
4 MDCK Sky3851 15ug/마리 80
5 MDCK Sky3851 7.5ug/마리 80
6 Reference vaccine 320
<실시예 6> 세포주에 대한 누드마우스에서의 종양 형성능 확인
본 발명의 MDCK Sky1023 및 MDCK Sky3851 세포주에 대한 종양형성 능력을 평가하기 위하여 세포주 및 세포유래물질을 누드마우스의 피하에 이식한 후 12주간 종양의 형성을 관찰하였다. 시험동물은 BALB/c- nu / nu 계통의 마우스를 사용하였다. 접종샘플은 cell (세포수 101, 103, 105, 및 107), cell lysate (세포수 105 및 107), cell DNA (세포수 105, 및 107)이고 각 군 당 5~10 마리씩 접종하였다. 실험결과는 표 4에 나타내었으며 본 발명의 MDCK Sky1023 및 MDCK Sky3851 세포주의 경우 내부 대조군인 orginal MDCK (ATCC) 세포주에 비해 종양 형성이 낮거나 없는 것으로 확인되었다.
실험군 실험샘플 투여량 종양형성 동물수
음성대조군 PBS 0/5
양성대조군 HeLa Cells 105 1/5
HeLa Cells 107 5/5
내부대조군 MDCK 101 0/10
MDCK 103 0/10
MDCK 105 10/10
MDCK 107 9/10
MDCK Sky1023 Cell 101 0/10
103 0/10
105 3/10
107 10/10
Cell lysate 105 0/5
107 0/5
DNA 105 0/5
107 0/5
MDCK Sky3851 Cell 101 0/10
103 0/10
105 0/10
107 0/10
Cell lysate 105 0/5
107 0/5
DNA 105 0/5
107 0/5
DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH DSMACC3112 20110127 DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH DSMACC3113 20110127 DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH DSMACC3114 20110127

Claims (10)

  1. ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK 세포로부터 유도되고, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 MDCK 세포주는 종양형성능이 원래의 MDCK 세포주에 비해 낮거나 없는 것을 특징으로 하는 MDCK 세포주.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 세포주는 MDCK Sky1023 (DSM ACC3112), MDCK Sky10234 (DSM ACC3114), 또는 MDCK Sky3851 (DSM ACC3113)인 것을 특징으로 하는 MDCK 세포주.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스 및 백시니아바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. (a) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 MDCK 세포를 이용하여 1×104개 내지 1×106개 cells/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계;
    (b) 40-100 rpm의 교반 속도, 6.5-7.5의 pH 및 35-100%의 용존 산소량(DO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 유지 하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 일회용 생물반응기 시스템에서 상기 MDCK 세포를 5×106개 이상 cells/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계;
    (c) 상기 증식된 MDCK 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계;
    (d) 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 MDCK 세포를 배양하는 단계; 및
    (e) 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를
    포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 (b) 동안에는 상기 세포 배양물에 신선한 배지의 추가 또는 배지를 일부 제거하여 신선한 배지로 대체하는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항의 방법에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 항원.
  10. (a) ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK 세포를 준비하는 단계;
    (b) 상기 MDCK 세포를 무혈청 배지에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 적응된 부착성인 상기 MDCK 세포를 무혈청 배지 중에서 담체를 필요로 하지 않고 부유 상태에서 생장하도록 적응시킨 MDCK 세포를 수득하는 단계를 포함하는,
    세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 세포주를 제조하는 방법.
KR1020110085902A 2010-09-06 2011-08-26 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 KR20120024464A (ko)

Priority Applications (20)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2011/006589 WO2012033328A2 (en) 2010-09-06 2011-09-06 Mdck-derived cell lines adapted to serum-free culture and suspension culture and method for preparing vaccine virus using the cells
HUE11823761A HUE040534T2 (hu) 2010-09-06 2011-09-06 Szérummentes tenyésztéshez és szuszpenziós tenyésztéshez adaptált MDCK-eredetû sejtvonalak és eljárás oltóanyagvírus elõállítására a sejtek alkalmazásával
CN2011800429238A CN103154238A (zh) 2010-09-06 2011-09-06 适应于无血清培养和悬浮培养的mdck来源的细胞系与利用该细胞制备疫苗病毒的方法
AU2011299761A AU2011299761B2 (en) 2010-09-06 2011-09-06 MDCK-derived cell lines adapted to serum-free culture and suspension culture and method for preparing vaccine virus using the cells
ES11823761.9T ES2695044T3 (es) 2010-09-06 2011-09-06 Líneas celulares derivadas de MDCK adaptadas a un cultivo exento de suero y a un cultivo en suspensión, y procedimiento para la preparación de un virus para una vacuna usando las células
EP11823761.9A EP2614140B8 (en) 2010-09-06 2011-09-06 Mdck-derived cell lines adapted to serum-free culture and suspension culture and method for preparing vaccine virus using the cells
RS20181032A RS57656B1 (sr) 2010-09-06 2011-09-06 Mdck-izvedene ćelijske linije prilagođene kulturi bez seruma i suspenzijskoj kulturi i postupak proizvodnje virusne vakcine koristeći navedene ćelije
LTEP11823761.9T LT2614140T (lt) 2010-09-06 2011-09-06 Mdck išvestos ląstelių linijos, adaptuotos auginimui terpėje be serumo, auginimas suspensijoje ir vakcinos viruso paruošimo būdas, naudojant ląsteles
TR2018/15631T TR201815631T4 (tr) 2010-09-06 2011-09-06 Serumsuz kültüre ve süspansiyon kültürüne uyarlanan mdck türevi hücre hatları ve bu hücreleri kullanarak aşı virüsü hazırlamak için yöntem.
CN201510201640.3A CN104862267B (zh) 2010-09-06 2011-09-06 适应于无血清培养和悬浮培养的mdck来源的细胞系与利用该细胞制备疫苗病毒的方法
BR112013005298-8A BR112013005298A2 (pt) 2010-09-06 2011-09-06 Linhagem celular derivada de rim canino de madin-darby (mdck), método para produzir um vírus vaccinia usando a linhagem celular derivada de mdck, método para produzir um vírus influenza a partir de uma cultura de célula, vírus ou antígeno de vírus e método para preparar uma linhagem celular derivada de mdck
PT11823761T PT2614140T (pt) 2010-09-06 2011-09-06 Linhagens celulares derivadas de mdck adaptadas para cultura em meio de cultura isento de soro e cultura em suspensão e método para preparação de um vírus vacínico com a utilização das células
DK11823761.9T DK2614140T3 (en) 2010-09-06 2011-09-06 MDCK DERIVATIVE CELL LINES ADAPTED TO SERUM-FREE CULTURE AND SUSPENSION CULTURE AND PROCEDURE FOR PREPARING VACCINE VIRUS USING THE CELLS
PL11823761T PL2614140T3 (pl) 2010-09-06 2011-09-06 Linie komórkowe pochodzące z MDCK zaadoptowane do hodowli wolnej od surowicy i hodowli zawiesinowej oraz sposób wytwarzania wirusa szczepionkowego z zastosowaniem tych komórek
JP2013527024A JP6067560B2 (ja) 2010-09-06 2011-09-06 無血清培養及び浮遊培養に適応されたｍｄｃｋ細胞株及び前記細胞を使用してワクチン用ウイルスを製造する方法
SI201131565T SI2614140T1 (sl) 2010-09-06 2011-09-06 Celične linije pridobljene iz MDCK prilagojene kulturi brez seruma in kulturi suspenzije in postopek priprave cepiva proti virusu z uporabo teh celic
US13/785,757 US20130183741A1 (en) 2010-09-06 2013-03-05 Mdck-derived cell lines adapted to serum-free culture and suspension culture and method for preparing vaccine virus using the cells
US14/711,489 US9447383B2 (en) 2010-09-06 2015-05-13 MDCK-derived cell lines adapted to serum-free culture and suspension culture and method for preparing vaccine virus using the cells
HRP20181422TT HRP20181422T1 (hr) 2010-09-06 2018-09-05 Mdck-derivirane stanične linije prilagođene kulturi bez seruma i suspenzijskoj kulturi te postupak proizvodnje virusa cjepiva koristeći navedene stanice
CY181101058T CY1120911T1 (el) 2010-09-06 2018-10-16 Παραγομενες απο mdck κυτταρικες σειρες προσαρμοσμενες σε απαλλαγμενη απο ορο καλλιεργεια και καλλιεργεια εναιωρηματος και μεθοδος για παρασκευη ιου εμβολιου χρησιμοποιωντας τα κυτταρα

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2010/006041 WO2012033236A1 (ko) 2010-09-06 2010-09-06 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
WOPCT/KR2010/006041 2010-09-06

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150063976A Division KR101577745B1 (ko) 2010-09-06 2015-05-07 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120024464A true KR20120024464A (ko) 2012-03-14

Family

ID=45810820

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110085902A KR20120024464A (ko) 2010-09-06 2011-08-26 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
KR1020150063976A KR101577745B1 (ko) 2010-09-06 2015-05-07 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150063976A KR101577745B1 (ko) 2010-09-06 2015-05-07 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20130183741A1 (ko)
EP (1) EP2614140B8 (ko)
JP (1) JP6067560B2 (ko)
KR (2) KR20120024464A (ko)
CN (2) CN103154238A (ko)
AU (1) AU2011299761B2 (ko)
BR (1) BR112013005298A2 (ko)
CY (1) CY1120911T1 (ko)
DK (1) DK2614140T3 (ko)
ES (1) ES2695044T3 (ko)
HR (1) HRP20181422T1 (ko)
HU (1) HUE040534T2 (ko)
LT (1) LT2614140T (ko)
PL (1) PL2614140T3 (ko)
PT (1) PT2614140T (ko)
RS (1) RS57656B1 (ko)
SI (1) SI2614140T1 (ko)
TR (1) TR201815631T4 (ko)
WO (2) WO2012033236A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101370512B1 (ko) * 2013-06-07 2014-03-06 재단법인 목암생명공학연구소 무단백 배지에서 부유 배양되는 mdck 유래 세포주 및 상기 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시키는 방법
WO2019004556A1 (ko) * 2017-06-26 2019-01-03 에스케이바이오사이언스 주식회사 무혈청 배지에서 부유배양 되는 vero 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
WO2021221338A1 (ko) 2020-04-29 2021-11-04 에스케이바이오사이언스(주) 일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법 및 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9254318B2 (en) 2006-03-31 2016-02-09 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
US9474798B2 (en) 2007-06-18 2016-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
US9109013B2 (en) 2009-10-26 2015-08-18 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
WO2012033236A1 (ko) * 2010-09-06 2012-03-15 에스케이케미칼 주식회사 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
JP6152535B2 (ja) * 2012-04-16 2017-06-28 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 細胞培養組成物及びインフルエンザウイルスの生産方法
CN104059873B (zh) * 2013-03-20 2016-09-28 上海生物制品研究所有限责任公司 用于扩增流感病毒的非致瘤性mdck细胞系及其筛选方法
JP2016524915A (ja) 2013-07-15 2016-08-22 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション Ｍｄｃｋ、ベロ細胞又は卵内で増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス
CN104726392B (zh) * 2013-12-18 2018-09-28 普莱柯生物工程股份有限公司 一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用
WO2015196150A2 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
US9890363B2 (en) 2015-07-06 2018-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
JP6971994B2 (ja) * 2015-10-30 2021-11-24 ナショナル ヘルス リサーチ インスティチューツ ワクチン生産のための無血清合成培地中のｍｄｃｋ浮遊細胞株
US11197925B2 (en) 2016-02-19 2021-12-14 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza B virus replication for vaccine development
CN107460156B (zh) * 2016-06-03 2022-03-11 兆丰华生物科技(南京)有限公司北京生物医药科技中心 无血清全悬浮mdck细胞株及其在生产流感病毒中的应用
CN105861422B (zh) * 2016-06-24 2019-05-24 肇庆大华农生物药品有限公司 一种适应无血清全悬浮培养的mdck细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的mdck细胞系
EP3299454A1 (en) * 2016-09-21 2018-03-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Optimized method for large scale production of parvovirus h-1 in an essentially serum-free medium
CN106884003A (zh) * 2017-01-22 2017-06-23 西北民族大学 无成瘤性mdck细胞克隆株
CN106801031A (zh) * 2017-01-22 2017-06-06 西北民族大学 无成瘤性mdck细胞克隆株
KR102453351B1 (ko) * 2017-07-05 2022-10-07 에스케이바이오사이언스(주) 인플루엔자 백신용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법
CN108277199B (zh) * 2018-01-17 2021-06-25 武汉生物制品研究所有限责任公司 广谱低致瘤性mdck细胞系及其应用
JP2022527235A (ja) 2019-01-23 2022-06-01 義裕 河岡 インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異
CN113874496A (zh) 2019-02-08 2021-12-31 威斯康星校友研究基金会(Warf) 人源化细胞系
CN109852580A (zh) * 2019-03-27 2019-06-07 西北民族大学 无血清悬浮培养型mdck细胞株及其应用
CN109852579A (zh) * 2019-03-27 2019-06-07 西北民族大学 无血清悬浮培养型mdck细胞株及其应用
CN114929269A (zh) 2019-05-01 2022-08-19 威斯康星校友研究基金会(Warf) 用于疫苗开发的改进的流感病毒复制
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
CN110669722A (zh) * 2019-10-23 2020-01-10 长春生物制品研究所有限责任公司 一种用于mdck细胞的无血清全悬浮驯化方法
KR102444684B1 (ko) * 2020-04-29 2022-09-16 에스케이바이오사이언스(주) 일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법
CN112195148B (zh) * 2020-08-17 2023-01-03 上海生物制品研究所有限责任公司 无血清悬浮适应的mdck细胞及其在制备流感病毒疫苗中的应用
CN112410305A (zh) * 2020-11-26 2021-02-26 中国医学科学院病原生物学研究所 一种高产的流感病毒制备体系及制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100797547B1 (ko) * 2000-03-03 2008-01-24 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼 무혈청 배양 및 부유 배양에서 사용할 수 있는 세포 및상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
DE10144906B4 (de) * 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
ATE547511T1 (de) * 2004-12-23 2012-03-15 Medimmune Llc Nichttumorbildende mdck-zellinie zur vermehrung von viren
KR20090057015A (ko) * 2006-09-11 2009-06-03 노파르티스 아게 난을 사용하지 않는 인플루엔자 바이러스 백신의 제조
RU2015103990A (ru) * 2008-09-24 2015-10-27 Медиммун, Ллк Способы культивирования клеток, размножения и очистки вирусов
WO2012033236A1 (ko) * 2010-09-06 2012-03-15 에스케이케미칼 주식회사 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101370512B1 (ko) * 2013-06-07 2014-03-06 재단법인 목암생명공학연구소 무단백 배지에서 부유 배양되는 mdck 유래 세포주 및 상기 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시키는 방법
WO2014196795A1 (ko) * 2013-06-07 2014-12-11 재단법인 목암생명공학연구소 무단백 배지에서 부유 배양되는 mdck 유래 세포주 및 상기 세포주를 이용하여 바이러스를 증식시키는 방법
CN105378072A (zh) * 2013-06-07 2016-03-02 财团法人牧岩生命工学研究所 在无蛋白培养基中悬浮培养的mdck来源的细胞系和使用该细胞系扩增病毒的方法
US10017743B2 (en) 2013-06-07 2018-07-10 Mogam Biotechnology Institute MDCK-derived cell strain suspension-cultured in protein-free medium and method for proliferating virus using cell strain
WO2019004556A1 (ko) * 2017-06-26 2019-01-03 에스케이바이오사이언스 주식회사 무혈청 배지에서 부유배양 되는 vero 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
WO2021221338A1 (ko) 2020-04-29 2021-11-04 에스케이바이오사이언스(주) 일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법 및 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험

Also Published As

Publication number Publication date
US9447383B2 (en) 2016-09-20
PL2614140T3 (pl) 2019-02-28
JP2013540431A (ja) 2013-11-07
DK2614140T3 (en) 2018-10-22
KR101577745B1 (ko) 2015-12-16
CN104862267B (zh) 2019-07-12
CN104862267A (zh) 2015-08-26
US20130183741A1 (en) 2013-07-18
KR20150056519A (ko) 2015-05-26
RS57656B1 (sr) 2018-11-30
ES2695044T3 (es) 2018-12-28
WO2012033328A3 (en) 2012-06-28
TR201815631T4 (tr) 2018-11-21
JP6067560B2 (ja) 2017-01-25
EP2614140B8 (en) 2018-10-17
SI2614140T1 (sl) 2018-11-30
WO2012033236A1 (ko) 2012-03-15
WO2012033328A2 (en) 2012-03-15
LT2614140T (lt) 2018-10-25
US20150247128A1 (en) 2015-09-03
CN103154238A (zh) 2013-06-12
HUE040534T2 (hu) 2019-03-28
EP2614140A2 (en) 2013-07-17
EP2614140A4 (en) 2014-03-05
AU2011299761B2 (en) 2017-01-05
BR112013005298A2 (pt) 2020-01-07
EP2614140B1 (en) 2018-08-08
PT2614140T (pt) 2018-11-22
HRP20181422T1 (hr) 2018-10-19
CY1120911T1 (el) 2019-12-11
AU2011299761A1 (en) 2013-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20120024464A (ko) 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
KR100797547B1 (ko) 무혈청 배양 및 부유 배양에서 사용할 수 있는 세포 및상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
JP4243349B2 (ja) インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法
KR100968141B1 (ko) 세포 배양물에서 바이러스의 증식 방법
KR101548790B1 (ko) 백신 제조를 위한 고역가 폴리오바이러스의 제조
KR100999345B1 (ko) Ｍｄｃｋ 세포 현탁 배양물 중에서 약물 또는 진단제 활성 성분의 생산 방법
JP4693839B2 (ja) 動物由来の成分なしで培養可能である細胞株及びその作出方法、これを用いたウイルスの生産方法、及びワクチンの生産方法
KR101831284B1 (ko) 무혈청 배지에서 부유배양 되는 Vero 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
JP6166842B2 (ja) 無タンパク質培地中で懸濁培養されたｍｄｃｋ由来細胞株およびそのような細胞株を使用してウイルスを増殖させる方法
JP6110357B2 (ja) イヌ腎細胞の浮遊培養物においてウイルスを複製する方法
JP2023505101A (ja) 無血清培地で浮遊培養可能な新規のベロ細胞株、その製造方法、及び該新規細胞株を用いたワクチン用ウイルスの製造方法
CN110669739A (zh) 一种新型甲型肝炎病毒抗原制备方法
CN112870343A (zh) 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法
CN102406928A (zh) 一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法
Yu et al. Reproduction of Strain Sof'in Forest-Spring Encephalitis in Vero Cell Line Cultured on Microcarrier under Pseudo-submerged Conditions

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
E601 Decision to refuse application