WO2019004556A1 - 무혈청 배지에서 부유배양 되는 vero 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 - Google Patents

무혈청 배지에서 부유배양 되는 vero 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 Download PDF

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vero
cell line
serum
cell
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곽준석
함동수
이건세
이수진
김창신
김훈
이현주
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에스케이바이오사이언스 주식회사
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a novel Vero cell line capable of suspension culture in a serum-free medium, a method for producing such a cell line, and a method for producing a vaccine virus using such a cell line.
  • fertilized eggs Generally, fertilized eggs, mouse brain, primary cells or established cells are used for vaccine production. These traditional methods have some problems. For example, when fertilized eggs are used, there are problems such as breeding of chickens, management of embryos according to vaccine production plan, and difficulty of refining to remove ingredients derived from egg protein.
  • fetal serum is usually added as a growth factor. Serum may be contaminated by prions or viruses, and quality differences may occur between products. In addition, high quality serum derived from Australia or New Zealand is very expensive and increases manufacturing costs.
  • the Vero cell line is an established cell line capable of multiplying various viruses.
  • a large-scale culture container or carrier is required for mass culture, which is costly.
  • the cost of the facility or carrier is enormous and a step of removing cells attached to the culture vessel is required, which results in cell loss and damage. Therefore, in order to produce a vaccine through animal cell culture inexpensively and safely, a cell line capable of serum-free and floating culture is required.
  • a problem to be solved by the present invention is to provide a Vero cell line having the advantage of being capable of serum-free culture and floating culture, and having a low tumor-forming ability which can be used for vaccine virus propagation.
  • the present invention also provides a method for producing viruses, particularly rotavirus and poliovirus, using the cell lines.
  • the present invention relates to a method for producing a cell line derived from ATCC CCL-81 or Vero (African Green Monkey Kidney) cells distributed by WHO, Specific Vero cell lines capable of culturing.
  • Vero cell lines capable of serum-free culture and suspension culture which are the above-mentioned preferable characteristics, can be produced through the following steps. Specifically, S1) Vero cell line was stepwise reduced to a serum-free medium to prepare a cell line capable of serum-free culture. S2) A cell line capable of serum-free culture was prepared from two types of culture containers An ultra-low attachment flask, or a spinner flask) to select a cell line capable of suspension culture.
  • step (A) preparing Vero cells distributed from ATCC CCL-81 or WHO; (b) adapting said Vero cells to grow in chemically defined serum-free medium; And (c) adapting the adhered Vero cells in step (b) to induce suspension culture adaptation over two steps in a chemically defined serum-free medium to finally adapt to growth in a floating state in a spinner flask And a Vero cell line capable of serum-free and suspension culture obtained through such a method.
  • the Vero SK7458 (Accession No .: KCLRF-BP-00377), a newly established serum-free and floating cultureable Vero cell line, is deposited at the Korean Cell Line Bank on Oct. 27,
  • serum-free medium means a medium in which the established cell line according to the present invention can be cultured in which substantially no serum is added, and the term " (v / v)%, more preferably not more than 0.01 (v / v)%, and most preferably not at all.
  • a cell line in which tumor formation ability is not observed was established. Specifically, as a result of confirming the tumor-forming ability in nude mice using cell lines, cell lysates, and cell DNA, the newly established Bello cell line showed no tumorigenicity, and the safety that can be used for the production of vaccine It was possible to establish a superior cell line, more preferably a serum-free and serum-free Bero line cell line.
  • the present invention also provides a method for producing a vaccine virus using a cell line according to the present invention.
  • Viruses which can be propagated using the cell line according to the present invention include viruses such as rotavirus, dengue virus, influenza virus, measles virus, Japanese encephalitis virus, mumps virus, rubella virus, poliovirus, HSV- 2, rabies virus, RS virus, reovirus type 3, yellow fever virus, parvovirus, cocksuck virus, adenovirus type 1 to 47 type, lasa virus and vaccinia virus. Which is more suitable for the production of rotavirus and poliovirus.
  • the present invention relates to a method for producing a vaccine composition
  • a method for producing a vaccine composition comprising: (a) using Vero cells according to the present invention, an inoculation concentration of 1 x 10 5 to 9 x 10 5 cells / ml, preferably an inoculation concentration of about 5 x 10 5 cells / Inoculated with a serum-free cell culture medium; (b) culturing the cells while maintaining culture conditions at a stirring rate of 40 to 80 rpm, preferably at a stirring rate of about 60 rpm, and at a pH of about 6.5 to 7.5, in a spinner flask Vero cells were seeded at 1.0 x 10 < 6 > Growing at a cell density of 2.0 x 10 6 cells / ml, preferably at a cell density of about 1.5 x 10 6 cells / ml; (c) infecting the proliferated Vero cells with a virus; (d) culturing said infected pro
  • the present invention also provides a virus or viral antigen produced by the method according to the present invention, and provides an immunogenic pharmaceutical composition comprising such a viral antigen.
  • the present invention provides a novel Vero cell line which can be used efficiently for virus multiplication, which is capable of serum-free culture and suspension culture and has low or no tumorigenicity.
  • the present invention also provides methods for producing viruses, particularly rotaviruses and polioviruses, using such cell lines.
  • FIG. 1 shows the results of suspension culture of serum-free Vero cell lines according to the present invention in an ultra-low attachment flask.
  • FIG. 2 shows the morphology of increased cell concentration of the Vero cell lines according to the present invention as a result of suspension culture in a spinner flask.
  • FIG. 3 is a plaque assay result of a rotavirus sample proliferated in a Vero cell line according to the present invention.
  • Figure 4 shows the tumor size change as a result of the tumorigenicity test.
  • Figure 5 shows the tumor size measured at 16 weeks after the tumorigenicity test.
  • FIG. 6 shows photographs of tumors taken at the 1 st, 8 nd and 16 th weeks of administration of the tumorigenicity test.
  • the Vero cell line CCL-81 was distributed at the ATCC.
  • the cells were cultured in EMEM medium containing 10% serum in a T-75 flask at a culture temperature of 37 ° C and 5% CO 2 . After the cells were expanded, the medium was cultured in a medium containing 50% serum-free medium to confirm that there was no abnormality in the cells. When there was no abnormality in the growth of the cells, the cells were cultured in a medium containing 75% of serum-free medium, and the above procedure was repeated to obtain a cell line adapted to 100% serum-free medium.
  • Examples of the medium used for serum-free culture include Sky-FM03 (Lonza) EX-CELL MDCK (Sigma) and VP-SFM (Gibco).
  • Cell lines adapted to serum-free medium were fully expanded in T-flasks and then adapted for suspension culture in Ultra-low attachment T-flasks. And cultured at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the pH of the culture medium was lowered or the cells were grown above a certain level, the medium was exchanged or subcultured. After 2 months suspension culture adaptation, stable cell growth was confirmed. The survival rate of the cells was 90% or more.
  • the cell line was fully expanded and the suspension culture adaptation was started in a spinner flask (Corning). The agitation speed was 60 rpm and incubation was carried out at a culture temperature of 37 ⁇ and 5% CO 2 .
  • the medium When the pH of the culture medium was lowered or the cells were grown above a certain level, the medium was exchanged or subcultured. After 3 to 6 months of suspension culture adaptation, the cell concentration was about 1.3 to 1.5 ⁇ 10 6 cells / ml at 3-4 days of inoculation. The survival rate of the cells was 90% or more.
  • the medium used for suspension culture include Sky-FM03 (Lonza) EX-CELL MDSK (Sigma), VP-SFM (Gibco) and the like. Vero cell line, which can be used for serum-free culture and suspension culture, was obtained by this method and named as Vero Sky7458.
  • Serum-free culture Vero cell lines were cultured under the conditions shown in Table 1, and their proliferation was evaluated.
  • a serum-free adaptive Vero cell line (VP-SFM) cultured using a microcarrier was used as a control.
  • the cells were collected, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and subcultured at 5.0 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the serum-free Vero cell lines produced in the present invention showed comparable levels of cell growth compared to Vero cell lines grown in serum medium.
  • Example 3 cell line proliferation pattern and Pass Stability evaluation
  • the cell cultures adapted to serum-free culture and suspension culture were continuously cultured in a spinner flask to confirm the stability depending on cell growth pattern and passage.
  • the culture initiation cell concentration was about 5 ⁇ 10 5 cells / ml. After about 3 to 4 days, the cell concentration reached about 1.3 to 1.5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the culture conditions were as follows. The results are shown in Fig.
  • the Vero cells of the present invention were used to propagate the virus in suspension culture conditions.
  • the virus used in this experiment was rotavirus (RV: ATCC VR-2493), and the culture conditions were as follows.
  • the virus When the virus was cultured using the cell line, trypsin was included in the culture medium for infection. The titers of rotavirus were measured by plaque assay. After incubation for 5 days, culture supernatant was collected and viral titers were measured. The measurement results are shown in Table 2 below. As shown in Table 2, the titer was 1.0 x 10 7 PFU / mL or more. These virus proliferation was similar to that of Vero cells cultured in serum-free medium. Thus, it has been found that the Vero cell line of the present invention can efficiently produce viruses in serum-free and suspended culture conditions.
  • the suspension of Vero cells of the present invention was used to propagate the virus in suspension culture conditions.
  • Vero cell line (VP-SFM) with serum-free adaptation using a microcarrier was used as a control.
  • the virus used in this experiment was a poliovirus (OPV type I Sabin strain).
  • the experimental conditions were as follows.

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Abstract

본 발명은 ATCC CCL-81 세포주로서 기탁된 Vero 세포로부터 유도되고, 혈청 없이 배양이 가능하며, 부유 배양이 가능한 Vero 세포주, 바람직하게는 종양형성능이 낮거나 없는 것을 특징으로 하는 세포주 Vero Sky7458 에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 Vero 세포를 성장시키는 배양 방법 및 상기 Vero 세포를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

무혈청 배지에서 부유배양 되는 VERO 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
본 출원은 2017년 6월 26일 출원된 대한민국출원 제10-2017-0080531호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 무혈청 배지에서 부유 배양이 가능한 Vero 신규 세포주, 이러한 세포주를 제조하는 방법, 및 이러한 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 백신의 생산을 위해서는 유정란, 마우스 뇌, 일차 세포 혹은 확립 세포가 사용된다. 이러한 전통적인 방법들은 몇 가지 문제를 가지고 있다. 예를 들어, 유정란을 사용할 경우 닭의 사육, 백신 생산 계획에 따른 수정란의 관리, 계란 단백질 유래 성분 제거를 위한 정제의 어려움 등의 문제가 있다.
세포 배양의 경우 일반적으로 증식 인자로 소태아 혈청을 첨가해준다. 혈청의 경우 프리온이나 바이러스에 의한 오염이 있을 수 있고, 제품간 품질의 차이가 날 수 있다. 게다가 호주나 뉴질랜드에서 유래된 고품질 혈청의 경우 매우 비싸기 때문에 제조 비용이 증가된다.
Vero 세포주는 다양한 바이러스가 증식할 수 있는 확립 세포주이다. 그러나 Vero 세포주는 표면에 대한 부착성이 매우 강하기 때문에 대량 배양을 위해서는 매우 넓은 면적의 배양 용기나 담체가 필요하고 이는 많은 비용이 든다. 따라서 시설 또는 담체에 대한 비용이 막대하며 배양용기에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요하며 이로 인해 세포의 손실 및 손상이 있다. 따라서 저렴하고 안전하게 동물세포 배양을 통한 백신을 제조하기 위해서는 무혈청 및 부유 배양이 가능한 세포주가 필요하다.
또한, VERO 세포주에 종양원성이 있는 경우 백신을 생산하기 위한 세포주로 사용하는 데 있어서 잠재적인 종양원성에 대한 우려가 존재한다. 따라서 무혈청 배양 및 부유배양이 가능할 뿐 아니라 바람직하게는 종양형성성을 현저하게 낮추거나 비발암성의 특징을 갖는 세포주의 개발이 필요하다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능하다는 장점이 있고, 백신용 바이러스 증식에 사용될 수 있는 종양형성능이 현저히 낮거나 없는 Vero 세포주를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 세포주를 이용하여 바이러스, 특히 로타바이러스 및 폴리오바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ATCC CCL-81 혹은 WHO에서 분양 받은 Vero (African Green Monkey Kidney) 세포로부터 유도되고, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 특정 Vero 세포주를 제공한다.
상기 바람직한 특성인 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 Vero 세포주는 다음과 같은 단계를 거쳐 제조될 수 있다. 구체적으로, S1) Vero 세포주를 단계적으로 혈청 비율을 줄여가며 무혈청 배지에 적응시켜 무혈청 배양이 가능한 세포주를 제조하고, S2) 무혈청 배양이 가능한 세포주를 부유 배양을 위한 두 종류의 배양 용기(Ultra-low attachment 플라스크, 스피너(spinner) 플라스크)를 이용하여 부유 배양에 단계적으로 적응시켜 부유 배양이 가능한 세포주를 선별하는 방법으로 제조할 수 있다.
더욱 자세하게는, (a) ATCC CCL-81 혹은 WHO에서 분양 받은 Vero 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 Vero 세포를, 화학적으로 정의된 무혈청 배지에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 적응된 부착성인 상기 Vero 세포를, 화학적으로 정의된 무혈청 배지 중에서 두 단계에 걸쳐 부유배양 적응을 유도하여 최종적으로 스피너(spinner) 플라스크에서 부유 상태로 생장하도록 적응시킨 Vero 세포를 제조하는 방법 및 이러한 방법을 통해 얻어진 무혈청 및 부유 배양이 가능한 Vero 세포주를 제공한다.
바람직하게, 상기 방법을 통하여 신규 확립된 무혈청 및 부유 배양이 가능한 Vero 세포주는 Vero Sky7458 (기탁번호: KCLRF-BP-00377)이며, 한국세포주은행에 2016년 10월 27일자로 기탁하였다.
본 발명에 있어, 용어 "무혈청 배지"는 혈청이 실질적으로 첨가되지 않은, 본 발명에 따른 확립세포주가 배양될 수 있는 배지를 의미하며, 용어 "실질적으로 첨가되지 않은"은 혈청을 0.5 (v/v) % 이하 포함하는 것을 의미하며, 바람직하게는 0.1 (v/v) % 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 (v/v) % 이하, 가장 바람직하게는 전혀 포함하지 않는 것을 의미한다.
기존에 알려진 VERO 세포주의 경우 종양원성에 대한 여러 보고들이 있다. 그러나 본 발명에서는 종양형성능이 관찰되지 않는 세포주를 확립하였다. 구체적으로, 세포주, 세포 파쇄물, 및 세포 DNA를 이용한 누드마우스에서의 종양 형성능 확인 시험 결과 본 발명에서 신규 확립된 베로 세포주는 종양형성능이 없는 것으로 나타났고, 이러한 검증을 통해 백신 생산에 사용 가능한 안전성이 우수한 세포주, 더욱 바람직하게는 무혈청 및 부유배양이 가능한 베로 세포주를 확립할 수 있었다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포주를 이용하여 증식될 수 있는 바이러스는, 예를 들어, 로타 바이러스, 뎅기 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스 및 백시니아바이러스 등이 있으며, 본 발명에 따른 세포주는 이러한 바이러스들 중 로타 바이러스 및 폴리오바이러스의 생산에 더욱 적합하다.
보다 구체적으로, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 Vero 세포를 이용하여 1×105 내지 9×105 cells/㎖의 접종 농도, 바람직하게는 약 5×105개 cells/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계; (b) 40 내지 80 rpm의 교반 속도, 바람직하게는 약 60 rpm의 교반 속도, 약 6.5-7.5의 pH의 배양 조건을 유지 하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 스피너(spinnre) 플라스크에서 상기 Vero 세포를 1.0 ×106 내지 2.0×106개 수준 cells/㎖의 세포 밀도, 바람직하게는 약 1.5×106개 수준 cells/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계; (c) 상기 증식된 Vero 세포를 바이러스로 감염시키는 단계; (d) 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 Vero 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 세포 배양 조성물로부터 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물에서 바이러스를 생산하는 방법을 제공하며, 바람직하게, 본 발명의 이러한 방법은 상기 단계 (b) 동안에는 상기 세포 배양물에 신선한 배지의 추가 또는 배지를 일부 제거하여 신선한 배지로 대체하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 항원을 제공하며, 이러한 바이러스 항원을 포함하는 면역원성 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능하며 종양형성능이 낮거나 없는 장점이 있는, 바이러스 증식에 효율적으로 사용될 수 있는 신규 Vero 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 세포주를 이용하여 바이러스, 특히 로타바이러스 및 폴리오바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명에 따른 무혈청 Vero 세포주들을 Ultra-low attachment 플라스크에서 부유 배양한 결과로, 계대에 따른 세포 농도 증가 형태를 보여준다.
도 2는 본 발명에 따른 Vero 세포주들을 스피너(spinner) 플라스크에서 부유 배양한 결과로, 계대에 따른 세포 농도 증가 형태를 보여준다.
도 3은 본 발명에 따른 Vero 세포주에서 증식된 로타바이러스 시료의 plaque assay 결과이다.
도 4는 종양원성 시험 결과 종양 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 종양원성 시험 결과 투여 후 16주에 측정된 종양 크기를 나타낸 것이다.
도 6은 종양원성 시험 결과 투여 1주차, 8주차 및 16주차에 촬영한 종양 측정 사진을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 무혈청 부유배양 Vero 세포주의 제조
Vero 세포주 CCL-81는 ATCC에서 분양 받았다. T-75 플라스크 내 10% 혈청을 포함한 EMEM 배지에서 배양 온도 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 세포를 확장한 후 상기 배지에 무혈청 배지를 50% 포함한 배지에 배양을 하고 세포의 이상이 없는지 확인하였다. 세포의 성장에 이상이 없을 경우 무혈청 배지 75% 포함한 배지에서 배양을 해주고 상기 방법을 반복하여 100% 무혈청 배지에 적응된 세포주를 확보하였다. 무혈청 배양에 사용된 배지는 예를 들면 Sky-FM03 (Lonza) EX-CELL MDCK (Sigma), VP-SFM (Gibco) 등을 들 수 있다.
무혈청 배지에 적응된 세포주를 T-플라스크에서 충분히 확장한 후 Ultra-low attachment T-플라스크에서 부유 배양 적응을 시작하였다. 배양 온도 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 배지의 pH가 낮아지거나 세포가 일정 수준이상으로 자랐을 경우 배지 교환을 해주거나 계대 배양을 해주었다. 2개월의 부유 배양 적응을 거친 후 안정적인 세포성장이 확인 되었다. 세포의 생존율은 90% 이상임을 확인하였다. 이후 상기 세포주를 충분히 확장하여 스피너(spinner) 플라스크(Corning)에서 부유 배양 적응을 시작하였다. 교반속도는 60rpm이고 배양 온도 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 배지의 pH가 낮아지거나 세포가 일정 수준이상으로 자랐을 경우 배지 교환을 해주거나 계대 배양을 해주었다. 3~6개월의 부유 배양 적응을 거친 후 세포 농도가 접종 3-4일 차에 약 1.3 ~ 1.5×106 cells/ml 수준이 되었다. 세포의 생존율은 90% 이상임을 확인하였다. 부유 배양에 사용된 배지는 예를 들면 Sky-FM03 (Lonza) EX-CELL MDSK (Sigma), VP-SFM (Gibco) 등을 들 수 있다. 상기 방법으로 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 Vero 세포주를 확보하였으며 Vero Sky7458로 명명하였다.
< 실시예 2> 세포주의 증식성 평가
무혈청 배양 Vero 세포주를 하기 표 1의 조건 하에서 배양하여 그 증식성을 평가하였다. 대조군으로서 Microcarrier를 이용하여 배양한 무혈청 적응 Vero 세포주(VP-SFM)를 사용하였다.
Figure PCTKR2018001905-appb-T000001
3일 내지 4일 경과 후 세포를 회수하여 1200rpm, 5분간 원심분리 하고 5.0×105 cells/ml 로 계대 배양하였다.
본 발명에서 만들어진 무혈청 Vero 세포주들은 혈청 배지에서 성장하는 Vero 세포주와 비교했을 때 동등한 수준의 세포 성장율을 보였다.
< 실시예 3> 세포주의 증식 형태 및 계대 안정성 평가
무혈청 배양 및 부유배양 적응된 세포주에 대하여 스피너(spinner) 플라스크에서 연속적으로 배양하여 세포 증식 형태 및 계대에 따른 안정성을 확인하였다. 배양 개시 세포 농도는 약 5×105 cells/ml로 하였고 배양 약 3~4일 경과 후 세포 농도는 약 1.3~1.5×106 cells/ml 수준까지 도달하였다. 배양 조건은 하기와 같았다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
개시 세포 농도: 5×105 cells/ml
배양 규모: 125ml spinner flask
Spinner 회전수: 60 rpm
배양 조건: 37℃, 5% CO2, 습윤하
계대 조건: 배양 3~4일 경과 후
< 실시예 4> 바이러스 증식 평가 (로타바이러스)
본 발명의 상기 Vero 세포들을 이용하여 부유 배양 조건에서 바이러스를 증식시켰다. 본 실험에 사용된 바이러스는 로타바이러스 (RV : ATCC VR-2493)였으며, 배양 조건은 하기와 같았다.
세포 농도: 1.5×106 cells/ml
배양 규모: 125ml spinner flask
Spinner 회전수: 40 rpm
배양 조건: 37℃, 5% CO2, 습윤하
배양 기간: 5일
세포주를 이용한 바이러스 배양 시 감염을 위하여 트립신을 배양배지에 포함하였다. 로타 바이러스의 역가 측정은 plaque assay를 수행하여 측정하였다. 5일간 배양 후 배양 상층액을 회수하고 바이러스 역가를 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이 1.0×107 PFU/mL 이상의 역가(titer)를 나타냈다. 이러한 바이러스 증식은 무혈청 배지에서 배양된 Vero 세포의 것과 유사한 수준이었다. 따라서, 본 발명의 Vero 세포주가 무혈청 및 부유 배양 상태에서 바이러스를 효율적으로 제조할 수 있음이 판명되었다.
Figure PCTKR2018001905-appb-T000002
< 실시예 5> 바이러스 증식 평가 ( 폴리오바이러스 )
본 발명의 부유 Vero 세포들을 이용하여 부유 배양 조건에서 바이러스를 증식시켰다. 대조군으로서 Microcarrier를 이용한 무혈청 적응 부착 Vero 세포주(VP-SFM)를 사용하였다. 본 실험에 사용된 바이러스는 폴리오바이러스 (OPV type I Sabin strain)였으며, 실험 조건은 하기와 같았다.
Figure PCTKR2018001905-appb-I000001
세포주를 이용한 바이러스 배양 시 감염을 위하여 트립신을 배양배지에 포함하였다. 폴리오바이러스의 역가 측정은 plaque assay를 수행하여 측정하였다. 1일 또는 2일간 배양 후 배양 상층액을 회수하고 바이러스 역가를 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2018001905-appb-T000003
상기 표 3에 나타난 바와 같이 본 발명의 부유 베로 세포주는 DPI 1일에 2.06×108 PFU/mL (= 2.94 ×108 TCID50/mL) 및 DPI 2일에 1.12×1010 PFU/mL (= 1.6 ×1010 TCID50/mL)의 바이러스 역가(titer)를 나타냈다. 이러한 바이러스 증식은 부착 Vero 세포의 것과 유사한 수준이었다. 따라서, 본 발명의 Vero 세포주가 무혈청 및 부유 배양 상태에서 부착 베로 세포와 동등한 정도로 바이러스를 효율적으로 제조할 수 있음이 판명되었다.
< 실시예 6> 세포주에 대한 누드마우스에서의 종양 형성능 확인
본 발명의 부유 Vero Sky7458 세포주에 대한 종양형성 능력을 평가하기 위하여 세포주 및 세포유래물질을 누드마우스의 피하에 이식한 후 16주간 종양의 형성을 관찰하였다. 시험동물은 BALB/c- nu / nu 계통의 마우스를 사용하였다. 구체적인 시험 기간 및 시험 조건은 각각 하기 표 4 및 표 5와 같았다.
Figure PCTKR2018001905-appb-T000004
Figure PCTKR2018001905-appb-T000005
실험결과는 하기 표 6에 나타내었으며 총 16주 시험 결과 본 발명의 부유 VERO 투여 군에서 종양이 관찰되지 않았고, 따라서 종양원성이 없는 것으로 확인되었다.
Figure PCTKR2018001905-appb-T000006
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국세포주은행 (KCLB, Korean Cell Line Bank)
수탁번호 : KCLRF-BP-00377
수탁일자 : 20161027
Figure PCTKR2018001905-appb-I000002
Figure PCTKR2018001905-appb-I000003

Claims (10)

  1. ATCC CCL-81로서 기탁된 베로(Vero) 세포로부터 유도되고, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 베로(Vero) 세포주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세포주는 Vero Sky7458 (기탁번호: KCLRF-BP-00377)인 것을 특징으로 하는 베로(Vero) 세포주.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 바이러스는 로타 바이러스, 뎅기 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스 및 백시니아바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 바이러스는 로타바이러스 또는 폴리오바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. (a) 제 1항 또는 제2항의 베로(Vero) 세포를 이용하여 1×105 내지 9×105 cells/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계;
    (b) 40 내지 80 rpm의 교반 속도, 6.5-7.5의 pH 배양 조건을 유지 하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 스피너(spinner)플라스크에서 상기 Vero 세포를 1.0 ×106 내지 2.0×106개 수준 cells/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계;
    (c) 상기 증식된 베로(Vero) 세포를 바이러스로 감염시키는 단계;
    (d) 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 Vero 세포를 배양하는 단계; 및
    (e) 세포 배양 조성물로부터 바이러스를 분리하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신용 바이러스를 생산하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 (b) 동안에는 상기 세포 배양물에 신선한 배지의 추가 또는 배지를 일부 제거하여 신선한 배지로 대체하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항의 방법에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 항원.
  9. (a) ATCC CCL-81로서 기탁된 베로(Vero) 세포를 준비하는 단계;
    (b) 상기 베로(Vero) 세포를 무혈청 배지에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 적응된 부착성인 상기 베로(Vero) 세포를 무혈청 배지 중에서 부착을 위한 담체를 필요로 하지 않고 부유 상태에서 생장하도록 적응시킨 베로(Vero) 세포를 수득하는 단계를 포함하는,
    세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 세포주를 제조하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 베로(Vero) 세포주는 종양형성능이 없는 것을 특징으로 하는 세포주.
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