CN112251415A - 一种鸡新城疫病毒分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡新城疫病毒的分离方法，属于病毒分离领域。本发明的方法包括如下步骤：1)将样本与终浓度为10～20μg/ml的胰酶溶液混合，孵育8～15min；2)将步骤1)所得混合物接种到AGE1细胞，培养100～140h，期间每日添加终浓度为3～8μg/ml的胰酶溶液。本发明的方法相比使用SPF鸡胚分离新城疫病毒的方法更为灵敏，应用前景良好。

Description

一种鸡新城疫病毒分离方法
技术领域
本发明属于病毒分离领域。
背景技术
鸡新城疫(Newcastle disease，ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，该病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。目前检测鸡新城疫的金标准为病毒分离鉴定，该方法是将样本接种到鸡胚或细胞内培养一定时间，得以分离出病毒，再通过血清学方法和分子生物学方法等进行病毒具体种类的鉴定。因此，鸡新城疫病毒的分离鉴定方法包括分离方法和鉴定方法两部分。
鸡新城疫病毒分离方法中，广泛使用的方法为接种SPF鸡胚进行分离(简称“SPF鸡胚法”)，但其耗时费力，受制于SPF鸡胚来源的限制，且费用较高。而接种细胞进行分离的方法(简称“细胞法”)，主要将样本接种到鸡胚成纤维细胞，该方法的分离鉴定灵敏度相对较低，其应用因此并不广泛。且鸡胚成纤维细胞是由SPF鸡胚制备的原代细胞，存在SPF鸡胚法同样的问题，另外，其制备过程复杂、易污染，增加了试验的不确定性。
鸭胚视网膜细胞(AGE1.CR.pIX细胞，以下简称AGE1细胞)，是德国ProBioGen公司从美洲鸭的胚胎视网膜中分离的细胞，转染人5型腺病毒F1基因和pIX基因后，永生化制备的细胞系，后期经过驯化，成为悬浮细胞。目前，AGE1细胞已被用于疫苗生产。但未见将其用做鸡新城疫的分离，其主要原因还是在于分离的灵敏度不够，尚无法对SPF鸡胚形成优势。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新的鸡新城疫病毒分离方法。
本发明的技术方案如下：
一种鸡新城疫病毒的分离方法，包括如下步骤：
1)将样本与终浓度为10～20μg/ml的胰酶溶液混合，孵育8～15min；
2)将步骤1)所得混合物接种到AGE1细胞，培养100～140h，期间每日添加终浓度为3～8μg/ml的胰酶溶液。
如前述的分离方法，步骤1)所述胰酶溶液终浓度为15μg/ml。
如前述的分离方法，步骤1)所述的孵育持续10min。
如前述的分离方法，步骤2)所述的培养时间是120h。
如前述的分离方法，步骤2)所述的胰酶溶液终浓度为5μg/ml。
如前述的分离方法，步骤2)所述的培养是指在35℃、8％CO2条件下培养。
如前述的分离方法，所述培养是在摇床培养，摇床转速200r/min。
本发明的有益效果如下：
本发明的方法，可以简单快捷地实现鸡新城疫病毒的分离，且灵敏度显著高于SPF鸡胚，有望取代SPF鸡胚法。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：AGE1悬浮细胞显微观察图；标尺(scale bar)：100μm。
具体实施方式
实施例1 AGE1悬浮细胞的复苏与培养
从液氮罐中取出1支AGE1细胞，37℃水浴迅速解冻，200g离心5分钟，弃去上清，用30ml细胞生长液悬浮细胞，接种于125ml摇瓶中，200r/min、37℃、5％CO2条件下培养，当细胞密度可达到4.0～6.0×106/ml，将细胞扩大传代至500ml摇瓶中，细胞起始密度为1.0×106/ml。AGE1细胞培养72h，取样，显微镜观察，细胞呈圆形，易接团，如图1所示。
实施例2鸡新城疫病毒的分离方法
将实施例1中的AGE1细胞培养达到6.0～8.0×106/ml时，分装至50ml的TPP管中，10～15ml/管，放于摇床备用。向待检样本添加终浓度为15μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min，加入到装有AGE1细胞的TPP管内200r/min、35℃、8％CO2条件下培养，每日(不含接种当日)添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液，培养120h。
实施例3鸡新城疫病毒的分离方法
将实施例1中的AGE1细胞培养达到6.0～8.0×106/ml时，分装至50ml的TPP管中，10～15ml/管，放于摇床备用。向待检样本添加终浓度为20μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育15min，加入到装有AGE1细胞的TPP管内200r/min、35℃、8％CO2条件下培养，每日(不含接种当日)添加终浓度为3μg/ml的胰酶溶液，培养100h。
实施例4鸡新城疫病毒的分离方法
将实施例1中的AGE1细胞培养达到6.0～8.0×106/ml时，分装至50ml的TPP管中，10～15ml/管，放于摇床备用。向待检样本添加终浓度为10μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育8min，加入到装有AGE1细胞的TPP管内200r/min、35℃、8％CO2条件下培养，每日(不含接种当日)添加终浓度为8μg/ml的胰酶溶液，培养140h。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。为了便于表述，本发明的鸡新城疫分离。方法简称为“AGE1细胞法”。
实验例1胰酶对分离效果的影响
方法：
实施例1的细胞培养3～4日，当细胞密度达到6.0～8.0×106/ml时，分装至50ml的TPP管中，10～15ml/管，放于摇床，以备接毒。分别取NDV基因II型La Sota株病毒和基因VII型aSG10株病毒，使用细胞培养基以10倍系列稀释后，取10-8、10-9、10-10稀释的病毒液0.1ml，分别添加终浓度为15μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min，然后将每个稀释度处理的病毒液分别接种5管AGE1悬浮细胞，200r/min、35℃、8％CO2条件下培养，每日添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液。另外，设未添加胰酶处理病毒组(仅省略一开始的15μg/ml胰酶处理，每日仍添加终浓度5μg/ml胰酶)。分别培养120h，取样进行进行HA效价测定，HA效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。
结果：
经过胰酶处理的病毒液，La Sota株10-8病毒分离5/5阳性，10-9病毒分离4/5阳性，10-10病毒分离2/5阳性，未经胰酶处理的病毒液，10-8病毒分离2/5阳性，10-9与10-10病毒分离均为0/5阳性，aSG10株10-8、10-9病毒分离均为5/5阳性，10-10病毒分离2/5阳性，未经胰酶处理的病毒液，10-8病毒分离1/5阳性，10-9与10-10病毒分离均为0/5阳性，结果详见表1。
表1胰酶对分离鉴定敏感性的影响
Figure BDA0002692863110000041
结论：添加胰酶后，不同基因型的NDV都更加容易侵染AGE1细胞，进而显著提高分离的敏感度。
实验例2本发明方法与SPF鸡胚法敏感性的比较
方法：
分别取NDV基因II型La Sota株病毒和基因VII型aSG10株病毒，10倍系列稀释后，取10-8、10-9、10-10稀释的病毒，分别按照SPF鸡胚法接种5枚鸡胚，AGE1细胞法(本实验例具体使用实施例2的方法)接种5管细胞，分别培养120小时，取样进行HA效价测定，HA效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。
其中，SPF鸡胚法具体为：
将待检测的病毒10倍系列稀释至10-10，取10-8、10-9、10-10稀释度病毒液，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每枚0.2ml，鸡胚接种后于37℃孵育120小时，每日照胚2次，弃去24小时内死亡鸡胚，分别收集24～120小时内死亡鸡胚及120小时存活鸡胚尿囊液，进行HA效价检测。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚尿囊液的HA效价不低于1：16，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，盲传一次后再进行判定。盲传后仍为阴性者，方判为病毒分离阴性。
结果：
病毒稀释到10-10接种AGE1细胞，病毒分离1/5阳性，而10-10稀释病毒接种SPF鸡胚，无阳性。结果详见表2。
表2本发明方法和SPF鸡胚法敏感性比对试验结果
Figure BDA0002692863110000042
Figure BDA0002692863110000051
结论：AGE1细胞法比SPF鸡胚法更敏感。
实验例3 AGE1细胞法检测NDV相关灭活苗的应用
方法：
取鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+SS株)，批号201807，鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS株)，批号201803，均购自成都天邦生物制品有限公司。重组新城疫病毒、禽流感病毒(H9亚型)二联灭活疫苗(aSG10株+G株)由成都天邦实验室制备。按照3种疫苗新城疫部分的攻毒效力检验法，3种疫苗分别经颈部皮下注射免疫35日龄SPF鸡各10只，另取同日龄15只SPF鸡不免疫作为对照组。接种后21日后，3种疫苗经肌肉注射相应的NDV株病毒液0.2ml(105.0ELD50/只)。攻毒后5日，分别采集存活鸡的泄殖腔拭子，分别接种SPF鸡胚和AGE1细胞进行病毒分离。
结果：
攻毒后5日，攻毒对照组，均全部死亡，免疫组观察至14日，均未死亡。病毒分离：鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+SS株)免疫组，AGE1细胞法病毒分离率为1/10，SPF鸡胚法为0/10；鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(LaSota株+M41株+SS株)免疫组，AGE1细胞法与SPF鸡胚法均为0/10；重组新城疫病毒、禽流感病毒(H9亚型)二联灭活疫苗(aSG10株+G株)免疫组，AGE1细胞法病毒分离率为1/10，SPF鸡胚法为0/10。结果详见表3。
表3 AGE1细胞分离法检测NDV相关灭活苗的应用结果
Figure BDA0002692863110000052
Figure BDA0002692863110000061
结论：
AGE1细胞法比鸡胚法分离病毒更敏感，可以替代SPF鸡胚法。
综上，本发明的鸡新城疫病毒的分离方法，结合AGE1细胞和胰酶处理，能提高新城疫病毒在细胞中的存活和增殖能力，相比传统的SPF鸡胚法具有更高的新城疫病毒分离成功率。

Claims (7)

1.一种鸡新城疫病毒的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将样本与终浓度为10～20μg/ml的胰酶溶液混合，孵育8～15min；
2)将步骤1)所得混合物接种到AGE1细胞，培养100～140h，期间每日添加终浓度为3～8μg/ml的胰酶溶液。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤1)所述胰酶溶液终浓度为15μg/ml。
3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤1)所述的孵育持续10min。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤2)所述的培养时间是120h。
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤2)所述的胰酶溶液终浓度为5μg/ml。
6.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤2)所述的培养是指在35℃、8％CO2条件下培养。
7.如权利要求6所述的分离方法，其特征在于：所述培养是在摇床培养，摇床转速200r/min。
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