CN112359142A - 一种使用全悬浮细胞测定鸡新城疫病毒含量的方法 - Google Patents

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丁莉
刘汉平
李成山
左榕琳
邢刚
岳丰雄
潘倩
何洪奎
肖倩
裴倩如
汪强
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Shiji Biotechnology Nanjing Co ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Abstract

本发明提供了一种使用全悬浮细胞测定鸡新城疫病毒含量的方法，属于病毒检测领域。本发明的方法主要包括如下步骤：1)将鸡新城疫病毒稀释成不同的稀释度；2)接种至全悬浮鸭胚视网膜细胞中培养；3)测定不同稀释度的HA效价并计算病毒滴度；步骤2)所述病毒接种时，需添加胰酶；胰酶终浓度为10‑20μg/ml。经对比，本发明的方法可以在相对较短的时间内实现对鸡新城疫病毒的检测，优于传统的鸡胚检测法。

Description

一种使用全悬浮细胞测定鸡新城疫病毒含量的方法
技术领域
本发明属于病毒检测领域,尤其涉及一种使用全悬浮细胞测定鸡新城疫病毒含量的方法。
背景技术
鸡新城疫(ND)也叫亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒(NDV)引起的禽的一种急性、高度接触性传染病，是危害我国养禽业最严重的禽病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
目前，防治鸡新城疫的主要措施是疫苗接种，主要分为活疫苗和灭活疫苗两大类，把控这两种疫苗的质量最主要的就是制苗用抗原液的病毒含量要达到标准规定，目前用来检测鸡新城疫毒种的病毒含量方法只有一种鸡胚检测法，由于SPF鸡胚需要提前订购，并且孵化至10日龄才能使用，耗时时间长，且SPF鸡胚费用较高，故需要寻求更方便简捷及准确的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鸡新城疫病毒含量的测定方法。
本发明的技术方案具体为：
一种鸡新城疫病毒含量的测定方法，它包括如下步骤：
1)将鸡新城疫病毒稀释成不同的稀释度；
2)接种至全悬浮鸭胚视网膜细胞中培养；
3)检测血凝效价(HA效价)并计算病毒滴度；
步骤2)所述病毒接种时，需添加胰酶；胰酶终浓度为10-20μg/ml。
进一步地，步骤1)所述的稀释是以10倍浓度梯度进行稀释。
进一步地，步骤2)所述胰酶的终浓度是15μg/ml。
进一步地，步骤2)所述的培养的温度是35℃。
进一步地，步骤2)接种病毒前需要补加细胞体积比15％的DMEM培养基。
进一步地，步骤2)接种病毒时细胞密度为(6～8)×106/ml。
进一步地，步骤2)是在5％CO2条件下培养。
进一步地，步骤2)所述培养的时间是72-96h。
更进一步地，步骤2)所述培养的时间是72h。
本发明具有如下有益效果：
1)病毒培养时间短：传统的鸡胚检测法需在接种病毒后培养120h，而本发明的方法只需培养72h。
2)灵敏度高：本发明相比鸡胚检测法更灵敏，能避免后者的一些漏检情况。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：AGE1悬浮细胞P3代观察图；培养时间为72h，标尺(bar)长度为100μm。
具体实施方式
实施例1本发明的病毒含量检测方法
1.全悬浮鸭胚视网膜细胞(简称“AGE1细胞”)复苏及培养
从液氮罐中取出1支细胞，37℃水浴迅速融化，200g离心5分钟弃去上清，用30ml细胞生长液悬浮细胞，接种于125ml的细胞培养摇瓶中，160r/min、37℃、5％CO2条件下培养，使其稳定传代3次(显微观察结果如图1所示)。
2.病毒含量(TCID50)的检测方法
取鸡新城疫病毒aSG10株(HA效价为8log2)，进行10倍连续梯度稀释，每个稀释度接种AGE1细胞5管，细胞培养物体积为10ml/管，接种细胞密度为8.0×106/ml，病毒接种前每管细胞中补加占细胞培养物体积15％的DMEM培养基，经计算可知，病毒接种时细胞密度为6.96×106/ml。接种量为0.1ml/管，每管中再加入终浓度为15μg/ml的胰酶，220r/min、35℃、5％CO2条件下培养72-96h，取样进行血凝效价的测定。
检测方法如下：
在96孔微量板上12个孔内全部加入PBS缓冲液，每孔0.025ml，吸等量待检样品于第一孔内，混匀后吸出同量于第二孔内混匀，以此类推稀释至第11孔，并弃去0.025ml，留第12孔作为PBS缓冲液对照，然后全部孔内加入1％鸡红细胞悬液，每孔0.025ml。将血凝板置于振荡器上振荡1～2分钟，使材料充分混均，室温静置15～30分钟判定结果，使100％红细胞凝集的最高稀释度作为判定终点。
实验例1培养时间与敏感性的关系
1.方法
使用实施例1的方法复苏AGE1细胞，传代使细胞密度达到8.0×106/ml时，取鸡新城疫病毒aSG10株进行10倍系列稀释，分别取10-7、10-8、10-9、10-10四个稀释度的病毒液，接种至AGE1悬浮细胞中，细胞培养物体积为10ml/管，每个稀释度接种5管，接毒量为0.1ml/管，每管中再添加终浓度为15μg/ml的胰酶溶液，接毒前每管细胞中补加占细胞培养物体积15％的DMEM培养基，220r/min、35℃、5％CO2条件下培养，分别在培养48h、72h、96h、120h，取样进行HA效价测定，HA效价不低于7log2，则判定为感染。
2.结果
在72h时10-7、10-8稀释度5/5感染，10-9稀释度3/5感染，10-10稀释度1/5感染，在其他时间段取样检测结果病毒感染滴度均不高于72小时，其中96h的结果与72h的结果一致。结果详见表1。
表1不同稀释鸡新城疫病毒对AGE1细胞的敏感性试验结果
Figure BDA0002770785090000031
本实验例结果表明，本发明的方法只需对病毒培养72h就可达到最高的病毒感染率。而传统的SPF鸡胚检测鸡新城疫病毒的方法需要对病毒培养120h。本发明相比传统方法更加省时。
实验例2本发明与传统的SPF鸡胚检测方法(鸡胚检测法)的敏感性对比
1.方法
1)鸡胚检测法
取鸡新城疫病毒aSG10株，进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9、10-10四个稀释度的病毒，每个稀释度接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/枚，37℃培养120h，取样进行HA效价测定，HA效价不低于7log2，判定为感染。
2)本发明的方法
同实验例1，其中培养时间为72h。
2.结果
10-7和10-9两个稀释度接种SPF鸡胚和AGE1细胞的感染率一致，稀释度10-8和10-10接种AGE1细胞，病毒分别5/5感染和1/5感染，而该两个稀释度接种SPF鸡胚，病毒分别4/5感染和0/5感染。结果详见表2。
表2 AGE1细胞方法与鸡胚检测法敏感性比对试验结果
Figure BDA0002770785090000041
本实验例表明，本发明的方法相比鸡胚检测法更为敏感。
实验例3本发明的方法在病毒检验中的应用
1.方法
选择3批鸡新城疫病毒aSG10株毒种分别采用本发明的方法(实施例1)与鸡胚检测法检测病毒的HA效价，计算其感染率(HA效价不低于7log2，判定为感染)。
同时检测其滴度，具体方法如下：
在96孔微量板上12个孔内全部加入PBS缓冲液，每孔0.025ml，吸等量待检样品于第一孔内，混匀后吸出同量于第二孔内混匀，以此类推稀释至第11孔，并弃去0.025ml，留第12孔作为PBS缓冲液对照，然后全部孔内加入1％鸡红细胞悬液，每孔0.025ml。将血凝板置于振荡器上振荡1～2分钟，使材料充分混均，室温静置15～30分钟判定结果，使100％红细胞凝集的最高稀释度作为判定终点。
2.结果
结果显示，3批毒种的病毒含量用两种方法检测，病毒滴度并无很大差异，细胞法较鸡胚检测法高0.1～0.3个滴度，结果见表3。
表3两种方法检测鸡新城疫病毒aSG10株的病毒含量结果
Figure BDA0002770785090000051
本实验例表明，本发明的方法在检测鸡新城疫病毒aSG10株的应用中，比鸡胚检测法具备更高的灵敏度，可以代替鸡胚检测法。
实验例4胰酶浓度对本发明方法的影响
取5个250ml的摇瓶培养AGE1细胞，当细胞密度培养至8.0×106/ml，按照0.0001MOI接种新城疫病毒aSG10株病毒，同时添加体积比为15％的DMEM培养基，以及添加终浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、30μg/ml的胰酶溶液，放入摇床培养，160r/min、35℃、5％CO2培养72h后收毒，测定HA效价及病毒含量。
添加胰酶终浓度的量为15μg/ml、20μg/ml时，收获病毒的HA效价及病毒含量最高，HA效价可达10log2，病毒含量为109.3～109.5EID50/0.1ml。结果详见表4。
表4胰酶最佳添加量试验结果
Figure BDA0002770785090000052
综上，本发明的方法比传统的鸡胚检测法省时、便捷。收获病毒的HA效价高(病毒感染能力强)，病毒含量高达109.3～109.5EID50/0.1ml，表明病毒易被检出，本发明的方法具有很高的灵敏度，应用价值较高。

Claims (9)

1.一种鸡新城疫病毒含量的测定方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)将鸡新城疫病毒稀释成不同的稀释度；
2)接种至全悬浮鸭胚视网膜细胞中培养；
3)检测血凝效价并计算病毒滴度；
步骤2)所述病毒接种时，需添加胰酶；胰酶终浓度为10-20μg/ml。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1)所述的稀释是以10倍浓度梯度进行稀释。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)所述胰酶的终浓度是15μg/ml。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)所述的培养的温度是35℃。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)接种病毒前需要补加占细胞培养物体积15％的DMEM培养基。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，接种病毒时细胞密度为(6～8)×106/ml。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)是在5％CO2条件下培养。
8.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)所述培养的时间是72-96h。
9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，步骤2)所述培养的时间是72h。
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