WO2020233147A1 - 一种惰性载体大肠杆菌及其潜在应用 - Google Patents

一种惰性载体大肠杆菌及其潜在应用 Download PDF

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  • Figure 3 is a genus-specific PCR identification diagram of the inert carrier E. coli SE1 of the application.
  • Lanes 1-5 are: molecular weight Marker, E. coli SE1, E. coli EDL933, E. coli DH5 ⁇ and Salmonella negative control;
  • 1 SPF chicken serum
  • 2 chicken bacterial artificial infection positive serum (bird E. coli positive serum); 3: chicken bacterial artificial infection positive serum (Salmonella positive serum); 4: chicken parasite artificial infection positive serum (chicken ball Virus infection positive serum); 5: chicken parasite artificial infection positive serum (taeniasis positive serum); 6: chicken viral artificial infection positive serum (chicken Newcastle disease positive serum); 7: chicken viral artificial infection positive serum (chicken Newcastle disease positive serum) ); 8: chicken viral artificial infection positive serum (avian influenza positive serum); 9: yellow feather broiler clinical immune serum; 10: white feather broiler clinical immune serum; 11: Guangxi Yuanfeng chicken (Lingshan fragrant chicken) clinical immune serum ; 12: Changzhou Sandeli Golden Grass clinical immunized chicken serum.

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Abstract

一种惰性载体大肠杆菌及其应用，所述惰性载体大肠杆菌已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.17339，保藏日期为2019年3月18日，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，菌株代号SE1。该大肠杆菌与不同遗传背景的多种鸡源血清不发生任何肉眼可见的凝集反应，即与不同种类鸡源血清不产生非特异性凝集反应，具有表达和表面展呈特定抗原蛋白的性能，在检测抗原或抗体的间接凝集试验中作为惰性载体。

Description

一种惰性载体大肠杆菌及其潜在应用 技术领域
本发明隶属生物技术检测领域，涉及一种惰性载体大肠杆菌、分离鉴定及其应用，鉴于这种载体大肠杆菌在工作浓度下的细菌数量与不同遗传背景多种类鸡源血清不发生非特异性凝集反应的特性，以及其在简便快速检测抗原或感染抗体的间接凝集试验检测方法的开发中提供一种惰性载体和具有潜在应用前景。
背景技术
免疫学的发展为临床上简便快速检测病原菌和感染抗体提供了许多技术方法，其中凝集试验是目前医学、兽医临床使用较为广泛的一种传统、经典的疫病快速诊断方法，其原理是细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体结合后，当有电解质存在时，抗原颗粒出现相互凝集凝聚现象，形成肉眼可见的凝集小块或颗粒。参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。平板凝集试验是凝集反应中较为常用的一种定性方法，将含有已知抗体的诊断血清(适当稀释)与待检菌悬液各滴一滴于洁净的透明玻璃平板上，等体积轻轻混合后，室温等待2分钟内，如出现肉眼可见的颗粒状凝集，即为阳性反应，常用于细菌的鉴定和血清型的分型等。相反，也可用已知的诊断抗原检测待检血清或全血中是否存在相应抗体，常用于布氏杆菌感染诊断的玻板凝集反应和鸡白痢/禽伤寒沙门氏菌全血平板凝集试验等。值得注意的是，以乳胶颗粒等惰性载体，在直接凝集反应的基础上发展起来的间接凝集试验反应扩大了检测应用范围和增加了检测反应的敏感性。
凝集试验适用于病原感染的快速诊断，具有简便快捷、不需要额外仪器，更不需昂贵仪器、成本低廉且可现场测试等众多优点，但是在实际应用中也出现了一些弊端和技术瓶颈，如以检测鸡白痢/禽伤寒沙门氏菌感染的全血平板凝集抗原为例，该凝集抗原检测在实践应用中有一定的局限性，被一直报道存在多种交叉反应明显，各批次检测结果不一致，重复性稳定性不佳，弱阳性反应导致漏检等多种影响检测结果的因素，且该法仅对成年鸡群检测效果相对敏感，对雏鸡则可能存在较大漏检检测误差。前期研究中，专利申请发明人所在实验室使用目前临床应用最广泛的商品化鸡白痢/禽伤寒沙门氏菌染色凝集抗原，分两次在不同时间检测同一批来自某鸡场200份血清时发现，检测结果总符合率仅为81％。与荷兰BioChek公司的沙门氏菌D群ELISA试剂盒对比检测结果时 发现，检测结果总符合率仅为79.5％，阳性符合率(检出率或敏感性)为75.2-79.4％，阴性符合率为79.5-85.5％。上述检测结果和比较分析表明该商品化凝集抗原检测鸡白痢/禽伤寒沙门氏菌血清抗体时，敏感性、特异性和结果准确性均未达到较为理想的水平，且每批次检测结果并不稳定和一致，重复性不佳。在应用来自同一种鸡场分离的鸡白痢沙门氏菌制备的自家凝集抗原对比检测相同的200份血清时发现，检测结果与沙门氏菌D群ELISA试剂盒的符合率从79.5％上升到88％，其中阳性符合率(检出率或敏感性)也提升到了97.5％，这一结果也证明了目前商品化凝集抗原的检测结果存在一定程度或较为明显的假阳性错检和假阴性漏检。
针对上述凝集抗原检测结果准确度，稳定重复性能有待提高和完善的瓶颈技术，究其根源，是因为目前应用于凝集试验的凝集抗原都为全菌抗原，其成分不是单一抗原，非菌体抗原O1、O9、O12单因子成分，而是复合多种抗原成分的细菌颗粒抗原，理论上说，存在与同科属、其他种属科细菌(尤其肠杆菌内)相同或同源成分和产生非特异性交叉反应，鉴于凝集抗原工作浓度的细菌数量一般较大，产生非特异性交叉反应弊端,也必然会影响甚至较为显著干扰检测和诊断结果，包括动物临床上基于该凝集试验作为疫病净化技术,用于筛选鸡白痢阳性鸡群并淘汰扑杀种禽，从而影响疫病净化效果和疫病净化工作的推进。因此，如果有一种惰性载体菌存在，且同时能选择使用表达单一抗原因子的特定惰性载体菌替代多成分的全菌抗原作为凝集抗原，在保留凝集反应结果直观，操作简便等优势的前提下，能精确和完善地提高凝集抗原反应的特异性，提高和完善凝集反应的重复稳定性，对于病原感染的现场快速诊断方法的改良和完善具有巨大的应用前景。
发明内容
发明目的：针对目前医学、兽医临床上迫切需要改进和完善特异敏感，且检测结果准确可靠，重复稳定性好的凝集抗原用于病原感染和疫病的快速诊断，本发明分离鉴定了一株惰性载体大肠杆菌，与不同种类鸡源血清不发生非特异性凝集反应，基于该惰性载体菌和其载体菌应该具备表达特征，有望在开发简便快速间接凝集检测方法中提供一种惰性载体菌和其潜在应用。
技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种惰性载体大肠杆菌SE1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.17339，保藏日期为2019年3月18日，分类命名为大 肠埃希氏菌(Escherichia coli)，菌株代号SE1。
其中，所述的载体菌(即惰性载体大肠杆菌)能在LB和伊红美蓝琼脂培养基中培养，培养方法如下：从保存的菌种中挑取少量划线于LB或伊红美蓝琼脂培养基中，培养温度为37℃，其中在LB琼脂培养基中，37℃培养后可形成灰白色圆形菌落；在伊红美蓝琼脂平板中，37℃培养后可形成无金属光泽、黑色菌落。
使用靶向大肠杆菌种属特异性uidA基因的PCR引物鉴定SE1载体菌SE1，PCR扩增出uidA基因结果与K12大肠杆菌工程菌标准株DH5α、大肠杆菌EDL933(O157:H7型大肠杆菌致弱菌株(缺失eae和stx基因)扩增条带大小一致。
按照国家标准方法(GB4789.38-2012)对上述的SE1大肠杆菌载体菌进行靛基质(吲哚、I)试验、甲基红(MR)试验、VP试验、柠檬酸盐(C)利用试验和五种糖发酵试验进行生化试验检测和鉴别，结果符合国家标准方法中描述的大肠杆菌生化特征。
本发明所述的惰性载体大肠杆菌从健康鸡群分离得到。
通过玻板凝集试验验证所述的载体菌菌悬液不存在自凝现象，与不同遗传背景的多种鸡源血清不发生非特异性凝集反应，鸡源血清包括但不限于SPF鸡血清、健康鸡血清、鸡细菌感染阳性血清(如：禽大肠杆菌阳性血清、沙门氏菌阳性血清、葡萄球菌阳性血清和巴氏杆菌阳性血清等)、鸡寄生虫感染阳性血清(如鸡球虫病阳性血清、绦虫病阳性血清等)、鸡病毒性感染阳性血清(如：鸡新城疫阳性血清、禽流感阳性血清、鸡马立克氏病阳性血清、鸡传染性法氏囊病阳性血清、鸡减蛋下降综合征阳性血清、禽脑脊髓炎病毒感染阳性血清等)和各种不同品种鸡免疫血清，其检测的凝集反应结果都为阴性。
本发明所述的惰性载体大肠杆菌在工作浓度下的细菌数量，不与O1型禽大肠杆菌感染SPF鸡血清，O2型禽大肠杆菌感染SPF鸡血清和O78型禽大肠杆菌感染SPF鸡血清发生非特异性凝集反应；而K12大肠杆菌工程菌标准株DH5α、大肠杆菌EDL933(O157:H7型大肠杆菌)等多种大肠杆菌均可与上述大肠杆菌感染SPF鸡血清发生凝集反应。
本发明内容还包括所述的惰性载体大肠杆菌在检测抗原或抗体的间接凝集试验中作为惰性载体的应用，因为该惰性载体菌SE1为颗粒性抗原，同时具备作为间接凝集试验的载体和惰性载体的承载功能。
本发明内容还包括所述的惰性载体大肠杆菌作为检测抗原或抗体的间接凝集试验 用试剂的应用，因为该惰性载体菌SE1能作为检测抗原或抗体的间接凝集试验的惰性载体，同样也能作为检测抗原或抗体的间接凝集试验的应用。
本发明内容还包括所述的惰性载体大肠杆菌作为鸡相关病原感染检测用试剂的潜在用途，因为该惰性载体菌SE1能作为检测抗原或抗体的间接凝集试验的应用，也能作为鸡相关病原感染(抗体)检测的潜在应用。
与现有技术相比较，本发明的特征优点在于：
本发明提供的一株惰性载体大肠杆菌菌株SE1，该菌株在工作浓度下的细菌数量与不同种类鸡源血清不发生凝集反应，基于该惰性载体菌，具有表达和表面展呈抗原因子的性能，为简便快速间接凝集检测方法提供了一种惰性载体菌和其潜在应用，创新性改进和完善了现有凝集抗原抗体检测的全菌凝集试验的特异性、敏感性瓶颈，有望作为新颖检测试剂的开发应用，并具有巨大的应用价值和市场前景。
附图说明
图1惰性载体大肠杆菌SE1和大肠杆菌标准株EDL933在LB琼脂培养基上的菌落形态；
图2惰性载体大肠杆菌SE1和大肠杆菌标准株EDL933在伊红美蓝琼脂培养基上的菌落形态；
图3为本申请惰性载体大肠杆菌SE1种属特异性PCR鉴定图，泳道1-5分别为：分子量Marker，大肠杆菌SE1，大肠杆菌EDL933，大肠杆菌DH5α和沙门氏菌阴性对照；
图4凝集反应图示，100亿CFU/mL细菌浓度的载体菌SE1菌悬液与不同种类、不同遗传背景鸡源血清凝集反应检测测试结果图：
1：SPF鸡血清；2：鸡细菌性人工感染阳性血清(禽大肠杆菌阳性血清)；3：鸡细菌性人工感染阳性血清(沙门氏菌阳性血清)；4：鸡寄生虫人工感染阳性血清(鸡球虫病阳性血清)；5：鸡寄生虫人工感染阳性血清(绦虫病阳性血清)；6：鸡病毒性人工感染阳性血清(鸡新城疫阳性血清)；7：鸡病毒性人工感染阳性血清(鸡新城疫阳性血清)；8:鸡病毒性人工感染阳性血清(禽流感阳性血清)；9：黄羽肉鸡临床免疫血清；10：白羽肉鸡临床免疫血清；11：广西园丰麻鸡(灵山香鸡)临床免疫血清；12：常州三德利金茅草临床免疫鸡血清。
附注:凝集反应阴性对照为SE1与生理盐水反应；凝集反应阳性对照：即鸡白痢沙 门氏菌参考株CVCC526与鸡细菌性人工感染阳性血清(肠炎沙门氏菌阳性血清)凝集反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解：本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解：本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1：大肠杆菌SE1的分离鉴定
自2016年10月18日采集源自江苏无锡马山养禽集团蛋鸡场一养禽场2栋和4栋健康鸡群的360日龄健康蛋鸡，放于超净台内，用酒精对鸡体表面消毒，无菌取出鸡的肝脏、脾脏、肠道等器官组织，放置于无菌培养皿中，剪碎组织同时研磨，称重后将匀浆液吸入无菌试管中待用。称取缓冲蛋白胨水(BPW)高压灭菌分装后将采集的组织样品加入BPW中37℃过夜培养。吸取1mL于大肠杆菌检验肉汤(EC肉汤)中37℃增菌培养，过夜培养后吸取20μL增菌液于麦康凯琼脂培养基上37℃划线培养，挑取可疑特征的菌落于伊红美蓝琼脂划线培养，挑取伊红美蓝琼脂上黑紫色单菌落于LB琼脂培养基37℃纯化培养，挑取LB琼脂培养基上纯化培养单菌落接种于LB液体培养基，可疑大肠杆菌菌落通过进一步生化鉴定和种属特异性PCR鉴定。
取1mL上述过夜培养的SE1菌液用煮沸法制DNA模板。应用PCR扩增大肠杆菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因uidA，1.5％凝胶电泳鉴定，目的片段大小为162bp；参考文献合成引物序列如下：F:5′TGGTAATTACCGACGAAAACGGC 3′(SEQ ID NO.1)；R:5′ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG 3′(SEQ ID NO.2)；反应体系20μL，包含2×Taq Master Mix(Dye Plus)10μL，uidA-F/R(10μM)各1μL，DNA模板2μL，灭菌超纯水6μL补足20μL；优化后的PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。结果显示SE1能够扩增出与大肠杆菌标准株EDL933(O157:H7型大肠杆菌致弱菌株，缺失eae和stx基因)、大肠杆菌DH5α大小一致的条带(图3)。
使用商品化微量生化管对惰性载体菌SE1进行靛基质(吲哚、I)试验、甲基红(MR)试验，VP试验和柠檬酸盐(C)利用试验进行生化鉴别进行靛基质试验、MR-VP试验和柠檬酸盐利用试验进行生化鉴别，根据微量生化管说明书进行结果分析判定，结果符合国家标准方法(GB4789.38-2012)中描述的大肠杆菌生化特性(表1)。上述结果表明我们分离鉴定到一株大肠杆菌，将其命名为SE1。
表1：SE1生化特性
Figure PCTCN2020071625-appb-000001
注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。
实施例2惰性大肠杆菌SE1与不同种类鸡源血清不产生非特异性凝集现象的验证
分别将过夜培养的惰性载体菌SE1用4℃离心机4000rpm离心l0min，弃上清，用无菌PBS重悬离心洗涤三次后重悬至不同的浓度细菌(5亿～100亿CFU/mL)数量梯度进行测试。检测前将菌液用涡旋仪混匀，先用无菌PBS和SPF鸡血清进行凝集试验确保上述菌液无自凝和不出现非特异性凝集现象。在超净台内(20-25℃)取表面洁净普通玻板若干块，用无菌预冷至4℃的PBS将载体菌离心重悬洗涤3次后重悬稀释至规定细菌浓度。用微量移液器吸取一滴约10μL工作浓度的载体菌垂直滴于水平放置的玻板表面上。随后迅速滴加等量的待检血清。用灭菌枪头将菌液与血清充分混合均匀，涂布成直径1-2cm的片状后随即平稳摇动玻板，必须在2min内观察试验结果。标准判定状况为室温下2min内，以菌液与待检血清产生絮状或颗粒状肉眼可见沉淀将反应结果判定为阳性，否则判定为阴性。
结果显示，在不同浓度条件下(5亿～100亿CFU/mL)，惰性大肠杆菌载体菌SE1都未出现自凝现象，与不同种类多种遗传背景鸡源血清，包括：SPF鸡血清、健康鸡血清、鸡细菌性感染阳性血清、鸡寄生虫感染阳性血清、鸡病毒感染阳性血清和多品种鸡免疫血清，其检测的凝集反应结果都为阴性(表2、图4)，说明惰性大肠杆菌SE1与不同种类鸡源血清不发生非特异性凝集反应，认定为惰性载体菌。
表2：不同浓度的SE1菌悬液与鸡源血清凝集反应结果
Figure PCTCN2020071625-appb-000002
Figure PCTCN2020071625-appb-000003
注：“-”表示阴性；“+”表示阳性
综上描述了本申请发明的基本原理、惰性载体菌SE1的主要鉴别特征和以该惰性载体菌在间接凝集试验检测方法的开发中提供的一种惰性载体和具有的潜在应用前景。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本申请发明的原理，在不脱离本发明功能、原则和范围的前提下，本发明还会不断改进和完善，这些完善都要求在保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Figure PCTCN2020071625-appb-000004

Claims (4)

  1. 一种惰性载体大肠杆菌，其特征在于：保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.17339，保藏日期为2019年3月18日，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，菌株代号SE1。
  2. 权利要求1所述的惰性载体大肠杆菌在制备检测抗原间接凝集试验的惰性载体中的应用或在制备检测抗体的间接凝集试验中作为惰性载体的应用。
  3. 权利要求1所述的惰性载体大肠杆菌作为制备检测抗原或抗体的间接凝集试验用试剂的应用。
  4. 权利要求1所述的惰性载体大肠杆菌作为制备鸡相关病原感染检测用试剂的用途。
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