CN108646018A - 一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒、制备方法及其应用，所述试剂盒中包括：(1)海氏肠球菌玻片凝集试验抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；本发明试剂盒操作简单方便，可用来检测海氏肠球菌血清抗体，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用；本发明中的试剂盒在检测样品时只需要使用简单耗材，不需要任何仪器设备，即使在条件简陋的养殖场也可以使用；结果判定眼观即可；操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测，有利于在基层广泛使用。

Description

一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒、制备方法及 其应用

技术领域

本发明属于微生物的检测试剂技术领域，具体涉及一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒、制备方法及其应用。

背景技术

海氏肠球菌(Enterococcus hirae)属于肠球菌属，是一种广泛分布在陆生动物和禽类中的一种革兰氏阳性球菌，容易抑制小鸡的生长，造成动物的心膜炎以及感染人类后出现败血症，同时，在动物体内往往导致出现严重的耐药性。目前，海氏肠球菌几乎很少有感染人的报道。但是，近期在美国出现的病例表明，由于人类感染海氏肠球菌而发展成危及生命的疾病。该菌感染后与多种临床症状相关，包括心内膜炎，急性肾盂肾炎，急性胆囊炎，自发性细菌性腹膜炎等。因此该病原体具有重要的公共安全临床意义。目前国内外关于海氏肠球菌的研究报道甚少，对于海氏肠球菌的检测技术主要依靠实验室细菌分离、PCR 分子生物学鉴定，对于海氏肠球菌的血清抗体检测技术在国内外均未见报道。鉴于此，有必要开发一种可检测海氏肠球菌血清抗体的免疫学技术，可满足开展对海氏肠球菌快速有效的血清学诊断技术，减少对海氏肠球菌感染造成的误诊及漏诊，从而对海氏肠球菌在畜牧生产中的感染状况进行调查。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒在检测海氏肠球菌血清抗体中的应用。

本发明所采用的技术方案为：一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：(1)海氏肠球菌玻片凝集试验抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清。

一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

步骤A、海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的制备：将海氏肠球菌进行增菌培养后，进行甲醛灭活，再离心取沉淀，用5g/L(w/v)石炭酸生理盐水悬浮得到；

步骤B、标准阳性血清的制备：取海氏肠球菌进行增菌培养后，离心取沉淀，进行水浴灭活，与弗氏完全佐剂混匀，免疫未感染过海氏肠球菌的健康鸭，从鸭翅静脉采血分离血清，用琼脂扩散试验检测抗体效价，效价达1:32以上即为标准阳性血清；

步骤C、标准阴性血清的制备：取健康鸭的颈动脉血，收集至大离心管中，室温过夜，离心，取上清，经琼脂扩散试验检测，海氏肠球菌血清抗体为阴性，即得到标准阴性血清；

步骤D、将上述制备的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原、标准阳性血清、标准阴性血清组装成海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒。

进一步地，所述步骤A中制备海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的海氏肠球菌菌株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2018115。

进一步地，所述步骤A中制备海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的灭活甲醛浓度为3‰～4‰(v/v)，在37℃灭活24h～30h，每间隔2h摇晃菌瓶

一种海氏肠球菌玻片凝集试验抗原检测血清抗体的方法，包括如下步骤：

步骤一、取出4℃保存的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原，恢复至室温，充分摇匀；

第二步，在玻璃板上分别滴加待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清各 25ul；

第三步，分别加入充分摇匀的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原25μl，充分混匀；

第四步，室温静置2～5分钟，观察海氏肠球菌玻片凝集试验抗原与对应血清的凝集现象；

第五步，根据其是否凝集来判定阳性、阴性结果。

本发明的有益效果为：

a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发明中的试剂盒在检测样品时只需要玻璃板、移液器、移液器枪头等简单耗材，不需要任何其它仪器设备，即使在条件简陋的养殖场也可以使用；

b.结果判定直观，眼观即可；

c.操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；

d.成本低廉，经济实惠，使用者均可接受。

附图说明

图1为海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的敏感性检测，检测2倍系列稀释的标准阳性血清和原倍标准阴性血清；

图1中，1:2～1:32表示血清的稀释倍数，该抗原检测到的标准阳性血清抗体效价为1:32，标准阴性血清无凝集，结果成立。

图2为海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的特异性检测；

图2中，海氏肠球菌玻片凝集试验抗原检测对应的标准阳性血清、标准阴性血清均成立；检测巴氏杆菌、葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、链球菌的阳性血清，结果均为阴性；

图3为用琼脂扩散试验检测2倍系列稀释的标准阳性血清和原倍标准阴性血清；

图3中，1:2～1:32表示血清的稀释倍数，该方法检测到标准阳性血清抗体效价为1:32，标准阴性血清无琼扩条带出现，结果成立。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

一、一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒：

试剂盒中包括海氏肠球菌玻片凝集试验抗原4瓶，1ml/瓶，4℃保存；标准阳性血清1瓶，0.5ml/瓶，-20℃冻存；标准阴性血清1瓶，0.5ml/瓶，-20℃冻存。该试剂盒可检测约150份血清，保存期为6个月。

用来制备抗原的海氏肠球菌EHSD(Enterococcus hirae EHSD)菌株为田间分离株，已于2018年3月11日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC No:M2018115，保藏地址(中国.武汉.武汉大学)，该菌株的存活性为存活。

二、一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒，具体包括如下步骤：

步骤A、石炭酸生理盐水的制备：

配制5g/L(w/v)石炭酸生理盐水，即称取9克Nacl，5克苯酚(石炭酸)，加去离子水，定容至1000ml，高压灭菌。具体制备量可根据实际需要调整。

步骤B、海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的制备：

1)取-80℃冻存的加入20％(v/v)甘油保存的海氏肠球菌CCTCC No:M 2018115株的液体菌种，划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板上， 37℃、5％CO2箱中培养15～20h。

2)挑取TSA平板上的单菌落，接于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)内，37℃、 200r/min震荡培养15～18h，然后再按1:100(v/v)比例接种于新鲜的TSB培养基，37℃、200r/min震荡培养6～8h，至OD600值为1.0～1.2；

3)3‰(v/v)浓度的甲醛灭活，灭活时间24h，静置37℃，每间隔2h摇晃菌瓶；

4)将甲醛灭活后的菌液以4000r/min离心15min，弃上清，再用5g/L(w/v) 石炭酸生理盐水洗涤沉淀3次；

5)用商品化结晶紫溶液对菌体沉淀进行染色，操作方法按照说明书进行。

6)最后用菌液原体积20％的5g/L(w/v)石炭酸生理盐水悬浮菌体沉淀，混匀，即为海氏肠球菌平板凝集试验抗原；

步骤C、标准阳性血清的制备：

取-80℃冻存的加入20％(v/v)甘油保存的海氏肠球菌CCTCC No:M 2018115株的液体菌种，用接种环蘸取菌液，划线接种于TSA平板上，置于37℃、5％CO2箱中培养15～20h，再挑取单菌落接种于5ml TSB中，37℃、 200r/min培养15～18h，然后把1ml菌液转接到100ml新鲜TSB中，继续在37℃、 200r/min震荡培养6～8h，直至菌液的OD600值达到1.0～1.2；培养完毕后，将全部菌液以4000r/min离心15min，用浓度0.01M、pH7.2的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，再用10ml磷酸盐缓冲液悬浮菌体，进行细菌计数，然后65℃水浴灭活1h。取上述灭活菌液与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫未感染过海氏肠球菌的健康鸭，每只鸭接种50亿个细菌。免疫后2周再加强免疫一次。二次免疫后2周，从鸭翅静脉采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上即为标准阳性血清。若二免后血清抗体效价达不到标准，可再次加强免疫，直至符合标准；

步骤D、标准阴性血清的制备：

选取体重2～2.5公斤的健康鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，取上清即为标准阴性血清；

步骤E、将上述制备的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原、标准阳性血清、标准阴性血清组装成海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒。

三、试剂盒的应用方法示例：

一种海氏肠球菌玻片凝集试验抗原检测血清抗体的方法，包括如下步骤：

1.按需取出4℃保存的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原，恢复至室温，充分摇匀；

2.在玻璃板上分别滴加待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清各25μl；

3.分别加入充分摇匀的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原25μl，充分混匀；

4.室温静置2～5min，观察海氏肠球菌玻片凝集试验抗原与对应血清的凝集现象

5.根据其是否凝集及凝集程度来判定阳性、阴性结果。

6.凝集反应强度的判定标准：

1)++++：出现大的凝集块，液体清亮透明，即100％凝集；

2)+++：有明显的凝集片，液体几乎透明，即75％凝集；

3)++：有可见的凝集片，液体不甚透明，即50％凝集；

4)+：有小的颗粒状物，液体混浊，即25％凝集；

5)-：液体均匀，液体呈均匀混浊，即无凝集。

7.结果判定：

标准阳性血清对照应呈现100％凝集(++++)；标准阴性对照血清应呈现无凝集(-)。

在对照合格的前提下，观察待检血清反应。呈现50％凝集(++)及以上的血清判定为阳性，呈现25％凝集(+)及以下者判定为阴性。

四、海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的敏感性和特异性检测：

抗原敏感性检测：用生理盐水将标准阳性血清依次作1:2、1:4、1:8、1:16、 1:32倍稀释，在玻璃板上分别滴加上述稀释的血清样本、标准阳性血清、标准阴性血清各25μl，然后依次加入25μl海氏肠球菌玻片凝集试验抗原，充分混匀，室温静置2～5min。结果表明，当将标准阳性血清稀释至1:32时，图1所示，虽然凝集反应明显减弱，但仍可判定为阳性

特异性检测：用海氏肠球菌玻片凝集试验抗原检测巴氏杆菌、葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、链球菌的阳性血清，图2所示，结果均为阴性，表明该抗原特异性较好；图3所示，与琼脂扩散试验的检测结果相同。因此，这两种方法具有相似的敏感性。

五、田间样品的检测

对采自规模化养殖场的83份血清，用本发明涉及的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原和琼脂扩散试验分别进行检测。结果表明，海氏肠球菌玻片凝集试验抗原检测到的海氏肠球菌阳性率为27.7％(23/83)，琼脂扩散试验检测到的阳性率为25.3％(21/83)，两种方法检测结果的符合率为97.5％(81/83)。结果表明，本发明中涉及的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原及配套的试剂盒比琼脂扩散试验具有更高的敏感性，能有效检测海氏肠球菌血清抗体。另外，该方法操作简单方便，结果判定直观，可在实际生产中推广应用，开展海氏肠球菌流行病学调查。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：(1)海氏肠球菌玻片凝集试验抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清。

2.一种制备权利要求1中的海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A、海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的制备：将海氏肠球菌进行增菌培养后，进行甲醛灭活，再离心取沉淀，用5g/L(w/v)石炭酸生理盐水悬浮得到；

步骤B、标准阳性血清的制备：取海氏肠球菌进行增菌培养后，离心取沉淀，进行水浴灭活，与弗氏完全佐剂混匀，免疫未感染过海氏肠球菌的健康鸭，从鸭翅静脉采血分离血清，用琼脂扩散试验检测抗体效价，效价达1:32以上即为标准阳性血清；

步骤C、标准阴性血清的制备：取健康鸭的颈动脉血，收集至大离心管中，室温过夜，离心，取上清，经琼脂扩散试验检测，海氏肠球菌血清抗体为阴性，即得到标准阴性血清；

步骤D、将上述制备的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原、标准阳性血清、标准阴性血清组装成海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的制备权利要求1中的海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤A中制备海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的海氏肠球菌菌株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2018115。

4.如权利要求2所述的制备权利要求1中的海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤A中制备海氏肠球菌玻片凝集试验抗原的灭活甲醛浓度为3‰～4‰，在37℃灭活24h～30h，每间隔2h摇晃菌瓶。

5.如权利要求1所述的一种海氏肠球菌玻片凝集血清抗体检测试剂盒在检测海氏肠球菌血清抗体中的应用。

6.一种海氏肠球菌玻片凝集试验抗原检测血清抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、取出4℃保存的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原，恢复至室温，充分摇匀；

第二步，在玻璃板上分别滴加待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清各25ul；

第三步，分别加入充分摇匀的海氏肠球菌玻片凝集试验抗原25μl，充分混匀；

第四步，室温静置2～5分钟，观察海氏肠球菌玻片凝集试验抗原与对应血清的凝集现象；

第五步，根据其是否凝集来判定阳性、阴性结果。