CN116396908A - 一株海氏肠球菌zj02及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海氏肠球菌ZJ02及其应用，该海氏肠球菌ZJ02于2023年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.26708，基因组序列登录号为PRJNA953844。本发明从杜长大三元杂交猪的肠道中筛选出一株性能良好的海氏肠球菌ZJ02，其对酸性环境以及胆盐有较好的耐受性，对常见抗生素敏感，且对不同碳源有较强的利用能力。海氏肠球菌ZJ02是性能优良的潜在益生菌，可用于制备发酵酸奶，作为液态发酵饲料应用于哺乳、断奶仔猪，缓解仔猪腹泻以及断奶应激。
Description
技术领域
本发明涉及一株海氏肠球菌ZJ02及其应用，属于生物与新医药技术领域。
背景技术
仔猪腹泻是生猪养殖中最常出现的问题。随着中国养猪规模的不断扩大，许多生猪企业采取早期断奶模式，然而哺乳仔猪肠道发育不完善，对环境的抵抗能力较差，加上断奶后环境以及饮食结构的变动极易引起仔猪腹泻，严重时会导致仔猪生产性能下降，发育迟缓甚至停滞，降低养殖场的效益。因此加强对仔猪断奶期间的饲养管理，降低腹泻率对养殖业尤为重要。
益生菌能够平衡肠道菌群、促进肠道发育、抑制病原微生物的定植、提高动物的免疫力等，作为饲用抗生素的替代品近年来被广泛应用于畜牧养殖业。乳酸菌是动物肠道中重要的有益菌，可发酵碳水化合物产生乳酸，维持肠道菌群的平衡。已广泛地用于医药、食品和饲料等行业中，被公认为是安全的食品级微生物。但胃肠道中很多生理屏障，如低pH值、胆汁盐、酶等会严重影响益生菌的生存。利用一些基质可提高益生菌的效益，乳制品在胃肠道中有较高的缓冲能力，可对益生菌起到保护作用，被认为是向胃肠道输送益生菌的理想载体。
研究发现猪源乳酸菌相较于体外分离的乳酸菌更容易定植于肠道环境。然而专门应用于仔猪生产的益生菌种类较少，因此，需要开发一种可作为液态发酵饲料应用于仔猪生产，降低仔猪腹泻率，提高仔猪生产性能的益生菌。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一株海氏肠球菌ZJ02；本发明的第二目的是提供一种含有该海氏肠球菌ZJ02的菌株发酵液；本发明的第三目的是提供一种含有该海氏肠球菌ZJ02或其菌株发酵液的微生物制剂；本发明的第四目的是提供利用该海氏肠球菌ZJ02或其发酵液或微生物制剂在发酵酸奶中的应用。本发明的第五目的是提供利用该海氏肠球菌ZJ02或其发酵液或微生物制剂制备的发酵酸奶用于哺乳、断奶仔猪的生产。
技术方案：本发明的一株海氏肠球菌ZJ02，所述海氏肠球菌ZJ02于2023年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.26708，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：海氏肠球菌(Enterococcus hirae)ZJ02。
进一步地，所述海氏肠球菌ZJ02从杜长大三元猪肠道中筛选得到。
进一步地，所述海氏肠球菌ZJ02的全基因序列上传至NCBI数据库，序列登录号为PRJNA953844。
本发明所述一种菌株发酵液，包括海氏肠球菌ZJ02。
本发明一种微生物制剂，包括本发明所述的海氏肠球菌ZJ02或本发明所述菌株发酵液。
本发明所述的海氏肠球菌ZJ02或本发明所述菌株发酵液或本发明所述微生物制剂在制备发酵酸奶、发酵饲料、添加剂中的应用。
进一步地，制备发酵酸奶包括以下步骤：
将去离子水煮沸后加入全脂乳粉、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖，搅拌均匀后，进行巴氏灭菌，冷却至室温，进行乳酸菌的接种，摇晃均匀后放入培养箱发酵即可。
进一步地，所述全脂乳粉、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖、乳酸菌、水的质量比为14～16：7～8：0.4～0.6：0.4～0.6：3～4：100。
进一步地，所述乳酸菌包括海氏肠球菌ZJ02、约氏乳杆菌和粪肠球菌。
进一步地，所述海氏肠球菌ZJ02、约氏乳杆菌和粪肠球菌的体积比为2:3:3。
进一步地，所述巴氏灭菌的温度为65℃，巴氏灭菌的时间为30min。
进一步地，所述发酵在37℃恒温培养箱，发酵24h。
本发明所述发酵酸奶、发酵饲料、添加剂用于哺乳、断奶仔猪的生产，可以提高肠道的免疫功能，缓解哺乳仔猪和断奶仔猪的腹泻，提高仔猪的生长性能等。
本发明所述海氏肠球菌ZJ02生长代谢产酸，在固体培养基中菌落形态为乳白色，不透明圆点，边缘光滑。海氏肠球菌ZJ02在基因组中有多种与PTS转运系统相关的底物，并且有代谢蔗糖、半乳糖、淀粉、果糖等多种碳源的酶系，对不同环境的适应性较强。海氏肠球菌ZJ02对常见抗生素例如头孢曲松、四环素、氯霉素等敏感，是可以安全使用的益生菌。海氏肠球菌ZJ02对酸性环境以及胆盐耐受性较好，在pH为3～4环境中处理两小时其存活率仍高于65％。说明其可以作用到肠道并发挥作用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)本发明筛选的海氏肠球菌ZJ02耐酸、耐胆盐能力较好，可适应肠道内复杂的环境，并发挥益生菌的作用。
(2)本发明所筛选的海氏肠球菌ZJ02对不同碳源有较强的利用能力，可应用于发酵饲料、添加剂等。
(3)本发明筛选的海氏肠球菌ZJ02可发酵酸奶，作为液态发酵饲料代替饲用抗生素缓解仔猪断奶腹泻、应激等症状。
附图说明
图1为海氏肠球菌ZJ02在平板上的菌落形态以及显微镜下的形态图；
图2为海氏肠球菌ZJ02 16S rRNA基因序列与NABI数据库对比结果图；
图3为海氏肠球菌ZJ02的生长曲线图；
图4为海氏肠球菌ZJ02的产酸曲线图；
图5为海氏肠球菌ZJ02的乳酸产量图；
图6为海氏肠球菌ZJ02耐酸情况图；
图7为海氏肠球菌ZJ02耐胆盐情况图；
图8为海氏肠球菌ZJ02对不同碳源的利用情况图；
图9为海氏肠球菌ZJ02在不同碳源情况下产乳酸含量图；
图10为海氏肠球菌ZJ02在KEGG数据库中的功能注释图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
1、海氏肠球菌ZJ02的分离、筛选、纯化以及冻存
取江苏镇江绿洲生猪养殖场采集的杜长大三元杂交猪的肠道食糜进行菌株的纯化分离。
将食糜样品用生理盐水进行稀释后，涂布于MRS固体培养基中，待MRS固体培养基长出单个菌落后，用接种环挑取单菌落接入MRS液体培养基中，培养24h后，继续进行划线操作，重复以上操作三次，直至最后MRS固体培养基中长出同一形态的菌落，纯化完成，将纯化菌液与50％甘油混合保存至-20℃冰箱。菌株在平板上的菌落形态以及在显微镜下的形态如图1所示。图1为海氏肠球菌ZJ02在平板上的菌落形态以及显微镜下的形态图，其中，a为海氏肠球菌ZJ02在平板上的菌落形态图，b为海氏肠球菌ZJ02在显微镜下的形态图。由图1可以看出，海氏肠球菌ZJ02菌落形态均呈白色小圆点，边缘较圆滑。革兰氏染色结果观察到菌株为紫色球状，判断为革兰氏阳性菌。
2、海氏肠球菌ZJ02的鉴定
将分离出的菌株扩大培养后，离心并收集沉淀，用于DNA的提取，16S rRNA基因扩增方法：所用细菌的16S rRNA基因的全长通用引物序列为：上游引物27f(AGTTTGATCMTGGCTCAG)，下游引物1492r(GGTTACCTTGTTACGACTT)，PCR反应程序为：98℃预变性2min，之后98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，35个循环，72℃最终延伸5min。对PCR产物进行测序并与NCBI数据库进行比对，结果如图2所示。图2为海氏肠球菌ZJ02 16SrRNA基因序列与NABI数据库对比结果图；由图2可见，分离得到的菌株序列与Entrococcushirae strain DSM 20160的序列相似性达到99.9％，所以认为筛选出的菌株为海氏肠球菌。
实施例2海氏肠球菌ZJ02的生长曲线以及产酸曲线
海氏肠球菌用MRS液体培养基连续培养两代后，按5％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，每隔三小时测定其在波长为600nm的OD值，并用pH计测定菌液的pH值，每组重复三次，绘制生长曲线和产酸曲线。在菌株生长24h和48h时，用乳酸试剂盒测定乳酸含量。结果如图3-5所示。图3为海氏肠球菌ZJ02的生长曲线图；结果显示，海氏肠球菌在3～9h进入对数期，12h后进入平台期。图4为海氏肠球菌ZJ02的产酸曲线图；结果显示，在24h内pH值从6.26降至4.43。图5为海氏肠球菌ZJ02的乳酸产量图；结果显示，培养24h和48h的培养液乳酸含量分别为61.65mmol/L和76.58mmol/L，说明海氏肠球菌ZJ02有较强的产酸能力。
实施例3海氏肠球菌耐酸和耐胆盐能力
将海氏肠球菌连续培养三代后，取100μL菌液，分别用900μL的pH为2、3、4的PBS缓冲溶液处理，并用不调pH值的PBS缓冲液作为对照，2h后立即进行稀释涂板，37℃培养24h，计数。结果如图6所示。图6为海氏肠球菌ZJ02耐酸情况图，结果显示，海氏肠球菌ZJ02在pH为4、3、2的缓冲液中存活率分别是76.09％、68.70％、12.61％，表明海氏肠球菌对酸性环境有较强的耐受性。
取500μL复苏三代的海氏肠球菌菌液，分别接入到胆盐浓度为0.1％(m/v)和0.5％(m/v)的MRS液体培养基中，并以无胆盐的培养基为对照，每个处理三个重复。37℃恒温培养2h后，每组取100μL菌液进行梯度稀释并涂布于MRS固体培养基中，37℃培养24h，计数。结果如图7所示，图7为海氏肠球菌ZJ02耐胆盐情况图；结果表明，海氏肠球菌菌株在胆盐浓度为0.1％(m/v)和0.5％(m/v)的MRS液体培养基中培养24h后存活率分别为25.85％和5.51％。表明海氏肠球菌ZJ02对胆盐和酸性环境有一定的耐受性，能在胃肠道中顺利存活。
实施例4海氏肠球菌ZJ02抗生素耐药性的测定
取连续培养两代的菌液，稀释为10-3的稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基上，之后用镊子夹取抗生素药敏片放置在平板上，每个平板放三至四个抗生素药敏片，恒温培养24h后，观察并记录抗生素药敏片周围透明圈的直径，抗生素分别选择氨西林、庆大霉素、红霉素、头孢曲松、复方新诺明、氯霉素、林克霉素、青霉素、四环素和环丙沙星，结果如表1所示。结果表明ZJ02对除庆大霉素、复方新诺明、林克霉素外的7种抗生素敏感。
表1海氏肠球菌ZJ02抗生素耐药性的测定结果
实施例5海氏肠球菌ZJ02对不同糖源的利用能力测定
在不含糖的MRS培养基种加入不同的单糖、双糖、以及寡糖作为海氏肠球菌ZJ02的碳源，测定海氏肠球菌ZJ02在不同碳源条件下的生长曲线，产酸能力以及乳酸产量。结果如图8-9所示。图8为海氏肠球菌ZJ02对不同碳源的利用情况图；结果显示，海氏肠球菌ZJ02对蔗糖和低聚果糖的利用能力最好。图9为海氏肠球菌ZJ02对不同碳源情况下产乳酸含量图；培养48h后，乳酸含量的测定结果显示，海氏肠球菌ZJ02利用半乳糖和果糖的产酸能力较强。
实施例6海氏肠球菌ZJ02的全基因组分析
对海氏肠球菌ZJ02进行全基因组分析，并根据对其参与的糖代谢通路进行分析。结果如表2所示。表2为海氏肠球菌ZJ02的基因组特征，海氏肠球菌ZJ02的全基因组包含一个环状染色体，基因片段长度为2743374bp，GC含量为37.8％，并且有五个环状的质粒，对海氏肠球菌ZJ02基因组预测显示，有2823个基因，总长度2461968bp，基因长度占整个基因组长度的83.6％。有68个tRNA，18个rRNA。海氏肠球菌ZJ02的全基因序列已上传至NCBI数据库，序列登录号为PRJNA953844。
表2海氏肠球菌ZJ02基因组特征
将海氏肠球菌ZJ02基因组在KEGG数据库中共比对，结果如图10所示。图10为海氏肠球菌ZJ02在KEGG数据库中的功能注释图，比对后共得到1407个功能基因。其中与碳水化合物代谢相关的基因丰度非常高，达到了258个。在ZJ02基因组中发现了多种与PTS转运系统相关的底物，包括淀粉、蔗糖、果糖、甘露糖、半乳糖等13种碳源，说明海氏肠球菌ZJ02对不同碳源有很强的转运能力。之后我们重点对比了海氏肠球菌ZJ02对不同碳源的利用能力，结果显示，ZJ02在蔗糖、淀粉、果糖以及甘露糖的代谢途径中注释到较多的功能基因，并且在ZJ02的基因代谢通路中，编码了可利用这些糖源的酶系。表明海氏肠球菌ZJ02对这几种碳源的利用效果较好，可应用于发酵饲料、发酵酸奶等生产中。
实施例7发酵酸奶的制备
酸奶制备工艺流程如下：
A、菌液制备：将保存至-20℃冰箱的海氏肠球菌ZJ02、约氏乳杆菌和粪肠球菌进行复苏，用MRS液体培养基连续培养三代后，得到培养后的三株菌菌液备用。
B、原料乳制备：将去离子水加热至沸腾，按与水的重量百分比依次加入14～16％全脂乳粉、7～8％蔗糖、0.4～0.6％低聚果糖、0.4～0.6％低聚半乳糖，快速搅拌至溶解，得到原料乳。
C、分装：将配置好的原料乳分装至200mL的发酵瓶中，并用橡胶塞封口，铝盖密封。
D、巴氏灭菌：将封装好的原料乳巴氏灭菌，灭菌温度为65℃，灭菌时间为30min。
E、接种：将灭菌后的原料乳冷却后在无菌环境下将发酵所需培养后的海氏肠球菌ZJ02菌、约氏乳杆菌和粪肠球菌按菌液接种量为2：3：3的比值接种到灭菌过的原料乳中，并摇晃均匀，得到接种后的发酵乳。
F、发酵：将接种后的发酵乳置于37℃恒温培养箱，发酵24h即可。
实施例8海氏肠球菌ZJ02发酵酸奶对哺乳、断奶仔猪腹泻率的影响
选取20窝健康、体重相近的哺乳仔猪，每窝9～11头仔猪，随机分为两组。。试验组仔猪从7日龄开始饲喂实施例7制备的发酵酸奶，将发酵酸奶拌入教槽料中，每日早晚各饲喂一次。7-14日龄每窝每次饲喂150mL发酵酸奶；14-21日龄，每窝每次饲喂300mL发酵酸奶，21-27日龄，每窝每次饲喂450mL发酵酸奶。对照组不饲喂发酵酸奶，21日龄时进行断奶，其他饲养条件与处理组相同。各组每天添加足量教槽料供每窝仔猪自由采食，自由饮水。试验期内，每天观察仔猪腹泻情况。统计结果见表3。
表3试验期间仔猪腹泻率
腹泻率是仔猪生产中尤为重要的指标，断奶应激极易造成仔猪腹泻，进而影响仔猪的生产性能，因此如何降低哺乳仔猪和断奶仔猪的腹泻率一直是生猪养殖过程中的难点。由表3可见，与对照组相比，发酵酸奶显著降低仔猪断奶后一周内的腹泻率，但对哺乳期无显著影响。这可能是因为发酵酸奶中含有的益生菌能帮助仔猪塑造健康的肠道环境，此外，发酵酸奶的pH在4.15～4.25之间，可有效降低肠道pH值，抑制有害菌的繁殖，平衡肠道菌群，缓解断奶仔猪的腹泻。
因此，本发明提供的海氏肠球菌ZJ02是发酵酸奶的优良菌种，用该菌种发酵的酸奶可显著缓解仔猪的断奶应激，降低仔猪腹泻率，提高仔猪生产性能，作为潜在益生菌有很大的应用前景。
Claims (10)
1.一株海氏肠球菌ZJ02，其特征在于，所述海氏肠球菌ZJ02于2023年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.26708。
2.根据权利要求1所述海氏肠球菌ZJ02，其特征在于，所述海氏肠球菌ZJ02从杜长大三元杂交猪的肠道中筛选得到。
3.根据权利要求1所述海氏肠球菌ZJ02，其特征在于，所述海氏肠球菌ZJ02的全基因序列已上传至NCBI数据库，序列登录号为PRJNA953844。
4.一种菌株发酵液，其特征在于，包括海氏肠球菌ZJ02。
5.一种微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的海氏肠球菌ZJ02或权利要求4所述菌株发酵液。
6.权利要求1-3任一项所述的海氏肠球菌ZJ02或权利要求4所述菌株发酵液或权利要求5所述微生物制剂在制备发酵酸奶、发酵饲料、添加剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，制备发酵酸奶包括以下步骤：
将去离子水煮沸后加入全脂乳粉、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖，搅拌均匀后，进行巴氏灭菌，冷却至室温，进行乳酸菌的接种，摇晃均匀后放入培养箱发酵即可。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述全脂乳粉、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖、乳酸菌、水的质量比为14～16：7～8：0.4～0.6：0.4～0.6：3～4：100。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述乳酸菌包括海氏肠球菌ZJ02、约氏乳杆菌和粪肠球菌，所述海氏肠球菌ZJ02、约氏乳杆菌和粪肠球菌的体积比为2:3:3。
10.权利要求6所述发酵酸奶、发酵饲料、添加剂用于哺乳、断奶仔猪的生产。
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