CN105866437A - 一种屎肠球菌间接血凝检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种屎肠球菌间接血凝检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括屎肠球菌间接血凝抗原，所述屎肠球菌间接血凝抗原由屎肠球菌CCTCC M 2016047的全菌蛋白和醛化‑鞣酸化绵羊红细胞组成。本发明的试剂盒操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2～3小时内完成，适合在基层推广应用，可广泛应用于屎肠球菌病流行病学的调查研究。结果的重复性好，稳定，可靠，能够准确的检测屎肠球菌的抗体。

Description

一种屎肠球菌间接血凝检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于用于微生物的检测试剂技术领域，具体涉及一种屎肠球菌间接血凝检测试剂盒。
背景技术
屎肠球菌 ( Enterococcus Faecium)属于革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性球菌, 是人和动物肠道内的主要菌群。自20世纪90年代以来，屎肠球菌已逐渐成为人和动物重要的条件性致病菌。目前，在动物研究方面，屎肠球菌感染主要依靠实验室细菌分离、PCR分子生物学鉴定，在基层则缺乏快速有效的屎肠球菌血清学诊断方法。血清学诊断方法的缺乏，可能使得基层对屎肠球菌感染造成误诊及漏诊，从而对畜牧业生产造成不必要的损失。
发明内容
本发明的目的是为了解决当前我国基层缺乏屎肠球菌抗体检测技术难题，提供一种屎肠球菌间接血凝检测试剂盒及其在检测屎肠球菌中的应用。
本申请采用超声细胞破碎法提取屎肠球菌菌体抗原作为检测抗原，致敏醛化鞣酸化的绵羊红细胞，与屎肠球菌高免兔血清，屎肠球菌阳性血清进行间接血凝实验。结果显示该方法特异性好、灵敏度高，可为屎肠球菌病的血清学快速诊断及流行病学调查提供依据。
本发明提供一种屎肠球菌间接血凝检测试剂盒，所述试剂盒包括屎肠球菌间接血凝抗原，所述屎肠球菌间接血凝抗原由屎肠球菌CCTCC M 2016047的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞组成。
作为优选，所述屎肠球菌全菌蛋白的浓度为100μg/ml-200μg/ml。
作为优选，所述屎肠球菌CCTCC M 2016047的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞的体积为1:1。
作为优选，所述试剂盒还包括标准阳性血清。
作为优选，所述试剂盒还包括标准阴性血清。
作为优选，所述试剂盒还包括稀释液。
作为优选，所述屎肠球菌间接血凝抗原的制备方法为：
（1）屎肠球菌菌体抗原的制备
对屎肠球菌进行扩大培养，离心收获菌体后，洗涤，重悬，再于冰浴中以超声波间歇破碎10min，离心取上清，得到屎肠球菌菌体抗原悬浮液；
（2）红细胞的固定和醛化-鞣酸化
将保存于Alsever's 液中的公绵羊血在4℃静置3-7天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和鞣酸处理，所用的溶液均为 pH 7.2浓度为0.15M的PBS，制备好的绵羊红细胞用 pH7.2浓度为0.15M的PBS悬浮至5%浓度，得到醛化-鞣酸化后的红细胞悬 液；
（3）屎肠球菌间接血凝抗原的制备
以步骤（1）得到的屎肠球菌菌体抗原致敏步骤（2）得到的红细胞，得到屎肠球菌间接血凝抗原，屎肠球菌间接血凝抗原的终浓度为100μg/ml-200μg/ml。
本发明还提供上述试剂盒在检测屎肠球菌中的应用，所述应用是非疾病的诊断和治疗目的的应用。
作为优选，同时检测n（n≤9）个待测血清的具体方法为：
（1）在滴定板1-n列每列第1孔分别加入待检血清，第n+1、n+2、n+3分别加入同样体积的标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，将1-n+2列从第1孔开始进行4倍倍比稀释至最后一孔；
（2）每孔加入屎肠球菌间接血凝抗原；
（3）震荡滴定板，充分混匀，置37℃恒温箱1.5-2h；
（4）根据红细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
本发明的优越性包括以下方面：（1）本发明中抗原为屎肠球菌菌体抗原，具有很强的特异性，能真实地检测屎肠球菌抗体；（2）用蛋白致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞，避免了新鲜绵羊红细胞保存时间短、致敏效价低的缺点，易于长时间保存，血凝效价高。（3）操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2～3小时内完成，适合在基层推广应用，可广泛应用于屎肠球菌病流行病学的调查研究。（4）结果的重复性好，稳定，可靠，能够准确的检测屎肠球菌的抗体。（5）本发明是目前国内唯一的检测屎肠球菌抗体的诊断试剂，且价格低廉，安全稳定，无毒性，无环境污染。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1 屎肠球菌间接血凝诊断试剂盒的制备
屎肠球菌间接血凝诊断试剂盒的组分如下：
（1）屎肠球菌间接血凝抗原1瓶，10ml/瓶；
（2）标准阳性血清1瓶，1ml/瓶；
（3）标准阴性血清1瓶，1ml/瓶；
（4）稀释液2瓶，10ml/瓶。
该试剂盒的保存期为一年。
1屎肠球菌间接血凝抗原的制备
1.1培养基配制
配制THB液体培养基2000ml：将牛肉粉4.0g，胰蛋白胨40g，葡萄糖40g，氯化钠6.0g，Na2HPO4 5.8g，KH2PO4 0.6g，Yeast extracts 6.0g加入去离子水，定容至2000mL，充分搅拌溶解，用无水Na2CO3调pH值至7.4。高温高压灭菌，待培养基放凉后，放入4℃保存备用。
1.2 屎肠球菌菌体抗原制备
将屎肠球菌Enterococcus Faeciumlby1(由本实验室分离自青海民和县羊感染病料，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期：2016年1月18日，保藏编号：CCTCC M 2016047)单菌落分别接种于20mlTHB液体培养基中，放置于37℃温箱中，培养10h左右后，根据麦氏比浊管估算菌液浓度约为4-5×108cfu时，然后吸取该20ml的菌液接种到新的0.5LTHB液体培养基，恒温37℃培养16h后收获菌液，8000 r/min离心30min收获菌体，沉淀物用0.15mol/L pH7.4 PBS悬浮，如上洗涤3次后，再按菌体体积50倍量加0.15mol/L pH7.4的PBS稀释至125 mL，配成浓缩抗原。冰浴中以超声波间歇破碎10min，然后4000 r/min离心20min，吸取上清液，再10000 r/min离心20min，离心后的上清浓缩液为抗原贮备液，加终浓度0.1g/L的硫柳汞，-20℃保存备用。
1.3 红细胞的固定和醛化-鞣酸化
将用等量的Alsever's 液保存的公绵羊血在4℃下经3-7天稳定后,离心洗涤，以3000rpm离心10分钟, 弃上清液。沉积的红细胞用10倍体积量的pH为7.2浓度为0.15M的PBS按上述离心条件洗涤三次，在每5毫升红细胞加入pH 7.2浓度为0.15M的PBS 95 毫升, 使成体积浓度为5%红细胞悬液。将其置电磁搅拌器上搅拌，每100毫升5%红细胞悬液加入2.5%戊二醛20毫升，加定后在室温下继续搅拌1小时，以3000rpm离心3分钟, 弃上清液。再用pH为7.2浓度为0.15M的PBS，以3000rpm离心3分钟的条件离心洗涤三次后, 加入新配制的2.5%鞣酸100毫升, 充分混合后置37℃水浴箱中10分钟, 离心弃上清液, 再以pH 7.2浓度为0.15M的PBS离心洗涤三次后, 再用pH为7.2浓度为0.15M的PBS配成5%醛化-鞣酸化红细胞悬液, 置4℃下保藏备用。
1.4 屎肠球菌间接血凝抗原的制备（即屎肠球菌菌体抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞）
将屎肠球菌菌体抗原稀释成300μg/ml，取1体积份屎肠球菌菌体抗原与1体积份5%醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀（致敏浓度为10μg/ml），在37℃水浴中作用30 min，其间不断搅拌；然后用pH 为7.2浓度为0.15 M的PBS以3000rpm离心洗涤红细胞三次, 每次5分钟。再用含1%灭活健康兔血清(NRS) 的浓度为0.15mol/L、pH为7.2的PBS洗涤三次，沉淀物用加有0.1%（体积浓度）叠氮钠( NaN3 ) 的2%（体积浓度）NRS配成1 %致敏红细胞悬液，作为间接血凝诊断抗原。置4℃下保藏备用。
2 标准阳性血清的制备：
弗氏不完全佐剂的配制：将羊毛脂和液体石蜡油按1:4(V/V)混合均匀，103.4kPa(121℃)高压灭菌30min，置4℃冰箱备用。使用时抗原与弗氏不完全佐剂等量混合、乳化。
弗氏完全佐剂即在弗氏不完全佐剂中加入无毒、灭活的分枝杆菌(终浓度3mg/mL)，使用时抗原与等量的弗氏完全佐剂混合、乳化。
选用体重1.5 kg左右的健康家兔作为免疫时使用。将两种血清型屎肠球菌菌株（LVRI1101和LVRI1301菌株，由中国农业研究院兰州兽医研究所保存）分别在THB平板上复苏后连续三代进行复壮，并均匀涂布做扩大培养，37℃恒温培养16h，接着将体积浓度10％甲醛溶液加入培养好的菌液中，使菌液终浓度为体积浓度0.2%，随加随摇，使其充分混合，置37 ℃灭活20h，培养期间振摇4~5次，进行灭活充分。首次免疫用上述灭活检验合格的抗原与等体积弗氏完全佐剂混合充分乳化，于每只兔腘淋巴结处及背部皮下多点接种，接种量为1mL；隔7d后，第二次免疫以等体积的弗氏不完全佐剂乳化抗原，接种剂量为1.5mL，多点接种于在每只兔肩部肌肉和背部皮下；10d后，取制备好的含等体积弗氏不完全佐剂的抗原在每只兔背部皮下注射1.5mL，进行第三次免疫，隔14d后采血，进行耳缘静脉采取血清。采血后，于每只兔背部皮下直接注射新鲜培养的屎肠球菌菌液1mL，对其进行攻毒，以提高抗体效价。最后一次免疫后，14d以后收集的血清作为兔高免血清。
3 标准阴性血清的制备
选取经血清学证实为屎肠球菌抗体阴性的健康山羊，用常规的方法采血，无菌分离血清。
4 稀释液的制备：
称取NaCl 4.25 g、KH2PO4 2.858 g、Na2HPO4·12H2O 19.339 g，溶于1000 mL去离子水中，充分搅拌溶解，调pH为7.2~7.4，定量分装为10ml/瓶。
5 试剂盒最佳致敏浓度的确定
将菌体抗原贮备液在1.5ml Eppendorf管中用0.15mol/L pH7.2 PBS倍比稀释为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1：64共6个稀释梯度，分别与5%的醛化鞣酸化绵羊红细胞致敏，测定屎肠球菌兔高免血清，根据效价高低和凝集图像的清晰度确定抗原的最佳致敏浓度。具体结果参见表1。
表1 抗原最适浓度的测定
将1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64按比例稀释的浓缩抗原分别致敏红细胞，与1:2，
1:22，1:23，1:24，1:25，1:26，1:27，1:28倍比稀释的阳性血清做间接血液凝集试验。结果显示，用菌株LVRI1101和LVRI1301，浓缩抗原小于或等于1:4稀释度致敏时，血凝价不再明显提高，所以确定LVRI1101和LVRI1301浓缩抗原以1:4稀释为标准致敏浓度。用此浓度抗原制备的5%致敏红细胞血凝效价高，经反复测定，效果稳定而且图像清晰。结果见表1。
经试验，本发明的试剂盒中屎肠球菌间接血凝抗原的最佳致敏浓度为100μg/ml-200μg/ml。
实施例2
应用本发明的试剂盒对待测血清进行检测，具体方法如下：
先在96孔“∨”型聚苯乙烯滴定板8行12列上每孔滴加稀释液75μL；然后在1-9列每列第1孔分别加入被检血清25μL，每份被检血清用1列，第10、11列第1孔分别加入标准阳性血清、标准阴性血清各25μL，第12列为空白对照。用排枪将1-11列第1孔充分混匀后吸取25μL加入第2孔，依次连续稀释至第8孔，混匀后从第8孔弃去25μL；最后每孔滴加1%致敏红细胞悬液（即浓度为100μg/ml的屎肠球菌间接血凝抗原）25μL，加样完毕将∨型滴定板放在微量震荡器上震荡1-2min，盖上玻璃板，置37℃恒温箱1.5-2h，判定结果。
判定标准：红细胞全部凝集（＋＋＋＋）；75％红细胞凝集（＋＋＋）；50％红细胞凝集（＋＋）；25％红细胞凝集（＋）；无凝集（－）。阳性血清对照1～8孔应呈现“＋＋＋＋～＋＋”凝集；阴性血清和空白对照应呈现“－”。在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔，以呈现“＋＋”凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。效价≥1∶8（＋＋）判为阳性，效价≤1∶4（＋＋）判为阴性。效价介于两者之间判为可疑，需重新测定，仍为可疑判为阳性。
实施例3 本发明的屎肠球菌间接血凝检测试剂盒的特异性实验
用本发明的屎肠球菌间接血凝检测试剂盒对健康兔血清、链球菌阳性血清、葡萄球菌阳性血清、粪肠球菌阳性血清和屎肠球菌进行检测，结果除屎肠球菌外，其余均为阴性（参见表2），说明该抗原具有极高的特异性。
表2 屎肠球菌间接血凝诊断试剂特异性试验结果
实施例4 本发明的屎肠球菌间接血凝检测试剂盒的重复性实验
重复性实验
一、批内重复性试验
3位不同的操作者，取某一批次的本发明的试剂盒同时检测5种屎肠球菌阳性、阴性血清，观察间接血凝效价的变化情况。
二、批间重复试验
取3份不同批次的本发明的试剂盒，同时检测5种屎肠球菌的阳性血清和阴性血清，观察间接血凝效价的变化情况。
三、田间样品检测
用本发明的试剂盒对甘肃，青海等地送检的126份田间血清样品进行检测，以了解该病在我国西北地区的流行程度。
重复性实验结果
1、批内重复性试验：3位操作者共同用同一批次的本发明的试剂盒对5种屎肠球菌阳性血清、阴性血清每隔1月检测一次，总检测3次，每次间接血凝的检测结果完全相同，批内变异系数为：0。
2、批间重复性试验: 应用3批本发明的试剂盒(批号201409、201410、201411)对5种屎肠球菌阳性血清和阴性血清用IHA重复检测3次，每次结果基本相符(P>0.05)。说明本发明的试剂盒是稳定的。
3、田间样品的检测
新西兰大白兔血清样品共计126份，甘肃的阳性率为25%，青海的阳性率为38.9%，平均阳性率为30.95%。检测结果见表3。
表3 本发明的试剂盒田间样品检测结果
实施例5 本发明的屎肠球菌间接血凝检测试剂盒的敏感性实验
将猪源屎肠球菌阳性血清按比例稀释后进行检测，取5份免疫猪源屎肠球菌阳性血清用本发明的试剂盒与琼脂凝集试验进行同时检测，比较敏感性。对5头实验免疫猪和5头人工感染猪于免疫接种或感染第0d，7d，14d，21d，30d，45d采集的血清样品，检测其抗体的消长变化以及抗体产生时间，以确定该IHA实验诊断方法的敏感性和作为早期诊断方法的可行性。
将LVRI1101和LVRI1301阳性血清进行按比例稀释，用该间接血凝诊断抗原检测，1:256（1:28）稀释的检测结果仍为阳性。取5份免疫兔的阳性血清，按比例稀释后分别用间接血凝试验（IHA）和琼脂扩散凝集实验检测，血清的扩散凝集实验效价为1:128；IHA效价为1:256,具体结果参见表4。
表4 敏感性试验的检测结果
实施例6
2015年3月26日，甘肃张掖民乐县某村某羊场羊群发病，至4月13日，已死亡成年母羊4只。临床症状表现为发烧，体温41℃，不食，口流清涎，死亡母羊病程2-3天。病理解剖发现，肾脏土黄色，质软；脾脏表面有针尖大出血点；肺充血，肿大；心表面有淤血点；肝稍肿大。
采集病羊血清两份，用本发明的屎肠球菌间接血凝检测试剂盒检测血清抗体，结果发现其中一份血清抗体效价1:32，另一份1:64，显示屎肠球菌感染。
将病料用葡萄糖肉汤培养基培养24小时，结果在培养基上长出淡白色小菌落。革兰氏染色发现，所分离细菌均为革兰氏染色阳性，球菌，链状。从所分离细菌挑选3个克隆,提取其基因组,用16S rRNA通用引物扩增。测序结果表明，所分离细菌的16S rRNA基因序列与Genebank中屎肠球菌Enterococcus faecium AUS0085的序列一致性为99.6-99.8%，说明从病料中分离的革兰氏阳性球菌为屎肠球菌。这些屎肠球菌被进一步确认为ST17型。现有文献也说明屎肠球菌ST17型多为致病型。
屎肠球菌间接血凝检测试剂盒检测结果与病菌分离结果的一致性，证实本发明的间接血凝检测试剂盒可用于屎肠球菌病的诊断。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种屎肠球菌间接血凝检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括屎肠球菌间接血凝抗原，所述屎肠球菌间接血凝抗原由屎肠球菌CCTCC M 2016047的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述屎肠球菌全菌蛋白的浓度为100μg/ml-200μg/ml。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述屎肠球菌CCTCC M 2016047的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞的体积为1:1。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准阳性血清。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准阴性血清。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括稀释液。
7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于：所述屎肠球菌间接血凝抗原的制备方法为：
（1）屎肠球菌菌体抗原的制备
对屎肠球菌进行扩大培养，离心收获菌体后，洗涤，重悬，再于冰浴中以超声波间歇破碎10min，离心取上清，得到屎肠球菌菌体抗原悬浮液；
（2）红细胞的固定和醛化-鞣酸化
将保存于Alsever's 液中的公绵羊血在4℃静置3-7天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和鞣酸处理，所用的溶液均为 pH 7.2浓度为0.15M的PBS，制备好的绵羊红细胞用 pH7.2浓度为0.15M的PBS悬浮至5%浓度，得到醛化-鞣酸化后的红细胞悬 液；
（3）屎肠球菌间接血凝抗原的制备
以步骤（1）得到的屎肠球菌菌体抗原致敏步骤（2）得到的红细胞，得到屎肠球菌间接血凝抗原，屎肠球菌间接血凝抗原的终浓度为100μg/ml-200μg/ml。
8.权利要求1-6任一所述的试剂盒在检测屎肠球菌中的应用，所述应用是非疾病的诊断和治疗目的的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：同时检测n（n≤9）个待测血清的具体方法为：
（1）在滴定板1-n列每列第1孔分别加入待检血清，第n+1、n+2、n+3分别加入同样体积的标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，将1-n+2列从第1孔开始进行4倍倍比稀释至最后一孔；
（2）每孔加入屎肠球菌间接血凝抗原；
（3）震荡滴定板，充分混匀，置37℃恒温箱1.5-2h；
（4）根据红细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
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