CN109682977A - 一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，以及制备和使用这种试剂盒的方法。所述试剂盒中包括：(1)海氏肠球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液；并提供了试剂盒的制备和应用方法。本发明提供了一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，该试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用；本发明中的试剂盒在检测样品时只需简单的仪器耗材，全程在2‑3小时就能完成；结果判定直观，重复性好。能够快速，稳定，准确的检测海氏肠球菌的抗体。

Description

一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法，属于用于微生物的检测试剂技术领域。

背景技术

海氏肠球菌(Enterococcus hirae)属于肠球菌属，是一种广泛分布在陆生动物和禽类中的一种革兰氏阳性球菌，容易抑制小鸡的生长，造成动物的心膜炎以及感染人类后出现败血症，同时，在动物体内往往导致出现严重的耐药性。目前，海氏肠球菌几乎很少有感染人的报道。但是，近期在美国出现的病例表明，由于人类感染海氏肠球菌而发展成危及生命的疾病。该菌感染后与多种临床症状相关，包括心内膜炎，急性肾盂肾炎，急性胆囊炎，自发性细菌性腹膜炎等。因此该病原体具有重要的公共安全临床意义。目前国内外关于海氏肠球菌的研究报道甚少，对于海氏肠球菌的检测技术主要依靠实验室细菌分离、PCR分子生物学鉴定，对于海氏肠球菌的血清抗体检测技术在国内外均未见报道。鉴于此，有必要开发一种可检测海氏肠球菌血清抗体的免疫学技术，可满足开展对海氏肠球菌快速有效的血清学诊断技术，减少对海氏肠球菌感染造成的误诊及漏诊，从而对海氏肠球菌在畜牧生产中的感染状况进行调查。

发明内容

本发明提供一种操作简单、方便、快速，成本较低，无需专业技术的检测海氏肠球菌血清抗体效价的间接血凝试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法，用来开展海氏肠球菌的流行病学调查。

为了实现上述目的，本发明提供一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)海氏肠球菌间接血凝抗原1瓶(10ml)，4℃保存；

(2)标准阳性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；

(3)标准阴性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；

(4)稀释液3瓶(10ml/瓶)，4℃保存。

进一步的，上述的一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒，可检测40～50份血清，保存期为6个月。

进一步的，上述的一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述海氏肠球菌间接血凝抗原是将海氏肠球菌菌株CCTCC M 2018115株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。

进一步的，上述的一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述海氏肠球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制阿氏液：柠檬酸钠0.8克，柠檬酸0.055克，葡萄糖2.05克，氯化钠0.42克，双蒸水100ml。混匀后113℃高压10min，冷却至室温后4℃保存。

(2)配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)：称取206.21克Na₂HPO₄·12H₂O，30.46克KH₂PO₄，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后121℃高压20min，冷却至室温保存。

(3)静脉采集绵羊红细胞100ml，与100ml灭菌阿氏液混匀，在4℃静置5天，使红细胞充分沉淀。将沉淀好的红细胞摇匀，用灭菌纱布过滤，滤出液收集至大离心管中，以4000r/min离心15min，弃去上清。用磷酸盐缓冲液洗涤红细胞4遍。

(4)用磷酸盐缓冲液将红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，与2.5％的戊二醛按照5:1(v/v)的比例慢慢混匀，置磁力搅拌器上搅拌4h，然后用磷酸盐缓冲液洗涤5遍。

(5)用磷酸盐缓冲液将上述红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，再与等量1/20000(w/v)的鞣酸溶液混匀，即鞣酸溶液的终浓度为1/40000(w/v)，所用的溶液均为磷酸盐缓冲液。将上述红细胞悬液置于37℃水浴中，静置30min。然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，最后用磷酸盐缓冲液重悬至5％(v/v)的浓度。

(6)将海氏肠球菌的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原。

(7)以步骤(6)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(5)得到的绵羊红细胞悬液，得到海氏肠球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为150μg/ml～200μg/ml。

进一步的，上述的海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的海氏肠球菌甘油菌，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃、5％CO₂箱中培养15～20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18小时，然后把10ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12～15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用海氏肠球菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30min，然后冻融1次，再超声破碎1次。将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，用紫外分光光度计测定上清中的蛋白浓度。

将上述制备的海氏肠球菌抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康兔，接种抗原量200μg/只，2周后用同等剂量的抗原(与等体积弗氏不完全佐剂混合)加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次。第3次免疫后2周，采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为合格阳性血清。若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准。

进一步的，上述的一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述标准阴性血清的制备方法为：选取体重2.5公斤左右、未感染海氏肠球菌的健康樱桃谷鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，收集血清，经琼脂扩散试验检测，结果为阴性，即为标准阴性血清。

进一步的，上述的海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述稀释液的制备方法为：磷酸盐缓冲液中加入1％(v/v)的兔血清和0.01％(w/v)的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。

本发明的第二个目的是提供了上述一种海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒在检测海氏肠球菌血清抗体效价中的应用。

进一步的，上述的应用，所述海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为：

a)在96孔110°血凝板1～7排的1～12孔，第8排的1～8孔各加稀释液50μl。

b)在血凝板1～6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl。用排枪从血凝板1～6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔。在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔。在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5～8孔为空白对照。

c)每孔加入充分摇匀的海氏肠球菌间接血凝抗原25μl。

d)血凝板置于微量振荡器上振荡1～3分钟，充分混匀，盖上玻璃板，室温或37℃静置1～2小时。

e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50％红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。

本发明的优越性包括以下方面：

a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医相关单位以及养殖场广泛推广使用。本发明中的试剂盒在检测样品时只需要96孔110°血凝板、移液器、移液器枪头和玻璃板等简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养殖场也可以使用。

b.结果判定直观，眼观即可。

c.操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测。

d.成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。

附图说明

图1为琼脂扩散试验检测海氏肠球菌标准阳性血清和标准阴性血清，1:2～1:32表示血清的稀释倍数。该试验检测到的标准阳性血清抗体效价为1:32，标准阴性血清无琼扩条带出现，结果成立。

具体实施方式

实施例1：

本发明涉及的检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒中包括：

海氏肠球菌间接血凝抗原1瓶(5ml)，4℃保存；

1)标准阳性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；

2)标准阴性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；

3)稀释液3瓶(5ml/瓶)，4℃保存。

用来制备抗原的海氏肠球菌CCTCC M 2018115为田间分离株，保存于中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室。

本发明的试剂盒中各种试剂的制备方法是：

1.间接血凝抗原

将海氏肠球菌CCTCC M 2018115株增菌培养，超声破碎后，再离心取上清，作为抗原致敏鞣酸处理后的绵羊红细胞；

2.标准阳性血清

将海氏肠球菌CCTCC M 2018115株增菌培养，灭活后与佛氏佐剂混合，免疫健康樱桃谷鸭，获得高效价的血清抗体；

3.标准阴性血清

采自健康的、未感染海氏肠球菌的樱桃谷鸭的血清；

4.稀释液

磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)，含1％(v/v)兔血清和0.01％(w/v)叠氮钠。

本发明的试剂盒的使用方法是：

a)在110°血凝板1～7排的1～12孔，第8排的1～8孔各加稀释液50μl。

b)在血凝板1～6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl。用排枪从血凝板1～6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔。在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔。在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5～8孔为空白对照。

c)每孔加入充分摇匀的海氏肠球菌间接血凝抗原25μl。

d)血凝板置于微量振荡器上振荡1～2分钟，充分混匀，盖上玻璃板，室温或37℃静置1.5～2小时。

e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50％红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。

本发明的具体实施方法为：

一、海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒的组成

试剂盒中包括海氏肠球菌间接血凝抗原1瓶(10ml)，4℃保存；标准阳性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；标准阴性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；稀释液3瓶(10ml/瓶)，4℃保存。试剂盒可检测40～50份血清，保存期为6个月。

二、海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒的制备

1.标准阳性血清的制备

首先取出-80℃冻存的海氏肠球菌甘油菌，用接种环蘸取少量菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板上，置于37℃温箱中培养15～20小时，再挑取单菌落接种于10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min震荡培养15～18小时，然后把10ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min震荡培养12～15小时。培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)将菌体沉淀洗涤3次，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，作为超声破碎用菌体。

将上述制备的海氏肠球菌菌液置于碎冰中，再放到超声波细胞破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30min，然后冻融1次，再超声破碎1次。将破碎后的菌液以4℃、12000r/min离心15min，收集上清。

测定上述制备的上清中的蛋白浓度。经紫外分光光度计检测，菌液上清中的蛋白浓度为13.33mg/ml。这些上清液作为制备海氏肠球菌阳性血清用抗原，以及后续致敏绵羊红细胞的抗原，冻存于-40℃以下备用。

将上述制备的CCTCC M 2018115株抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康鸭，接种抗原量200μg/只，2周后用同等剂量的抗原(与等体积弗氏不完全佐剂混合)加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次。第3次免疫后2周，鸭翅静脉采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为合格阳性血清。若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准。

图1为琼脂扩散试验检测海氏肠球菌标准阳性血清和标准阴性血清，1:2～1:32表示血清的稀释倍数。该试验检测到的标准阳性血清抗体效价为1:32，标准阴性血清无琼扩条带出现，结果成立。

经琼脂扩散试验检测，所制备的CCTCC M 2018115菌株标准阳性血清的抗体效价达到1:32，符合标准。

2.标准阴性血清的制备

选取体重2.5公斤左右、未感染海氏肠球菌的健康樱桃谷鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，收集血清，经琼脂扩散试验检测，结果为阴性，即为标准阴性血清。

3.稀释液的制备

配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1％的兔血清和质量体积百分比为0.01％的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。

4.海氏肠球菌间接血凝抗原制备

静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4℃静置3～5天后，按常规方法对细胞进行洗涤、戊二醛固定、1/40000(w/v)的鞣酸处理。此过程中所用的溶液均为磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)。制备好的红细胞用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)悬浮至5％浓度。致敏用抗原与制备标准阳性血清中所用的抗原相同，即为MC2016菌液的超声裂解上清，蛋白浓度为13.33mg/ml。致敏用抗原的制备方法参见“标准阳性血清的制备”，其中对抗原的制备方法做了详细说明。

首先确定致敏绵羊红细胞的最佳抗原量。取制备好的5％浓度的红细胞5份，每份5ml。取制备好的菌株致敏用抗原，以终浓度25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml分别致敏红细胞。致敏时放于37℃水浴中，致敏时间为30min，期间每隔5min混匀一次，以防细胞沉淀。致敏后用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)洗涤4遍，再用稀释液洗涤1遍，最后用稀释液将红细胞悬浮至50ml，细胞终浓度为1％(v/v)。

检测抗原质量：取2块110°血凝板，在第1块板的第1～5排的1～12孔、第2块板的第1～5排的1～8孔，分别加入稀释液，50μl/孔。然后在第1块板的第1～5排的第1孔，分别加入50μl标准阳性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第12孔。在第2块板的第1～5排的第1孔，分别加入50μl标准阴性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第4孔，第5～8孔为空白对照。最后加入充分摇匀的间接血凝抗原，25μl/孔，将血凝板置于微量振荡器上振荡1～2分钟，充分混匀，室温或37℃静置1.5～2小时。

结果判定：以出现50％红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。

5种不同浓度的抗原致敏红细胞，得到的间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清的结果如表1。

表1不同浓度的抗原制备的间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清

由表1可知，MC2016抗原以25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml的终浓度致敏绵羊红细胞，制备的间接血凝抗原检测其对应的标准阳性血清，检出的血清效价分别为1:64、1:256、1:256、1:512和1:512。因此，确定MC2016抗原致敏红细胞的最佳终浓度为150μg/ml～200μg/ml。

根据确定的最佳致敏红细胞抗原量大批量制备间接血凝抗原，致敏、洗涤、最后用稀释液将红细胞悬浮至1％(v/v)终浓度，分装至10ml规格的玻璃瓶中，10ml/瓶，保存于4℃。

三、试剂盒的使用方法示例

1.取出4℃保存的间接血凝抗原，彻底悬浮、混匀，恢复至室温。

2.在110°血凝板1～7排的1～12孔，第8排的1～8孔各加稀释液50μl。3.在血凝板1～6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl。用排枪从血凝板1～6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔。在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔。在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次往后作2倍倍比稀释至第4孔，第5～8孔为空白对照。

4.每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μl。

5.血凝板置于微量振荡器上振荡1～2分钟，充分混匀，室温或37℃静置1～2小时。

6.结果判定：红细胞全部凝集(++++)；75％红细胞凝集(+++)；50％红细胞凝集(++)；25％红细胞凝集(+)；无凝集(-)。

在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔。以呈现++凝集的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。血清稀释倍数1:4出现+以下者判为阴性；血清稀释倍数1:4出现++以上、1:8出现+以下者判为可疑；血清稀释倍数1:8出现+++以上者判为阳性，并可确定抗体效价。

四、试剂盒的特异性和敏感性检测

用本发明中的试剂盒检测大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的阳性血清，结果均为阴性，表明特异性较好(表2)。海氏肠球菌间接血凝抗原检测对应的标准阳性血清，检测到的血清效价为1:512，而用琼脂扩散试验检测，检测到的血清效价仅为1:64，说明该试剂盒的敏感性更高(表3)。

五、重复性实验结果

1.批内重复性试验：3位操作者共同用同一批次的本发明试剂盒，对3种海氏肠球菌阳性血清、阴性血清每隔1个月检测一次，总共检测3次，每次间接血凝的检测结果完全相同，批内变异系数为：0。

2.批间重复性试验：应用3批本发明的试剂盒(批号2017313、2017323、2017333)对三种海氏肠球菌阳性血清、阴性血清每隔1个月检测一次，总共检测3次，每次结果基本相符(P>0.05)。说明本发明的血凝抗体试剂盒是稳定的。

表2海氏肠球菌间接血凝诊断试剂特异性试验结果

表3敏感性试验的检测结果

六、试剂盒检测田间样品

对采自山东、甘肃、河南的103份血清，用本发明的试剂盒和琼脂扩散试验分别进行检测。结果表明，试剂盒检测到的海氏肠球菌阳性率为33％(34/103)，效价均在1:16以上；琼脂扩散试验检测到的阳性率为26.2％(27/103)，两种方法检测结果的符合率为93.2％(96/103)。以上结果表明，本发明中涉及的海氏肠球菌间接血凝抗原及配套的试剂盒比琼脂扩散试验具有更高的敏感性，能有效检测海氏肠球菌的血清抗体，且能判定血清抗体效价。另外，该方法操作简单方便，结果判定直观，可在实际生产中推广应用。

最后说明：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的内容和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：海氏肠球菌间接血凝抗原，4℃保存；标准阳性血清，-20℃冻存；标准阴性血清1瓶，-20℃冻存；稀释液3瓶(10ml/瓶)，4℃保存，其中所述海氏肠球菌间接血凝抗原是将海氏肠球菌菌株CCTCC M 2018115株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。

2.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述海氏肠球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制阿氏液：柠檬酸钠0.8克，柠檬酸0.055克，葡萄糖2.05克，氯化钠0.42克，双蒸水100ml；混匀后113℃高压10min，冷却至室温后4℃保存；

(2)配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)：称取206.21克Na₂HPO₄·12H₂O，30.46克KH₂PO₄，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后121℃高压20min，冷却至室温保存；

(3)静脉采集绵羊红细胞100ml，与100ml灭菌阿氏液混匀，在4℃静置5天，使红细胞充分沉淀；将沉淀好的红细胞摇匀，用灭菌纱布过滤，滤出液收集至大离心管中，以4000r/min离心15min，弃去上清；用磷酸盐缓冲液洗涤红细胞4遍；

(4)用磷酸盐缓冲液将红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，与2.5％的戊二醛按照5:1(v/v)的比例慢慢混匀，置磁力搅拌器上搅拌4h，然后用磷酸盐缓冲液洗涤5遍；

(5)用磷酸盐缓冲液将上述红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，再与等量1/20000(w/v)的鞣酸溶液混匀，即鞣酸溶液的终浓度为1/40000(w/v)，所用的溶液均为磷酸盐缓冲液；将上述红细胞悬液置于37℃水浴中，静置30min；然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，最后用磷酸盐缓冲液重悬至5％(v/v)的浓度；

(6)将海氏肠球菌的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；

(7)以步骤(6)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(5)得到的绵羊红细胞悬液，得到海氏肠球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为150μg/ml～200μg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的海氏肠球菌甘油菌，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃、5％CO₂箱中培养15～20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18小时，然后把10ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12～15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用海氏肠球菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30min，然后冻融1次，再超声破碎1次；将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，用紫外分光光度计测定上清中的蛋白浓度；

将上述制备的海氏肠球菌抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康兔，接种抗原量200μg/只，2周后用同等剂量的抗原加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次；第3次免疫后2周，采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为合格阳性血清；若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准。

4.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述标准阴性血清的制备方法为：选取体重2.5公斤左右、未感染海氏肠球菌的健康樱桃谷鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，收集血清，经琼脂扩散试验检测，结果为阴性，即为标准阴性血清。

5.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述稀释液的制备方法为：磷酸盐缓冲液中加入1％(v/v)的兔血清和0.01％(w/v)的叠氮钠，即为稀释液；具体制备量可根据实际需要调整。

6.根据权利要求1所述的一种检测海氏肠球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，其特征在于，所述海氏肠球菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为：

a)在96孔110°血凝板1～7排的1～12孔，第8排的1～8孔各加稀释液50μl；

b)在血凝板1～6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl；用排枪从血凝板1～6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔；在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔；在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5～8孔为空白对照；

c)每孔加入充分摇匀的海氏肠球菌间接血凝抗原25μl；

d)血凝板置于微量振荡器上振荡1～3分钟，充分混匀，盖上玻璃板，室温或37℃静置1～2小时；

e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50％红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。