CN109696546A - 一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法 - Google Patents

一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：（1）无菌条件下取待测样品，加入含Al(OH)3的PBS缓冲液中，均质，获得样品菌液；（2）对样品菌液进行水浴热处理，离心，弃上清，收集菌体；（3）向菌体中加入小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用洗脱液对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行洗脱，然后向洗脱后的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，混合均匀，得到样品待测液；（4）将待测样品液进行培养、观察、检测。本发明提供的检测方法特异性强，灵敏度高，而且能有效缩短检测时间，降低检测成本。

Description

一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。
背景技术
小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)是一种广泛分布于自然界的人畜共患致病性微生物，存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、蛤和虾中，也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。目前已从家畜、狗、猫、山羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。小肠结肠炎耶尔森氏菌能够通过食物传播，能够引起多种动物以及人的小肠结肠炎耶尔森氏菌病，感染后主要症状表现为发热、腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等，严重危害人类健康。正因如此，很多国家规定，对于进出口的食品该菌是必检的常规项目。
目前小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法，还主要依赖于传统的微生物学检测方法。常规的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法操作步骤复杂，并且费时，一般要3～7天，不能达到快速检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的要求。因此，迫切需要建立一种快速、有效的检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，以实现对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行快速检测，及早发现传染源，切断其传播途径。
发明内容
针对现有技术存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下取待测样品，加入含Al(OH)3的PBS缓冲液中，均质，获得样品菌液；
(2)对样品菌液进行水浴热处理，然后离心，弃上清，收集菌体；
(3)向菌体中加入小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，经混合、振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用洗脱液对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行洗脱，然后向洗脱后的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，混合均匀，得到样品待测液；
(4)将待测样品液进行培养、观察、检测。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(1)中所述待测样品与PBS缓冲液的质量比为1:9，所述PBS缓冲液中Al(OH)3的质量浓度为0.5％～10％。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(2)中所述水浴热处理的温度为30℃～80℃，水浴时间为5min～30min。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(2)中所述离心温度为4℃，转速为4000rpm，离心时间为1min～5min。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(3)中所述振荡时间为1min～3min。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(1)中所述 PBS缓冲液的浓度为0.02mol/L；步骤(3)中所述洗脱液为0.02mol/L的PBS缓冲液，洗脱次数为2-3次。更加优选地，步骤(3)中所述洗脱的具体操作为：向吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入1mL 0.02mol/L PBS洗脱液，振荡混合均匀后静置磁力架上，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(3)中所述小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠是通过链霉亲和素修饰磁珠后偶联生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体制得。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠的具体制备方法，包括以下步骤：
a)用0.01mol/L磷酸盐-吐温20缓冲液稀释小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体至 1mg/ml；用无水二甲亚砜(DMSO)配制10mg/ml生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液(BNHS溶液)，将稀释的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体与生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液按体积比为1:3.3进行混合，室温下孵育，即得生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体；
b)向生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体中加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，得到抗体与磁珠的混合物，室温放置；
c)向步骤b)制得的混合物中加入7.8μL1mol/L NH4Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01％叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。
根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤a)中所述磷酸盐-吐温20缓冲液的pH值为6.5。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：
(1)本发明在对样品检测前，采用含Al(OH)3的PBS缓冲液进行前处理，能够破坏待测样品中大量的杂菌，减少杂菌的干扰，提高小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率，使菌体更加稳定；水浴热处理能够进一步杀灭样品中的非目标菌，减少杂菌的干扰，同时，还能使样品中的蛋白发生变性，降低样品中蛋白大分子的干扰；水浴后离心处理有利于样品中菌体和杂质快速分离和减少杂质；利用小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠与菌体中目标菌的特异性结合，达到富集样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的目的，增加小肠结肠炎耶尔森氏菌检出率，有效避免或减少假阳性现象的发生，提高了小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测准确性，同时也缩短了检测时间。
(2)本发明将PBS缓冲液中Al(OH)3的质量浓度控制为0.5％～10％，在该质量浓度范围内Al(OH)3能够破坏待测样品中大量的杂菌，减少杂菌的干扰，使小肠结肠炎耶尔森氏菌更加稳定的生长，提高小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率和检测结果准确性。而Al(OH)3的浓度过低，则起不到破坏杂菌的目的，不能减少杂菌对目标菌检测的干扰；如果Al(OH)3的浓度过高，样品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌易被破坏，不利于后续小肠结肠炎耶尔森氏菌的富集和检测，而且会导致检测结果不准确。
(3)水浴热处理选择在30℃～80℃水浴对样品菌液热处理5min～30min，该水浴处理条件能够杀灭样品中的非目标菌，减少杂菌干扰，同时还能使样品中的蛋白发生变性，降低样品中蛋白大分子的干扰，进一步增大目标菌的检出率，提高检测结果的准确性；而且，该水浴热处理条件对小肠结肠炎耶尔森氏菌的活性影响小。
(4)制备免疫磁珠时，高浓度的BNHS溶液会导致多个生物素分子结合在抗体上，致使所有抗体都被标记，较低的浓度的BNHS溶液则会是使生物素化保持在最低限度，致使抗体生物素化不足，因此，为了给目标菌抗体提供适宜的生物素化程度，防止目标菌抗体生物素化不足或者过多，干扰后续检测结果的准确性，本发明选择用无水DMSO配制10mg/mlBNHS溶液。
(5)在PBS缓冲液中加入Tween-20，利用该缓冲液对抗体溶液进行稀释，能够除去未结合的生物素，防止反应混合液中有游离氨基存在，而抑制小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体的生物素标记反应，提高检测结果的准确性。
(6)本发明制备的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠具有免疫反应的高度特异性和磁分离的快速、简单的优点，能够特异性捕获、吸附菌体中的小肠结肠炎耶尔森氏菌，将小肠结肠炎耶尔森氏菌从样品中快速分离，达到富集样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的目的，而且富集速度快，灵敏度高，很好地解决低含量低水平的病原微生物的检测问题；还能够降低样品中杂质干扰，有效避免或减少假阳性现象的发生，提高了小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率，同时也缩短了检测时间。
(7)本发明检测方法检测灵敏度高(可达到10-8)，特异性强，准确性高，而且检测方法操作简单，耗费试剂少，与传统分离培养相比，利用小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠富集样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌，可有效减少增菌培养时间和平板培养时间，极大地缩短样品前处理时间(由国标的48h～72h前处理缩短为40min)，进而也缩短了整个检测时间，提高了小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测效率。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
制备小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠
小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠是通过链霉亲和素修饰磁珠后偶联生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体制得，具体包括以下步骤：
a)用0.01mol/L磷酸盐-吐温20缓冲液(pH 6.5)稀释小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体至1mg/ml；用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，将稀释的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体与生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液按体积比为1:3.3进行混合，室温下孵育，即得生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体；
b)向生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体中加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，得到抗体与磁珠的混合物，室温放置；
c)向步骤b)制得的混合物中加入7.8μL 1mol/L NH4Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01％叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。
实施例1：Al(OH)3浓度的筛选
取5份225ml含不同浓度Al(OH)3的PBS缓冲液(PBS缓冲液的浓度为 0.02mol/L)于五个无菌的均质袋中(五个均质袋中Al(OH)3质量浓度分别为0.5％、 1％、3％、5％、10％)，每个均质袋中加入25g小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性样品 (具体采用的是含有小肠结肠炎耶尔森氏菌的冷链肉)，均质30s，制得样品菌液。
另外，采用225ml改良磷酸盐缓冲液、不含Al(OH)3的PBS缓冲液(0.02mol/L PBS)作为对比液，向每一种对比液中加入25g小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性样品，均质30s，制得样品菌液。
按照GB 4789.8中规定的检测方法，依次进行增菌、划线分离、生化试验等操作，得出试验结果，其结果见表1。
表1选用不同Al(OH)3浓度的检测菌落数
由表1可以看出，待检样品采用改良磷酸盐缓冲液和不含Al(OH)3的PBS 缓冲液进行处理，并不能完全检出样品小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性菌落，采用含 3％Al(OH)3的PBS缓冲液作为前处理缓冲液时，最有利于小肠结肠炎耶尔森氏菌的生长，而且检出的小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性菌最高，继续增加Al(OH)3的浓度，其菌落数也并未进一步提高，因此，Al(OH)3的质量浓度优选为3％。
实施例2：水浴热处理温度的筛选
取小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性样品(具体为含有小肠结肠炎耶尔森氏菌的冷链肉)25g，加入225mL含3％Al(OH)3的PBS缓冲液的无菌均质袋中，均质30s，得到样品菌液。取5mL样品菌液，分别采用30℃、40℃、50℃、60℃、80℃水浴热处理15min，杀灭非目标菌。然后按照GB 4789.8中规定的检测方法，依次进行增菌、划线分离、生化试验等操作，得出试验结果，具体见表2。
表2不同水浴热处理温度的检测菌落数
由表2可知，水浴热处理温度不高于60℃时，检出的菌落数随温度的升高而增加，当水浴热处理温度超过60℃后检出的菌落数下降，是因为水浴温度过低，达不到杀灭非目标菌的目的，水浴温度过高则会影响小肠结肠炎耶尔森氏菌的活性。水浴热处理温度为60℃时，检出的小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌落数最多，因此，选择60℃作为水浴热处理的最佳温度。
实施例3：水浴热处理时间的筛选
取小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性样品(具体为含有小肠结肠炎耶尔森氏菌的冷链肉)25g，加入225mL含3％Al(OH)3的PBS缓冲液的无菌均质袋中，均质30s，得到样品菌液。取5mL样品菌液，60℃水浴分别热处理5min、10min、15min、 20min、30min，杀灭非目标菌。按照GB 4789.8中规定的检测方法，依次进行增菌、划线分离、生化试验等操作，得出试验结果，具体见表3。
表3不同水浴热处理温度的检测菌落数
由表3可知，水浴时间不超过15min时，检出的菌落数随水浴热处理时间的增加而增加，水浴时间超过15min后再进一步增加水浴热处理时间，菌落数几乎不再变化。当水浴热处理时间为15min时，小肠结肠炎耶尔森氏菌数最多且检出的阳性菌数也最多，故选用15min作为水浴热处理的最佳时间。
实施例4：离心时间的确定
取小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性样品(具体为含有小肠结肠炎耶尔森氏菌的冷链肉)25g，加入225mL含3％Al(OH)3的PBS缓冲液的无菌均质袋中，均质30s，得到样品菌液。取5mL样品菌液，60℃水浴热处理15min，冷却至室温，然后冷冻干燥。取冻干后的菌体，加入1mL ddH2O水，漩涡仪混匀，室温下放置2min，然后在4℃4000r/min下分别离心1min、2min、3min、5min，除去澄清水，收集菌体。按照GB 4789.8中规定的检测方法，依次进行增菌、划线分离、生化试验等操作，得出试验结果，具体见表4。
表4不同离心时间的检测菌落数
由表4可知，离心时间为2min时，可检出的菌落数最高，继续增加离心时间，所检测到的菌落数几乎不变，故菌液的离心时间优选为2min。
实施例5：振荡时间的确定
(1)取小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性样品(具体为含有小肠结肠炎耶尔森氏菌的冷链肉)25g，加入225mL含3％Al(OH)3的PBS缓冲液的无菌均质袋中，均质30s，得到样品菌液；
(2)取5mL样品菌液，60℃水浴分别热处理15min，冷却至室温，然后冷冻干燥。取冻干后的菌体，加入1mLddH2O水，漩涡仪混匀，室温下放置2min，然后在4℃4000r/min离心2min，除去澄清水，收集菌体；
(3)向菌体中加入50μL已制备好的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，振荡，振荡时间分别为1min、2min、3min。振荡后静置磁力架上1min，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用 0.02mol/L的PBS缓冲液(pH7.4)对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行3次洗脱(洗脱的具体操作为：向吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入1mL0.02mol/L PBS缓冲液(pH7.4)，振荡混合均匀后静置磁力架上，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清)，然后向洗脱后的磁珠中加入100μL0.02mol/L PBS缓冲液，重悬磁珠，得到样品待测液；
(4)然后按照GB 4789.8中规定的检测方法，分别对上述样品待测液进行涂板计数操作，得出试验结果，具体见表5。
表5不同振荡时间的检测菌落数
由表5可知，振荡时间为2min时，检测到的菌落数最多，振荡时间过长，菌落数变化较小，振荡时间优选为2min。
实施例6：免疫磁珠分离小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度试验
取小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性样品(具体为含有小肠结肠炎耶尔森氏菌的冷链肉)25g，加入225mL含3％Al(OH)3的PBS缓冲液的无菌均质袋中，均质30s，得到样品菌液；将样品菌液按照10倍倍比稀释成10-5、10-6、10-7和10-8四个不同的浓度梯度，分别取5mL浓度梯度为10-5、10-6、10-7和10-8的样品菌液，60℃水浴分别热处理15min，冷却至室温，然后冷冻干燥；取冻干后的菌体，加入1mL ddH2O水，漩涡仪混匀，室温下放置2min，然后在4℃4000r/min下离心2min，除去澄清水，收集菌体；向菌体中加入50μL已制备好的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，混合振荡2min，振荡后静置磁力架上1min，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用0.02mol/L的PBS 缓冲液(pH7.4)对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行3次洗脱(洗脱的具体操作为：向吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入1mL 0.02mol/LPBS缓冲液(pH7.4)，振荡混合均匀后静置磁力架上，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清)，然后向洗脱后的磁珠中加入1mL0.02mol/L PBS缓冲液 (pH7.4)，重悬磁珠，得到样品待测液；取100μL样品待测液涂于LB培养基平板，36℃培养24h，观察菌落并计数，得出试验结果，具体见表6。
表6免疫磁珠分离冷链肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌敏感性试验
从表6结果可知，经免疫磁珠富集后，小肠结肠炎耶尔森氏菌菌落的检出量明显高于直接平板计数，小肠结肠炎耶尔森氏菌菌液在稀释度为10-8时，直接平板计数已经无法检测出目标菌，而经免疫磁珠富集后，依然能检测出目标菌，相应的细菌浓度为6cfu/mL，由此可见，本发明提供的检测方法敏感性高，其对小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测灵敏度远高于传统的直接平板计数法。
实施例7：免疫磁珠分离小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性实验
将50μL免疫磁珠，分别加入到1mL小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌、乙型溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒杆菌菌液中。充分混匀后振荡2min，静置磁力架上1min，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清液，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用0.02mol/L的PBS缓冲液(pH7.4)对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行2次洗脱(洗脱的具体操作为：向吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入1mL 0.02mol/L PBS洗脱液，振荡混合均匀后静置磁力架上，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清)；然后向洗脱后的免疫磁珠中加入1mL 0.02mol/L PBS缓冲液(pH7.4)振荡重悬磁珠，得到样品待测液。每种样品待测液各取 100μL涂LB培养基平板，36℃培养24h，观察菌落并计数，得出试验结果，具体见表7。
表7免疫磁珠分离小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性实验
菌液 直接平板计数(CFU/mL) 免疫磁珠(CFU/mL)
小肠结肠炎耶尔森氏菌 158 236
鼠疫耶尔森氏菌 29 74
金黄色葡萄球菌 0 0
福氏志贺氏菌 0 0
大肠埃希氏菌 0 0
乙型溶血性链球菌 0 0
蜡样芽孢杆菌 0 2
肉毒杆菌 1 4
由表7可知，经过培养检测后，涂布有小肠结肠炎耶尔森氏菌菌液、鼠疫耶尔森氏菌菌液、蜡样芽孢杆菌菌液和肉毒杆菌菌液的培养平板上均有菌落生长，其中，涂布小肠结肠炎耶尔森氏菌菌液的平板菌落数最多，涂布鼠疫耶尔森氏菌的平板菌落数相对较少，涂布蜡样芽孢杆菌和肉毒杆菌菌液的平板中只有很少数量的菌落，涂布金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌和乙型溶血性链球菌菌液的平板中则未出现菌落，由此说明小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠具有良好的特异性，能够特异性吸附菌液中的小肠结肠炎耶尔森氏菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）无菌条件下取待测样品，加入含Al(OH)3的PBS缓冲液中，均质，获得样品菌液；
（2）对样品菌液进行水浴热处理，然后离心，弃上清，收集菌体；
（3）向菌体中加入小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，经混合、振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用洗脱液对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行洗脱，然后向洗脱后的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，混合均匀，得到样品待测液；
（4）将待测样品液进行培养、观察、检测。
2.根据权利要求1所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（1）中所述待测样品与PBS缓冲液的质量比为1:9，所述PBS缓冲液中Al(OH)3的质量浓度为0.5%～10%。
3.根据权利要求1所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（2）中所述水浴热处理的温度为30℃～80℃，水浴时间为5min～30min。
4.根据权利要求1-3任一所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（2）中所述离心温度为4℃，转速为4000rpm，离心时间为1 min～5min。
5.根据权利要求4所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（3）中所述振荡时间为1 min～3min。
6.根据权利要求5所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（1）中所述PBS缓冲液的浓度为0.02mol/L；步骤（3）中所述洗脱液为0.02mol/L的PBS缓冲液，洗脱次数为2～3次。
7.根据权利要求1或2或3或5或6所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（3）中所述小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠是通过链霉亲和素修饰磁珠后偶联生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体制得。
8.根据权利要求7所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠的具体制备方法，包括以下步骤：
a）用0.01mol/L磷酸盐-吐温20缓冲液稀释小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体至1mg/ml；用无水二甲基亚砜配制10mg/ml生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，将稀释后的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体与生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液按体积比为1:3.3进行混合，室温下孵育，即得生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体；
b）向生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体中加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，得到抗体与磁珠的混合物，室温放置；
c）向步骤b）制得的混合物中加入7.8μL 1mol/L NH4Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。
9.根据权利要求8所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤a）中所述磷酸盐-吐温20缓冲液的pH值为6.5。
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