CN101893628A

CN101893628A - 一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒及其制造方法

Info

Publication number: CN101893628A
Application number: CN2009102477419A
Authority: CN
Inventors: 陈家旭; 蔡玉春; 郭俭
Original assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2010-11-24

Abstract

本发明提供了一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒及其制造方法，包括冻干抗SEA的IgY致敏红细胞、致敏红细胞稀释液、标本稀释液、阳性对照品、阴性对照品。本发明还提供了一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒的制造方法，包括一个制备日本血吸虫可溶性抗原的步骤，一个抗原免疫及鸡蛋收集的步骤，一个特异性抗SEA-IgY提取纯化的步骤，一个制备醛化红细胞的步骤，一个制备鞣化红细胞的步骤，一个特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞的步骤，一个制备冷冻干燥红细胞的步骤。本发明的试剂盒操作简便、快速、敏感性高、特异性强、重复性好。

Description

一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒及其制造方法

技术领域：

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种试剂盒，具体来说是一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒及其制造方法。

背景技术：

1、免疫诊断在日本血吸虫病防治中的重要性

血吸虫病是一种广泛流行于热带和亚热带地区的人兽共患寄生虫病，全球76个国家和地区的约2亿人口受感染，有6亿人口受感染威胁。我国是日本血吸虫病流行区，建国初期曾严重影响了人们的正常生产和生活。经过50多年的防治，已经取得了举世瞩目的成就，到2003年全国共有血吸虫病病人数843 007人，较建国初期(1161.2万人)减少了92.74％。已有广东、上海、福建、广西、浙江等5省(区、市)阻断了血吸虫病的传播；仅剩湖南、湖北、江西、安徽、江苏等5省湖区及川、滇山区未得到控制。我们在欣喜的同时，也面临着进一步防治工作的巨大挑战。随着防治工作的深入，人群感染度不断下降，低度流行区扩大，血吸虫病的病原学诊断在现场大范围的应用越来越困难，不但敏感性差、费时费力，且不易被群众和工作人员接受。另一方面，现在控制血吸虫病的主要手段是吡喹酮化疗，但大规模，反复单一药物化疗，可能产生药物抗性，据国外报道，已经出现具吡喹酮抗性的曼氏血吸虫株，因此研制用于血吸虫病低度流行区的敏感性和特异性更高的诊断手段已经被列为第三大世界血吸虫病防治规划优先研究项目。

2、循环抗原在日本血吸虫病免疫诊断中的应用

经过几十年的发展，血吸虫病免疫诊断技术已具有较高的敏感性、特异性和可行性。检测血吸虫循环抗体是一种成本低、操作简单的检测，也是目前现场流行病学调查时应用最广的途径，但循环抗体在治疗后相当长一段时间内仍保持较高水平，不易区分既往感染和现症感染，无法在现场应用时确定目标化疗人群；而且难以反映药物疗效，不宜用作疗效考核的评价指标。另一种途径是检测循环抗原，循环抗原(circulating antigen，CAg)是存在于患者血液、唾液、尿液等体液中的血吸虫虫体的代谢产物及分泌物，检测患者血清或尿液中的循环抗原，可评估虫负荷数和活动性感染，可以作为诊断的依据。而且，在治疗后，CAg转阴较快，检测循环抗原可以作为疗效考核的依据，基于循环抗原检测的各种方法曾出不穷，但都困扰在敏感性低、特异性不强的问题上，因此寻找敏感性高、特异性强的循环抗原检测方法和技术是血吸虫病免疫诊断的新方向。

3、IgY用作免疫诊断抗体的可行性

卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)是鸟类、两栖和爬行类动物主要的免疫球蛋白。IgY是一种系统型抗体，可根据抗原分子的大小结合1～2个抗原，显示为单价或二价。IgY相对分子质量(Mr)为180 000，沉降系数约为7.8，包含2个重链(H)和2个轻链(L)，重链相对分子质量(Mr)为68 000，比IgG(H)(Mr 50 000)稍重。IgY的免疫学特性：(1)由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。(2)不与类风湿因子(Rheumatoid factors，RF)结合。(3)不会激活补体系统。(4)不结合细菌和哺乳动物细胞表面Fc受体，使得IgY在双重免疫组化方面比IgG更具优势。(5)与IgG几无交叉反应，常用于循环复合物的测定.基于以上优点，IgY技术在医学领域已经得到广泛应用，特别是一些免疫诊断技术如沉淀反应、免疫电泳、ELISA、免疫电镜和免疫印迹，表明IgY完全可以取代传统的IgG。免疫十天后，在鸡体内即可获得高滴度的抗体，而且效价稳定，可以持续6-28周。另外，免疫鸡的饲养简单，花费少，符合3个RS[替代(replacing)、减少(reducing)、改善(refining)]的动物保护原则，减少了对动物的伤害。鉴于IgY的产量大、稳定性好、独特的免疫学特性以及动物种系发生学距离远等优点，被称为最有潜力的哺乳动物抗体替代品。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒及其制造方法，所述的这种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒及其制造方法要解决现有技术中检测血吸虫循环抗体无法区分既往感染与现症感染，无法进行疗效考核以及检测循环抗原的方法敏感性低、特异性不强的技术问题。

本发明提供了一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒，所述的试剂盒中载有试剂，其中，所述的试剂由包括冻干抗SEA-IgY致敏红细胞、致敏红细胞稀释液、标本稀释液、阳性对照品、阴性对照品，所述的阳性对照品为日本血吸虫可溶性抗原标准稀释液，所述的阴性对照品为人的正常血清。

进一步的，所述的致敏红细胞稀释液采用双蒸水。

进一步的，所述的标本稀释液是0.9％的生理盐水。

进一步的，所述的冻干抗SEA-IgY致敏红细胞通过如下方法制备：包括一个制备醛化红细胞的步骤，一个制备鞣化红细胞的步骤，一个特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞的步骤，一个制备冷冻干燥红细胞的步骤。

具体的，在制备醛化红细胞的步骤中：取人“O”型红细胞生理盐水洗5次，放入刻度离心管，3000r/min离心10min，取1ml压积红细胞加pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)25ml混匀后，缓慢滴加2.5％戊二醛3ml，室温，用磁力搅拌器搅拌滴至最后一滴，开始计时1小时，如上离心后用PBS洗3次，双蒸水洗2次，生理盐水配成10％红细胞悬液，置4℃保存备用。

具体的，在制备鞣化红细胞的步骤中：称取10mg鞣酸，溶于100ml生理盐水中，等鞣酸完全溶解后，将其和2.5％醛化红细胞悬液等量混和，37℃水浴15min，期间不断振荡，如上离心后PBS洗3次。

具体的，在特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞的步骤中：将纯化后特异抗SEA-IgY用PBS(pH7.0)稀释，将其和2.5％鞣化红细胞悬液等量混和，37℃水浴45min，期间不断振荡，如上离心后PBS洗3次。再用1％正常兔血清(经56℃灭活30min后，用pH7.2的PBS配制)洗涤两次，以除去多余的抗原。

具体的，在制备冷冻干燥红细胞的的步骤中：在致敏红细胞中加10％蔗糖和1％灭活正常兔血清的pH7.2PBS保护液，浓缩成5％致敏红细胞充分振荡使蔗糖溶解，吸取0.5ml分装于2ml的安瓿内，液氮速冻后放入冷冻干燥机抽干，取出后测定效价。

本发明还提供了一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒的制造方法，包括一个制备日本血吸虫可溶性抗原的步骤，一个抗原免疫及鸡蛋收集的步骤，一个特异性IgY提取纯化的步骤，一个制备醛化红细胞的步骤，一个制备鞣化红细胞的步骤，一个特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞的步骤，一个制备冷冻干燥红细胞的步骤。

本发明应用特异性抗日本血吸虫可溶性抗原(SEA)的IgY抗体和反向间接血凝技术(Reverse indirect hemagglutination test，RIHA)研制出了一种检测日本血吸虫循环抗原试剂盒。该试剂盒操作简便、快速；敏感性高、特异性强、重复性好。本发明非常适合医院检验科、疾病防控中心、社康中心、私人诊所等部门用于日本血吸虫病的临床辅助诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值和可观的经济及社会效益。

本发明试剂盒的工作原理：在血凝板上将待测血清不同浓度稀释后，将用稀释液稀释的特异抗SEA-IgY致敏红细胞加入孔内，致敏红细胞与血清中相应血吸虫病循环抗原结合而使红细胞拉聚在一起，出现可见凝集反应。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.检测循环抗原，可作为临床诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值和广阔的应用前景。

2.本发明的试剂盒，具有操作简便快速、敏感性高、特异性强、重复性好、结果直观、无需专门设备、不受环境条件的干扰、易于在广大群众中推广。

3.本发明的试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好，适合高校和科研机构参考学习。

附图说明：

图1是采用本发明的试剂盒测定结果示意图。

图2是本发明的试剂盒检测血吸虫循环抗原的原理图。

具体实施方式：

实施例1：抗日本血吸虫虫卵抗原(SEA)特异性IgY制备和纯化

1.日本血吸虫可溶性抗原的制备：将每只感染1500条日本血吸虫尾蚴(来自中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所)的7只新西兰兔在42天后按常规方法解剖，从肝脏中分离收集虫卵并冻干。取干卵称重，按1％的比例溶于0.9％的生理盐水中，置4℃冷浸4天，期间每天振摇2次，每次2分钟。4天后冰浴超声粉碎，每次3分钟，间歇3分钟，共3次。再如上冷浸2天，10000rpm4℃离心30分钟，取上清，收集分装，用Braford法测定抗原蛋白浓度，-20℃保存备用。

2.抗原免疫及鸡蛋的收集：将日本血吸虫SEA抗原50μg与等量弗氏完全佐剂混合、充分乳化后，经海蓝蛋鸡双翅翅根静脉注射。4周后，用SEA抗原与等体积弗氏不完全佐剂加强免疫一次，剂量同上。以后每月直接用抗原加强免疫一次，剂量同首次。收集免疫后4-20周的鸡蛋，并做好标记，4℃冰箱储存。

3.特异抗SEA-IgY抗体的提取与纯化：用卵黄分离器取卵黄，双蒸水清洗后量筒计量，与PH为5.2的双蒸水按1∶8稀释，置常温搅拌2.5小时，后在-20℃冷冻3小时，再放4℃缓慢融化，4℃5000rpm离心25分钟，取上清即获得IgY粗提液。加入等体积的饱和硫酸铵溶液，放置3小时，在4℃10000rpm，25分钟离心，将离心后的沉淀稀释到原卵黄液体积，再加入1/2的饱和硫酸铵溶液，4°放置3小时。此过程反复2-3次。所得沉淀经透析、浓缩至原蛋黄液的1/10(或用聚乙二醇6000浓缩)，分装到冷冻管中-20°保存。

4.醛化红细胞的制备：取人“O”型红细胞生理盐水洗5次，放入刻度离心管，用3000r/min离心10min，取1ml压积红细胞加pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)25ml混匀后，缓慢滴加2.5％戊二醛3ml，室温，用磁力搅拌器搅拌滴至最后一滴，开始计时1小时，如上离心后用PBS洗3次，双蒸水洗2次，生理盐水配成10％红细胞悬液，置4℃保存备用。

5.鞣化红细胞的制备：称取100mg鞣酸，溶于100ml生理盐水中，等鞣酸完全溶解后，将其和2.5％醛化红细胞悬液等量混和，37℃水浴15min，期间不断振荡，如上离心后PBS洗3次。

6.特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞：将纯化后特异抗SEA-IgY用PBS(pH7.0)稀释，将其和2.5％鞣化红细胞悬液等量混和，37℃水浴45min，期间不断振荡，如上离心后PBS洗3次。再用1％正常兔血清(经56℃灭活30min后，用pH7.2的PBS配制)洗涤两次，以除去多余的抗原。

7.冷冻干燥红细胞的制备：在致敏红细胞中加10％蔗糖和1％灭活正常兔血清的pH7.2PBS保护液，浓缩成5％致敏红细胞充分振荡使蔗糖溶解，吸取0.5ml分装于2ml的安瓿内，液氮速冻后放人冷冻干燥机抽干，取出后测定效价。

实施例2：本发明提供了一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒及其制造方法，包括冻干抗SEA-IgY致敏红细胞、致敏红细胞稀释液、标本稀释液、阳性对照品、阴性对照品，所述的阳性对照品为日本血吸虫可溶性抗原标准稀释液，所述的阴性对照品为人的正常血清。

具体的，所述的致敏红细胞稀释液采用双蒸水(DDH₂O)，所述的标本稀释液是0.9％的生理盐水。

阳性对照标准品制备：选择2.5GK健康家兔，按常规法感染每只兔1500-2000条尾蚴，8周后从肝脏中分离收集虫卵并冻干。取干卵称重，按1％的比例溶于0.9％的生理盐水中，置4℃冷浸4天，期间每天振摇2次，每次2分钟。4天后冰浴超声粉碎，每次3分钟，间歇3分钟，共3次。再如上冷浸2天，10000rpm4℃离心30分钟，取上清，收集分装，用Braford法测定抗原蛋白浓度，分装到EP管里，-20℃保存备用。

阴性对照血清制备：到血吸虫病非疫区采集正常人血清，用RIHA进行测定，1∶5阴性者作为阴性参考血清，然后分装到EP管里，-20℃保存备用。

进一步的，所述的抗SEA-IgY致敏红细胞通过如下方法制备，所述的制备方法包括一个制备醛化红细胞的步骤，一个制备鞣化红细胞的步骤，一个特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞的步骤，一个制备冷冻干燥红细胞的步骤。

具体的，在制备鞣化红细胞的步骤中：称取100mg鞣酸，溶于100ml生理盐水中，等鞣酸完全溶解后，将其和2.5％醛化红细胞悬液等量混和，37℃水浴15min，期间不断振荡，如上离心后PBS洗3次。

具体的，在制备冷冻干燥红细胞的的步骤中：在致敏红细胞中加10％蔗糖和1％灭活正常兔血清的pH7.2PBS保护液，浓缩成5％致敏红细胞充分振荡使蔗糖溶解，吸取0.5ml分装于2ml的安瓿内，液氮速冻后放人冷冻干燥机抽干，取出后测定效价。

实施例3：检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒使用：

1、操作步骤：

(1)、配置致敏红细胞悬液：取冻干致敏红细胞加稀释液1ml，充分混匀。

(2)、每次试验均应设阴性、阳性对照。阳性、阴性对照血清为冻干品，使用前每管加100μl蒸馏水稀释，充分溶解后使用。

(3)、血凝板的第1列第1孔加标本稀释液100μl，第2～4孔加标本稀释液。于第1孔加30μl待测血清，充分混匀后吸出30ul于第2孔，第2孔充分混匀后依次倍比稀释至第4孔，在第4孔混匀后弃去多余的30μl，第2至第4孔血清稀释度分别为1∶10、1∶20和1∶40。然后于第2～4孔每孔加致敏红细胞悬液1滴，震摇1～2分钟，置37℃30min后观察结果。

2、结果判定：

(1)、本实验阳性对照出现凝集反应，阴性对照不出现凝集反应，结果方可成立(如图2所示)。

(2)、根据红细胞凝集程度以“-”，“+”，“++”，“+++”记录结果，以呈“+”凝集的血清最高稀释度作为血清的效价，以效价≥1∶10作为阳性判断标准。

(3)、血凝反应强度的判定(如图1所示)：

-：红细胞全部下沉在孔底，形成肉眼可见紧密、边缘光滑的小圆点。

+：多数红细胞下沉在孔底形成圆点，周围可见少量凝集红细胞。

++：孔底中心可见少量红细胞下沉的小圆点，多数凝集红细胞在孔底周围形成小薄层。

+++：红细胞形成薄层凝集，布满整个孔底。

实施例四：一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒灵敏度检测

灵敏度试验：检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒，用于检测稀释液倍比稀释的日本血吸虫可溶性抗原，30分钟判定结果(见表1)，基于IgY的血吸虫病循环抗原反向间接血凝检测试剂盒低至10μg/ml的循环抗原量，显示出较高的检测灵敏度。

表1 基于IgY的血吸虫循环抗原间接血凝检测试剂盒敏感性的测定结果

SEA抗原	5μg/ml	10μg/ml	20μg/ml	40μg/ml	80μg/ml
						检测结果	-	+	+	+	+

Claims

1.一种检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒，所述的试剂盒中载有试剂，其特征在于：所述的试剂由冻干抗SEA-IgY致敏红细胞、致敏红细胞稀释液、标本稀释液、阳性对照品和阴性对照品组成，所述的阳性对照品为日本血吸虫可溶性抗原标准稀释液，所述的阴性对照品为人的正常血清。

2.如权利要求1所述的检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒，其特征在于：所述的致敏红细胞稀释液采用双蒸水。

3.如权利要求1所述的检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒，其特征在于：所述的标本稀释液是0.9％的生理盐水。

4.如权利要求1所述的检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒，其特征在于所述的冻干抗SEA-IgY致敏红细胞通过如下方法制备：包括一个制备醛化红细胞的步骤，一个制备鞣化红细胞的步骤，一个特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞的步骤，一个制备冷冻干燥红细胞的步骤。

5.权利要求1所述的检测血吸虫循环抗原间接血凝试剂盒的制造方法，其特征在于：所述的制造方法包括一个制备日本血吸虫可溶性抗原的步骤，一个抗原免疫及鸡蛋收集的步骤，一个特异性抗SEA-IgY提取纯化的步骤，一个制备醛化红细胞的步骤，一个制备鞣化红细胞的步骤，一个特异抗SEA-IgY抗体致敏红细胞的步骤，一个制备冷冻干燥红细胞的步骤。