CN104965079A - 新型微柱凝胶法hiv抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞，其制备方法包括微柱凝胶卡的制备和指示红细胞的制备。本发明新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒灵敏度高，特异性好，质量稳定，检测过程耗时短，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，能够使HIV抗体检测成为临床常规检测项目。

Description

新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒的组成、制备方法及其应用，适用于艾滋病的前期诊断和治疗后监测。
背景技术
HIV是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属逆转录病毒的一种，至今仍无有效疗法的一种致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫系统，使其失去抵抗力，从而导致各种疾病包括癌症在内得以在人体内生存、发展，最终导致艾滋病。随着艾滋病患者的增加，及时检测和诊断艾滋病，是减少传播和延长发病时间的有效途径，早期诊断、早期治疗不仅有利于延缓病情发展，提高生活质量，还可及时保护他人免受感染，有利于艾滋病的控制。
目前存在的HIV抗体检测技术包括：酶联免疫吸附试验，颗粒凝集法，化学发光法和免疫荧光法等，但这些试验的操作程序都比较复杂，耗时长，并且有些试验所需设备和仪器比较昂贵。微柱凝胶检测方法目前在ABO血型、血清中不规则抗体的检测、交叉配血中等都有广泛的应用，但在HIV抗体检测中还未有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、快捷、检测过程耗时短且质量稳定的新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均包含聚丙烯酰胺或葡聚糖凝胶颗粒；所述指示红细胞是结合抗HIV抗体的正常O型Rh阴性红细胞或O型醛化红细胞；
所述试剂盒的制备包括以下步骤：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0~6.5）×l0-4g／mL、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2~1.5）×l0-4g／mL、甘氨酸（1. 6~1.9）×l0-2g／mL、氯化钠（1. 6~1.8）×l0-3g／mL、磷酸二氢钾（2. 0~2.4）×l0-4g／mL、磷酸氢二钠（4.5~4.8）×l0-4g／mL，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6~6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20~30uL的量，分别加入到微柱凝胶卡的微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）红细胞洗涤：将O型红细胞以3000rpm离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6~8次后配制成5%红细胞；
2）醛化处理：在1）所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1~2:1进行混合；
3）洗涤：将2）醛化后的红细胞以2500rpm离心2.5min，并用0.9%的生理盐水溶液洗涤5~6次；
4）保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成10~20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗HIV抗体致敏醛化红细胞的制备
1）配制：配制pH为6.6~7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）洗涤：取步骤一所得醛化后的红细胞0.5mL，用生理盐水洗涤2~4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3min后弃上清液，得到红细胞悬浮于2mLPBS中；
3）酸化：加入2mL37°C的PBS/5mgTCA（鞣酸）；（注：5mg鞣酸溶于100mLPBS）；37°C水浴振荡15min；
4）洗涤：生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS中；
5）标记：加入2mL 抗HIV抗体溶液；37°C下水浴振荡60min；
6）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次，用PBS保存备用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒灵敏度高，特异性好，质量稳定，检测过程耗时短，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，能够使HIV抗体检测成为临床常规检测项目。
具体实施方式
本发明新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒主要包括：微柱凝胶卡、指示红细胞，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均包含聚丙烯酰胺或葡聚糖凝胶颗粒；所述指示红细胞是结合抗HIV抗体的正常O型Rh阴性红细胞或O型醛化红细胞。
新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒的制备方法如下：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0~6.5）×l0-4g／mL、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2~1.5）×l0-4g／mL、甘氨酸（1. 6~1.9）×l0-2g／mL、氯化钠（1. 6~1.8）×l0-3g／mL、磷酸二氢钾（2. 0~2.4）×l0-4g／mL、磷酸氢二钠（4.5~4.8）×l0-4g／mL，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6~6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20~30uL的量，分别加入到微柱凝胶卡的微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）红细胞洗涤：将O型红细胞以3000rpm离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6~8次后配制成5%红细胞；
2）醛化处理：在1）所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1~2:1进行混合；
3）洗涤：将2）醛化后的红细胞以2500rpm离心2.5min，并用0.9%的生理盐水溶液洗涤5~6次；
4）保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成10~20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
三、新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒的使用
1）将抗HIV抗体致敏醛化红细胞50μL与病人的血清25μL加入到微柱管中，于37℃下反应10~15min；
2）离心，900rpm, 2min; 1500rpm, 3min；
4结果判定标准：当血清中有被检物质时，抗原抗体反应时，凝集的红细胞在离心力的作用下不能通过凝胶而留在凝胶上层或游离在凝胶中，呈现阳性反应；而当血清中没有被检物质时，抗原抗体没有反应时，未凝集的红细胞在离心力的作用下可通过凝胶而沉积在微柱凝胶管的底部，呈现阴性反应。
本发明新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒可以具有优良的特异性、灵敏度、质量稳定，检测过程耗时短，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化等优点，是在于整个体系中各种成分的协同作用：微柱凝胶卡上排列有多个微柱管可以完成多次检测；缓冲体系可以维持微柱凝胶卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内；润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力；酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效；丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间合适的间隙。

Claims (1)

1.一种新型微柱凝胶法HIV抗体检测试剂盒及其制备方法，其特征在于：所述试剂盒包括微柱凝胶卡和指示红细胞，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均包括若干个聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒；所述指示红细胞是结合抗HIV抗体的正常O型Rh阴性红细胞或O型醛化红细胞；
所述试剂盒的制备包括以下步骤：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0~6.5）×l0-4g／mL、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2~1.5）×l0-4g／mL、甘氨酸（1. 6~1.9）×l0-2g／mL、氯化钠（1. 6~1.8）×l0-3g／mL、磷酸二氢钾（2. 0~2.4）×l0-4g／mL、磷酸氢二钠（4.5~4.8）×l0-4g／mL，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6~6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30~60nm的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20~30uL的量，分别加入到微柱凝胶卡的微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）红细胞洗涤：将O型红细胞以3000rpm离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6~8次后配制成5%红细胞；
2）醛化处理：在1）所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1~2:1进行混合；
3）洗涤：将2）醛化后的红细胞以2500rpm离心2.5min，并用0.9%的生理盐水溶液洗涤5~6次；
4）保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成10~20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗HIV抗体致敏醛化红细胞的制备
1）配制：配制pH为6.6~7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）洗涤：取步骤一所得醛化后的红细胞0.5mL，用生理盐水洗涤2~4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3min后弃上清液，得到红细胞悬浮于2mL PBS中；
3）酸化：加入2mL37°C的PBS/5mgTCA（鞣酸）；（注：5mg鞣酸溶于100mL PBS）；37°C水浴振荡15min；
4）洗涤：生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS中；
5）标记：加入2mL 抗HIV抗体溶液；37°C下水浴振荡60min；
6）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次，用PBS保存备用。
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