CN102798718A - 乙肝病毒前s1抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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吴玉水
戴振贤
张剑清
林炳为
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Abstract

本发明实施例提供一种乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒及其制备方法。所述乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒包括乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品、乙肝病毒前S1抗体包被微孔板、酶标记的抗乙肝病毒表面抗原抗体的标记结合物、化学发光底物液和浓缩洗涤液，其中包被浓度为2.5μg/mL。本发明提供乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒的检测简便、快速、灵敏、稳定及重复性好。

Description

乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物物质检测分析领域，特别涉及一种乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎是严重危害我国人民身体健康的传染病。长期以来，检测乙型肝炎病毒的血清标志物主要为乙肝“两对半”指标。但它不能完全反映HBV在患者体内的复制与传染性情况。由于其检测方法的灵敏度、特异性的限制以及HBV为逃避宿主的免疫反应常发生变异，往往导致“两对半”检测结果的误读。HBV DNA检测是HBV复制最直接的指标，但此方法对实验室条件要求严格，不易推广，特别是广大基层医疗单位还难以开展。HBV前-S1抗原与乙肝DNA的复制密切相关。HBV前S1蛋白的定量检测与HBV DNA的检测有良好的一致性，是反映HBV复制活跃的可靠指标，可以作为HBV感染、复制和乙肝患者诊断、治疗和预后的重要标志物，适合于各级医院开展。检测前S1抗原可避免由于病毒变异或其他因素造成的HBeAg假阴性的影响，协助临床医生对病情做出正确的判断，有效地指导临床抗病毒治疗。所以，前S1蛋白已成为临床检测乙型肝炎病毒感染和复制程度的又一血清标志物，可做为临床上对乙肝的病毒筛查、病情判断和抗病毒疗效监控的重要补充手段。
化学发光免疫检测技术是在酶标记和免疫反应相结合的基础上，引入化学发光物为底物，通过测定光信号来判断检测结果。其利用化学反应释放的自由能激发中间体，使其从激发态回到基态，当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析，该检测方法具有很高的灵敏度。
现有技术中虽然有将化学发光检测应用于乙肝病毒检测的技术，但现有技术中存在产品精度低和稳定性差的问题。
发明内容
本发明实施例提供一种乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒及其制备方法，本发明提供的产品检测简便、快速、灵敏、稳定及重复性好。
本发明提供的乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒，包括乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品、乙肝病毒前S1抗体包被微孔板、酶标记抗乙肝病毒表面抗原抗体的标记结合物、化学发光底物液和浓缩洗涤液，其特征在于包被浓度为2.5μg/mL。
乙肝病毒前S1抗原阴性对照品为采用10份正常人的血清混匀后制得，乙肝病毒前S1抗原阳性对照品为临床乙肝病毒前S1抗原阳性血清稀释后制得。
标记结合物为辣根过氧化物酶标记的抗乙肝病毒表面抗原抗体，稀释倍数为1∶2500。
化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液，包括底物A液和底物B液，其中底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚，底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。
浓缩洗涤液为30倍浓缩洗涤液，具体为加入浓度为1.5g/L的吐温-20和体积比为0.05％的PC300防腐剂的0.3M pH7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明提供的乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒的制备方法包括：
制备乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品；
制备乙肝病毒前S1抗体包被的包被微孔板；
制备标记结合物，所述标记结合物为酶标记的抗乙肝病毒表面抗原抗体；
制备化学发光底物液；以及
制备浓缩洗涤液；
其中，制备乙肝病毒前S1抗体包被的包被微孔板包括：用包被液将乙肝病毒前S1单克隆抗体稀释成包被浓度为2.5μg/mL，以每孔100μl加入微孔板，然后置于4℃冰箱48小时；弃去微孔板中的包被液，然后每孔加入150μl的封闭液，置于4℃冰箱封闭24小时；弃去封闭液后，置于37℃孵育箱8小时烘干。
制备乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品包括：
采用10份正常人的血清混匀后制得所述乙肝病毒前S1抗原阴性对照品；临床乙肝病毒前S1抗原阳性血清稀释后制得所述乙肝病毒前S1抗原阳性对照品。
标记结合物为通过戊二醛二步法制得的辣根过氧化物酶标记抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体的稀释液，稀释浓度为1∶2500。
化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液，包括底物A液和底物B液；底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解鲁米诺和对碘苯酚制得，其中鲁米诺浓度为1.8g/L，对碘苯酚浓度为0.2g/L；底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液稀释过氧化脲制得，其中过氧化脲的浓度为0.5g/L。
制备浓缩洗涤液包括：称取0.89克NaH2PO4·2H2O和5.56克KH2PO4·3H2O，加到100ml水中，然后加入150μl吐温-20和50μl PC300。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中：
图1为本发明乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒的制备方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合附图对本发明实施例作进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一
本实施例提供一种乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒，包括乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品、乙肝病毒前S1抗体包被微孔板、酶标记抗乙肝病毒表面抗原抗体的标记结合物、化学发光底物液和浓缩洗涤液，包被浓度为2.5μg/mL。
该乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒的使用步骤包括：
(1)用蒸馏水稀释洗涤液，混匀后使用；
(2)在包被微孔板上设阴性对照孔、阳性对照孔和待测样品孔；
(3)阴性对照孔中加入阴性对照品，阳性对照孔中加入阳性对照品，待测样品孔中加入样品，每孔100μl，37℃温育60分钟。
(4)用稀释后的洗涤液洗微孔板，洗涤5次，然后拍干。
(5)在各对照孔和样品孔中加入1∶2500稀释的辣根过氧化物酶标记抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗，100μl/孔，37℃温育60分钟。
(6)用洗涤液洗微孔板，洗涤5次，然后拍干。
(7)在各对照孔和样品孔中加入发光底物A液和B液然后混匀，50μl/孔，室温避光放置5～10分钟。
(8)用化学发光分析仪测量相对发光值。
其中，阳性阈值＝阴性对照相对发光值×2.1；当待测样品的相对发光值≥阳性阈值时，判断为阳性；当待测样品的相对发光值≤阳性阈值时，判断为阴性。
实施例二
如图1所示，图1是本发明实施例提供的一种乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒的制备方法流程图，包括：
步骤S110：制备乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品；
步骤S120：制备乙肝病毒前S1抗体包被的包被微孔板；
步骤S130：制备标记结合物，所述标记结合物为酶标记的抗乙肝病毒表面抗原抗体；
步骤S140：制备化学发光底物液；以及
步骤S150：制备浓缩洗涤液。
(一)乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品的配制
阴性对照品的配制方法是将10份正常人的血清混匀后，60℃水浴灭活1小时后分装；阳性对照品的配制方法是将临床乙肝病毒前S1抗原阳性血清适当稀释，混匀后，60℃水浴灭活1小时后分装。其中稀释液含0.05M pH7.4的PBS，50％小牛血清，2％甘油和体积比为0.1％PC300防腐剂，稀释的倍数使阳性对照品和阴性对照品的发光值比值大于10。本实施例采用人血清配置检测用阴性对照品和阳性对照品，使得检测结果更准确，更可靠。
(二)乙肝病毒前S1抗体包被微孔板的制备
微孔板为96孔的不透明聚苯乙烯微孔板。
配制0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液包被液，配制方法是称取2.2克的Na2CO3和1.0克NaHCO3溶于100ml蒸馏水中，混匀备用。
配制0.05M pH7.4PBS封闭液，配置方法是称取0.3克NaH2PO4·2H2O、1.85克KH2PO4·3H2O和1.8克氯化钠溶于200ml蒸馏水中，混匀后加入0.2克牛血清白蛋白和200μl PC300，混匀备用。
其中PC300为防腐剂，其活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)。这两种成分可以抑制细胞的生长，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长，是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等的生物防腐剂。
包被步骤包括：
(1)用以上配制的包被液将前S1单抗稀释成包被浓度为2.5μg/mL，以每孔100μl加入微孔板，然后置于4℃冰箱48小时。
(2)弃去微孔板中的包被液，然后每孔加入150μl的0.05M pH7.4PBS封闭液(含1％牛血清白蛋白和体积比为0.1％的PC300)，置于4℃冰箱封闭24小时。
(3)弃去封闭液后，置于37℃孵育箱8小时烘干。
本申请制备的包被微孔板的产品性能稳定，重复性好。
(三)酶标记抗乙肝病毒表面抗原抗体的制备
标记用酶是辣根过氧化物酶，乙肝病毒表面抗原抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。
以戊二醛二步法进行辣根过氧化物酶标记为例说明本发明的酶标记抗乙肝病毒表面抗原抗体的制备。标记方法具体包括：
(1)称取辣根过氧化物酶25mg溶于0.5毫升1.25％戊二醛溶液中(用0.1MpH6.8PBS配制)，于室温静置过夜。
(2)次日，将酶与戊二醛反应后的溶液用0.01M Ph7.4PBS充分透析。
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入以上透析好的酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7)以3000转/分钟转速离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于0.5mL的0.15M PH7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析去除铵离子后，以10,000转/分钟的转速离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。酶标记抗体的最佳使用稀释倍数是用洗涤液作1∶2500稀释(100ml浓缩洗涤液的配方是：称取0.89克NaH2PO4·2H2O和5.56克KH2PO4·3H2O，加到100ml水中，加入150μl吐温-20和50μl PC300，搅匀。使用时，用蒸馏水作30倍稀释)。
饱和硫酸铵和半饱和硫酸铵的制备包括：取800g的硫酸铵加入到1L水中，然后加热搅拌溶解后，室温静置过夜后，上清液即为饱和硫酸铵。取该上清液400毫升加20毫升1M的盐酸，再补加380毫升蒸馏水，混匀后即为半饱和硫酸铵。
(四)化学发光底物液的制备
首先配制0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液。配置方法是：称取0.61克三羟甲基氨基甲烷溶于100毫升蒸馏水中，并加入105微升浓盐酸，混匀后加入50μlPC300防腐剂，混匀备用。
底物液包括底物A液和底物B液。底物A液的配制方法是含1.8g/L鲁米诺和0.2g/L对碘苯酚，用以上配制的0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解。底物B液：含0.5g/L的过氧化脲，用以上配制的0.05M pH8.6的Tri s-HCl缓冲液做稀释液。使用时A液和B液等量混合后使用，每孔加100μl。
如果发光底物的含量不在合适的范围之内，则发出的光粒子的量不能维持在恒定平台期，会影响前后检测时间差的重复性，即造成批间和批内实验的误差扩大。本发明提供的底物发光的平台期长，灵敏度高、宽的线性动力学范围、光信号持续时间长、分析方法简便快速、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长等特点，产品临床性能优异。
(五)浓缩洗涤液的配制
以100ml浓缩洗液为例，称取0.89克NaH2PO4·2H2O和5.56克KH2PO4·3H2O，加到100ml水中，加入150μl吐温-20和50μl PC300，搅匀。使用时，用蒸馏水作30倍稀释。
通过精密度测定、稳定性试验和临床试验显示本发明提供的乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒在精密度高、稳定性强和临床检测效果优异。
(一)精密度测定
批内精密度测定方法是按实施例一所述使用方法，重复10孔检测1份精密度参考品，测定并计算其变异系数(CV)值。要求其变异系数≤15％。
批内精密度测定的发光值检测结果
  孔号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  发光值   13268   15462   13354   16658   13356   14589   15547   12657   14475   14638
计算测定结果得到批内精密度：CV＝(1254/14400)×100％＝8.7％；批内精密度符合要求。
批间精密度测定方法是按实施例一所述使用方法，作10孔平行测定精密度参考品，重复3次试验，测定并计算其变异系数(CV)值。要求其变异系数≤20％。
批间精密度测定的发光值检测结果
  孔号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  第一次实验   17475   16489   18015   16440   16047   15473   17863   16890   16981   16489
  第二次实验   16932   14983   16056   14719   15480   15280   15243   16201   15477   15013
  第三次实验   15651   14983   14706   16367   15239   15063   15647   15424   16359   15424
计算测定结果得到批间精密度：CV＝(16816-15486)/15947×100％＝8.3％；批间精密度符合要求。
(二)稳定性实验
将发明的乙肝病毒前S1抗原化学发光免疫检测试剂盒放入37℃恒温培养箱中，连续保温3天后取出，平衡至室温后，把试剂盒按按实施例一所述使用方法进行检测发光值，逐项检查其物理性能、分析灵敏度、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密度等5个性能指标。
稳定性实验的发光值检测结果
Figure BSA00000771439000081
Figure BSA00000771439000091
孔位安排如下：
A1～B1：阴性对照；C1～H1：灵敏度参考品；A2～B3：阴性参考品；C3～D4：阳性参考品；E4～F5：精密度参考品。
说明：将试剂盒放入37℃恒温培养箱中，连续保温3天后取出，平衡至室温后，把试剂盒按实施例6所述方法进行检测，逐项检查其物理性能、分析灵敏度、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密度等5个性能指标。
结果表明试剂盒的灵敏度参考品及阴、阳性参考品均符合要求，见下表：
Figure BSA00000771439000092
实验结果说明试剂盒的稳定性符合要求。
(三)临床样本检测
按按实施例一所述的使用方法检测93份临床样本的乙肝病毒前S1抗原，该临床样本经市售酶联免疫方法确认其中56份为阴性样品、37份为阳性样品。检测结果表明，发明的化学发光试剂盒与酶联免疫检测方法的乙肝病毒前S1抗原阴阳性符合率均达到100％。
93份临床样本检测乙肝病毒前S1抗原的发光值结果
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A   877   999   860   833   873   799   871   19954   51285   39723   117367   15684
  B   894   1050   874   750   887   813   888   20370   100950   69834   86394   66248
  C   911   701   1088   867   701   827   1105   181181   96713   93688   14888   184576
  D   925   1143   904   881   917   1043   919   83822   111060   11537   42719   16225
  E   819   825   719   775   635   858   813   118863   128159   25339   144615   9998
  F   837   879   735   793   648   774   831   189175   17933   14093   123014 738
  G   851   921   1194   807   789   833   695   85759   80491   75936   18755 754
  H   864   760   848   820   861   687   858   23477   118869   180526   75936 89907
孔位安排如下：
A1～H7：阴性样品N1-N56；A8～E12：阳性样本P1-P37；F12～G12：阴性对照；H12：阳性对照。
说明：按实施例一所述的使用方法检测93份临床样品。该临床样本经市售酶联免疫方法确认其中56份为阴性样品、37份为阳性样品。临床样本检测结果表明，发明的乙肝病毒前S1抗原化学发光免疫检测试剂盒与酶联免疫检测方法的阴阳性符合率均达到100％，产品性能优异。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒，包括乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品、乙肝病毒前S1抗体包被微孔板、酶标记抗乙肝病毒表面抗原抗体的标记结合物、化学发光底物液和浓缩洗涤液，其特征在于包被浓度为2.5μg/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述乙肝病毒前S1抗原阴性对照品为采用10份正常人的血清混匀后制得，所述乙肝病毒前S1抗原阳性对照品为临床乙肝病毒前S1抗原阳性血清稀释后制得。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述标记结合物为辣根过氧化物酶标记的抗乙肝病毒表面抗原抗体，稀释倍数为1∶2500。
4.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液，所述鲁米诺化学发光底物液包括底物A液和底物B液，其中所述底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚，所述底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为30倍浓缩洗涤液，所述30倍浓缩洗涤液为加入浓度为1.5g/L的吐温-20和体积比为0.05％PC300防腐剂的0.3M pH7.4的磷酸盐缓冲液。
6.一种乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括：
制备乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品；
制备乙肝病毒前S1抗体包被的包被微孔板；
制备标记结合物，所述标记结合物为酶标记的抗乙肝病毒表面抗原抗体；
制备化学发光底物液；以及
制备浓缩洗涤液；
其中，制备乙肝病毒前S1抗体包被的包被微孔板包括：用包被液将乙肝病毒前S1单克隆抗体稀释成包被浓度为2.5μg/mL，以每孔100μl加入微孔板，然后置于4℃冰箱48小时；
弃去微孔板中的包被液，然后每孔加入150μl的封闭液，置于4℃冰箱封闭24小时；
弃去封闭液后，置于37℃孵育箱8小时烘干。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，制备乙肝病毒前S1抗原阴性对照品和乙肝病毒前S1抗原阳性对照品包括：
采用10份正常人的血清混匀后制得所述乙肝病毒前S1抗原阴性对照品；
临床乙肝病毒前S1抗原阳性血清稀释后制得所述乙肝病毒前S1抗原阳性对照品。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述标记结合物为通过戊二醛二步法制得的辣根过氧化物酶标记抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体的稀释液，稀释浓度为1∶2500。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液，所述鲁米诺化学发光底物液包括底物A液和底物B液；
所述底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解鲁米诺和对碘苯酚制得，其中鲁米诺浓度为1.8g/L，对碘苯酚浓度为0.2g/L；
所述底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液稀释过氧化脲制得，其中过氧化脲的浓度为0.5g/L。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述制备浓缩洗涤液包括：称取0.89克NaH2PO4·2H2O和5.56克KH2PO4·3H2O，加到100ml水中，然后加入150μl吐温-20和50μl PC300。
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