CN104090106A - 乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种微粒子化学发光法乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法。试剂盒由测HBsAg磁微粒、测HBsAg示踪结合物、校准品、分析缓冲液、样本稀释液组成，本发明还公开了该定量测定试剂盒的制备方法，其采用的是微粒子化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的灵敏度和特异性，适合于临床乙肝的辅助诊断。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种免疫诊断技术，具体地说是一种磁微粒作为载体的乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
我国是个肝炎大国，发病人数众多，仅乙型肝炎病毒感染者就达1.2亿。约占我国总人口的10%，乙型肝炎病程迁延，如得不到及时有效的治疗，将会发展为肝硬化甚至肝癌，即人们通常所说的“乙肝发展三部曲”。有资料显示，全球每年有100万人因感染乙肝病毒而死亡，占全球疾病死亡原因的第九位，可见乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病之一。
乙型肝炎病毒传播途径：1.经血液传播：主要包括输血及血制品、注射器针头及针炙、牙科及手术器械等医疗行为，纹身、纹眉、穿耳眼、做双眼皮、刮面等具有损伤性的美容行为。2.母婴传播：指携带乙肝病毒的母亲在怀孕期、分娩期、哺乳期将乙肝病毒传播给婴儿的一种方式。表面抗原（HBsAg）阳性的母亲有40%－50%将乙肝病毒传播给婴儿，表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）双阳性的母亲有90%－100%将乙肝病毒传播给婴儿。3.性接触传播：男女性生活可通过精液、阴道分泌液传播乙肝病毒。4.密切接触传播：家庭日常生活可造成传播的情况主要有：HBsAg阳性人的创伤出血、月经血、痔疮血污染家庭环境；与HBsAg阳性人共用牙刷、口杯、毛巾和剃刀；HBsAg阳性人同乳幼儿密切接触，尤其是口喂小儿。
感染乙肝病毒后，HBsAg为首先出现的病毒标志物。从感染到血中出现HBsAg的时间间隔，与接种和感染的途径及其数量有关：如果数量大，则时间间隔短，约3周，如输入HBsAg阳性的血液，可在接种后6天检测到HBsAg；如果数量小，则间隔时间长，可达4个月，甚至在6个月以上。 一般在HBsAg出现后7周出现肝炎症状和肝功能异常，此时常常为HBsAg滴度达高峰时间。有人认为症状和肝功能异常出现的早迟和感染途径有关：经血感染65天，经口感染者98天，在血液中出现HBsAg。在自限性感染时，大多数病人的HBsAg在血中持续时间为6周，最长达20周，一般在肝炎症状出现后4周内大多消失。通常在患者血清转氨酶达高峰后12周消失，如超过6个月仍不消失，患者可能变为慢性肝炎及慢性乙肝病毒携带者。 
HBsAg无症状携带者的HBsAg持续存在血中可达数年、数十年，甚至终生。虽然无症状和体征，肝功也大多正常，但肝组织都有不同程度的损伤。因此，临床上将其视为乙肝病毒感染的一种隐匿过程，作为携带者本人及医师均不能完全忽视，要每半年至1年定期复查乙肝两对半、HBV-DNA及肝功能，随时了解各种化验检查的动态变化。
乙型肝炎病毒表面抗原的检测方法目前常用有酶联免疫法、胶体金法、化学发光法；酶联免疫法(ELISA)作为定性检测的方法，其灵敏度、特异性均较好，且经济实惠、所以是应用得最广、最多的方法。胶体金法的最突出优点是快速，及时、提高了检测的速度。不需要贵重仪器，但其特异性和灵敏度较酶联免疫法差，更适合于现场应用。化学发光法可定量检测出体内乙肝病毒感染的数量，其灵敏度高，从方法学角度和自动化程度看，化学发光法优于酶联免疫法。这些方法虽然具有很多优点，但在检测的灵敏度、特异性、稳定性等方面还有待进一步提高。全自动微粒子化学发光免疫分析是在酶免疫分析基础上结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，与其他方法相比，这种方法有许多独特的优点，首先它用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了检测灵敏度；其次由于使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。与放射免疫法相比，微粒子化学发光法除具有高灵敏度、高精确度、高可靠性等优点外，还具有如下优点：a.无放射性污染，稳定性好；b.特异性高；c.试剂可随用随取，测定方便迅速，可作为急诊检测项目。根据大量的实验结果以及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及其发展前景来看，该方法逐渐成为取代放射性免疫分析和酶免疫分析的首选。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种具有高灵敏度和特异性，适合于临床乙型肝炎病毒的辅助诊断的微粒子化学发光法表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒，其包括测HBsAg磁微粒、测HBsAg示踪结合物、校准品、分析缓冲液、样本稀释液。其特征是：所述测HBsAg磁微粒为标记有HBsAb单克隆抗体的磁性微粒子；测HBsAg示踪结合物为标记有HBsAb多克隆抗体的异鲁米诺；分析缓冲液、样本稀释液分别为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品为一低含量表面抗原的溶液和一高含量表面抗原的溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。
本发明还提供了上述乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备测HBsAg磁微粒   
将带羧基磁微粒与EDC按质量比1∶2，磁微粒与HBsAb单克隆抗体的比例为每毫克磁微粒标记20μg的单抗，在22~26℃混匀的情况下进行标记，标记时间1小时，标记后采用甘氨酸封闭多余的位点，使之浓度达到25mM，反应30分钟，洗涤三次，加入磁微粒保存液（含1%牛血清白蛋白的0.01M PBS缓冲系统），使之终浓度达到每20μL测HBsAg磁微粒中含有20μg的磁微粒标记单抗，2~8℃保存；
（2）制备测HBsAg示踪结合物      
HBsAb多克隆抗体与异鲁米诺的标记，反应体系为：戊二醛使用浓度为1.0%-2.0%，其最佳使用浓度为1.25%，HBsAb多克隆抗体与异鲁米诺的质量比为2∶1，在22~26℃反应1.5小时，用pH7.2-7.4的0.01M PBS进行透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放；最终将异鲁米诺标记多抗用示踪结合物稀释液（含20%小牛血清的0.01M PBS缓冲系统）按照1∶3000的稀释比例稀释成测HBsAg示踪结合物；
（3）制备分析缓冲液   
磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；
（4）制备样本稀释液   
磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；
（5）校准品包括校准品1和校准品2，其中校准品1为低含量表面抗原的溶液，校准品2为高含量表面抗原的溶液。
本发明的原理是利用微粒子化学发光免疫分析技术，采用双抗体夹心法定量测定人血清/血浆中乙型肝炎病毒表面抗原的含量。在磁性微粒子上共价标记HBsAb单克隆抗体，加入待测样本，第一步反应形成磁微粒标记抗体-抗原结合物，与第二步反应加入的异鲁米诺标记的HBsAb多克隆抗体，形成磁微粒标记抗体-抗原-异鲁米诺标记抗体复合物，充分洗涤后，加入激发液，催化异鲁米诺发光，相对发光强度（RLU）与血清/血浆中HBsAg含量呈正相关，根据标准曲线即可计算出样本中HBsAg的含量。
本发明试剂盒的优点是采用了微粒子化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的灵敏度和更好的特异性。
具体实施方式
本发明试剂盒采用微粒子化学发光免疫分析技术，检测血清或血浆中是否存在表面抗原。下面具体描述表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法。
一种乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒，其包括测HBsAg磁微粒、测HBsAg示踪结合物、校准品、分析缓冲液、样本稀释液。所述测HBsAg磁微粒为标记有HBsAb单克隆抗体的磁性微粒子；测HBsAg示踪结合物为标记有HBsAb多克隆抗体的异鲁米诺；分析缓冲液、样本稀释液分别为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品为一低含量表面抗原的溶液和一高含量表面抗原的溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。
本发明上述表面抗原定量测定试剂盒的制备方法，其具体步骤如下：
（1）制备测HBsAg磁微粒   
将带羧基磁微粒与EDC按质量比1∶2，磁微粒与HBsAb单克隆抗体的比例为每毫克磁微粒标记20μg的单抗，在22~26℃混匀的情况下进行标记，标记时间1小时，标记后采用甘氨酸封闭多余的位点，使之浓度达到25mM，反应30分钟，洗涤三次，加入磁微粒保存液（含1%牛血清白蛋白的0.01M PBS缓冲系统），使之终浓度达到每20μL测HBsAg磁微粒中含有20μg的磁微粒标记单抗，2~8℃保存；
（2）制备测HBsAg示踪结合物    
HBsAb多克隆抗体与异鲁米诺的标记，反应体系为：戊二醛使用浓度为1.0%-2.0%，其最佳使用浓度为1.25%，HBsAb多克隆抗体与异鲁米诺的质量比为2∶1，在22~26℃反应1.5小时，用pH7.2-7.4的0.01M PBS进行透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放；最终将异鲁米诺标记多抗用示踪结合物稀释液（含20%小牛血清的0.01M PBS缓冲系统）按照1∶3000的稀释比例稀释成测HBsAg示踪结合物；
（3）制备分析缓冲液   
磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；
（4）制备样本稀释液   
磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；
（5）校准品包括校准品1和校准品2，其中校准品1为低含量表面抗原的溶液，校准品2为高含量表面抗原的溶液。
本发明上述各种原材料的选择要求如下：
1、磁微粒标记用HBsAb单克隆抗体的选择   
首先就抗体的外观、浓度、纯度、效价进行验证，结果抗体为微带乳光的澄清液体，无肉眼可见异物，无摇不散的沉淀，用紫外吸收法检测其蛋白含量应不低于2.0mg/mL，效价应不低于标示效价且不低于1：10000，SDS-PAGE检测纯度应主带清晰，无明显杂带，研究结果表明HBsAb单克隆抗体完全可用于本发明试剂盒的制备。
2、异鲁米诺标记用HBsAb多克隆抗体的选择   
首先仍就抗体的外观、浓度、效价进行验证，结果抗体为微带乳光的澄清液体，无肉眼可见异物，无摇不散的沉淀，用紫外吸收法检测其蛋白含量应不低于2.0mg/mL，效价应不低于标示效价且不低于1：10000，研究结果表明HBsAb多克隆抗体也完全可用于本发明试剂盒的制备。
3、磁微粒的选择  
通过对磁微粒的外观，标记蛋白的比率，磁响应性，磁微粒吸附一致性等方面进行分析，经过多次分析研究，将磁微粒混匀，在灯光下观察，易分散，无聚集，无异物；将蛋白采用不同的方法进行标记，标记率应大于90%；将磁微粒置370-380特斯拉的磁铁上，观察磁微粒的聚集速度，分散均匀的磁微粒在10秒钟内完全聚集；磁微粒吸附一致性CV≤10%。研究结果表明直径为0.90-1.10μm的磁微粒，含有羧基基团，标记率最高，可用于本发明诊断试剂盒的制备。
4、异鲁米诺的选择  
将异鲁米诺用DMSO(二甲基亚砜)进行溶解，用纯化水进行稀释至1.2×10-5M的量，加入10μL异鲁米诺液体，各加入200μL激发液，测定其发光值，发光值应≥160000，经过研究，符合要求的异鲁米诺可作为发光的原料。
本发明表面抗原定量测定试剂盒检测样品中表面抗原的检测方法是：首先 取出浓缩洗液，用纯化水按照倍数进行稀释。而后取出激发A液和B液，放置全自动化学发光测定仪合适的位置。激发A液为含有4%NaOH的缓冲液，激发B液为含有0.12%H2O2的缓冲液。接着将试剂盒从冰箱中取出后，放于仪器试剂区至少混匀30分钟后方可使用，并严格按照设定的程序进行加样和温育。
具体加样方法如下：120μL血清/血浆样本、30μL分析缓冲液以及20μL测HBsAg磁微粒在37℃的条件下反应10分钟，加入100μL测HBsAg示踪结合物，37℃反应20分钟，再用稀释后的洗液洗涤3次，最终分别加入200μL激发A液和激发B液，测定发光值。样本的含量可以利用该批号试剂盒已设定的曲线，通过发光仪自动计算出来。
本发明质量控制要求是：试剂盒第一次操作，必须采用校准品进行定标，每间隔14天用校准品对试剂盒的主曲线进行修正，按照修正的主曲线对样本进行定量。
本发明试剂盒检测HBsAg国家参考品及企业内控品，检测的结果显示：该试剂盒的国家阴、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度、准确度、线性、稳定性等各项质量指标均符合国家或企业要求。阴性符合率：20份国家阴性参考品符合率20/20；阳性符合率：3份国家阳性参考品符合率3/3；最低检出限检测：adw、adr亚型的最低检出限不高于0.1IU/mL；ay亚型的最低检出限不高于0.2IU/mL；精密度：10孔检测变异系数（CV）≤15%；准确度：检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清（冻干）标准物质（证书编号：GBW09164），标准物质的实测浓度符合要求；线性：试剂盒的线性相关系数r不低于0.9900；稳定性：试剂各组分于37℃放置6天，检定结果达到标准。
本发明试剂盒由河南中医学院第三附属医院、中国人民解放军第一五三中心医院、中国人民解放军第三七一医院三家医院进行临床考核，结果：
（1）河南中医学院第三附属医院考核201例阴性样本和124例阳性样本，本发明试剂盒阴性样本检出198例，阳性样本124例全部检出。该试剂盒阴性检出率为98.51%，阳性检出率为100%。
（2）中国人民解放军第一五三中心医院考核217例阴性样本和122例阳性样本，本发明试剂盒阴性样本检出215例，阳性样本122例全部检出。该试剂盒阴性检出率为99.08%，阳性检出率为100%。
（3）中国人民解放军第三七一医院考核199例阴性样本和148例阳性样本，本发明试剂盒阴性样本199例全部检出，阳性样本148例全部检出。该试剂盒阴性检出率为100%，阳性检出率为100%。
该定量测定试剂盒总的灵敏度为100%，特异性为99.19%。
乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒（微粒子化学发光法）灵敏度为100%，特异性为99.19%，适合于临床乙肝的辅助诊断。

Claims (3)

1.一种乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒，包括
测HBsAg磁微粒：标记有HBsAb单克隆抗体的磁性微粒子；
测HBsAg示踪结合物：标记有HBsAb多克隆抗体的异鲁米诺；
校准品：一低含量表面抗原的溶液和一高含量表面抗原的溶液；
分析缓冲液：含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
样本稀释液：含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
2.一种制备权利要求1所述乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒的方法，其特征是具体步骤如下：
（1）制备测HBsAg磁微粒    将带羧基磁微粒与EDC按质量比1∶2，磁微粒与HBsAb单克隆抗体的比例为每毫克磁微粒标记20μg的单抗，在22~26℃混匀的情况下进行标记，标记时间1小时，标记后采用甘氨酸封闭多余的位点，使之浓度达到25mM，反应30分钟，洗涤三次，加入磁微粒保存液，所述磁微粒保存液为含1%牛血清白蛋白的0.01M PBS缓冲系统，使之终浓度达到每20μL测HBsAg磁微粒中含有20μg的磁微粒标记单抗，2~8℃保存；
（2）制备测HBsAg示踪结合物    HBsAb多克隆抗体与异鲁米诺的标记，反应体系为：戊二醛使用浓度为1.0%-2.0%，HBsAb多克隆抗体与异鲁米诺的质量比为2∶1，在22~26℃反应1.5小时，用pH7.2-7.4的0.01M PBS进行透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放；最终将异鲁米诺标记多抗用示踪结合物稀释液，所述示踪结合物稀释液为含20%小牛血清的0.01M PBS缓冲系统，按照1∶3000的稀释比例稀释成测HBsAg示踪结合物；
（3）制备分析缓冲液    磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；
（4）制备样本稀释液   磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；
（5）校准品包括校准品1和校准品2，其中校准品1为低含量表面抗原的溶液，校准品2为高含量表面抗原的溶液。
3.根据权利要求2所述乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中戊二醛使用浓度为1.25%。
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