CN108226498A - 一种检测甲胎蛋白异质体afp-（l1+l2）的试剂盒 - Google Patents

一种检测甲胎蛋白异质体afp-（l1+l2）的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测甲胎蛋白异质体AFP‑（L1+L2）的试剂盒，包括包被有LCA非竞争性AFP抗体的磁微粒混悬液，标记有LCA竞争性AFP抗体的酶结合物，含有LCA的样品稀释液和校准品。本发明试剂盒属于改良的双抗体夹心法，操作简单方便，省事省力，利用LCA对AFP‑L3的强吸附性，在样品稀释液中加入一定浓度的LCA，直接测定AFP‑(L1+L2)的浓度，通过作差得出AFP‑L3的含量，进而计算出AFP‑L3的浓度，较与北京热景公司提供的检测AFP‑L3的试剂盒相比，无需处理待测血清，更加方便快捷，且灵敏度高，特异性强。

Description

一种检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术，尤其是涉及一种检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒。
背景技术
肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌（HCC）起源于肝脏的上皮或间叶组织，是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤；继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。原发性肝癌死亡率在消化系统恶性肿瘤中位列第2,我国每年死于肝癌的患者约12万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。目前对于肝癌的诊治方法较少，最重要的是早期发现，早期发现早期手术治疗就可以取得良好的疗效，但是由于肝癌的早期诊断仍然困难，不少患者发现时已是晚期，丧失了最佳治疗时机。目前原发性肝癌的早期诊断指标仍以血清甲胎蛋白（AFP）的测定为主，采用放射免疫法测定持续血清AFP≥400μg/L，并能排除妊娠、活动性肝病等即可考虑肝癌的诊断。但是有相当部分的患者在肝癌早期时AFP 并不升高，且有30%～40% 的患者始终无 AFP的明显升高，即AFP检测为阴性；同时还有一些患者由于多种原因引起肝细胞损伤时也会出现AFP 的升高，从而出现诊断偏差。因此我们需要发现更多的血清学标志物帮助肝癌的早期发现。
AFP是一种糖蛋白，正常情况下，来自胚胎的肝细胞和卵黄囊，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失，所以正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20ug/L。甲胎蛋白于1956年发现，上世纪60年代末应用于临床，70年代用于自然人群与肝癌高危人群普查，至今仍被公认为是优秀的肝癌诊断标记物而广泛使用。一般认为，AFP是HCC相对特异的肿瘤标志物，AFP持续升高是发生HCC的危险因素。AFP的临床价值在于：a、是目前较好的早期诊断方法，可在症状出现前6个月以上作出诊断，能与影像相互补充。b、为反映病情动态变化和评估疗效的敏感指标。c、可检查出根治切除术后亚临床期复发与转移。
《原发性肝癌诊疗规范（2011版）》：对于AFP≥400ug/L超过1个月，或≥200μg/L持续2个月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活动性肝病，应该高度怀疑肝癌。中国抗癌协会肝癌专委会2001 年提出了原发性肝癌的临床与分期标准，AFP 对原发性肝癌的诊断值定为400ug/ L。
近年来有报道指出,以上述标准诊断原发性肝癌,敏感性为39-64%, 特异性为76-91%, 对早期肝癌具有9-32%阳性预测的有近1/3的HCC患者AFP为阴性（敏感性不足），同时20-50%的慢性肝炎、肝硬化也合成AFP（特异性不足），这给HCC的诊断带来了困难。
由于AFP是糖蛋白，其蛋白上含有不同糖链，依据不同糖链与小扁豆凝集素LCA的亲和力，可将总AFP分为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，其中：AFP-L1来源于良性肝病细胞（LCA非结合型）；AFP-L2来源于孕妇（LCA弱结合型）；AFP-L3来源于癌变肝细胞（LCA强结合型）。分别测定样本中总AFP浓度及其异质体AFP-L3的浓度，计算AFP-L3占总AFP比率（AFP-L3/AFP），以10%为Cutoff确认结果，AFP-L3%≥10%为阳性，AFP-L3%＜10%为阴性。AFP-L3已在1999年第四届全国肝癌学术会议上获得通过，确定为原发性肝癌临床诊断标准的肝癌标记物之一。认为是比单纯的AFP更为特异的原发性肝癌指标。国内外研究结果都一致表明：慢性肝病血清 AFP-L3百分比很低, 而原发性肝癌很高, 表明AFP-L3测定非常有助于良、恶性肝病的鉴别诊断，如在早期检测AFP的同时也检测AFP异质体AFP-L3，就可使诊断的特异性明显提高。
目前检测AFP-L3的试剂盒主要有北京热景公司提供，根据小扁豆凝集素LCA对AFP-L3吸附性强的原理，将样本先进行甲胎蛋白异质体AFP-L3的亲和吸附，离心管处理后得到AFP-L3，而样本经离心、清洗液稀释、离心去保护液、加样、清洗离心、换离心柱洗脱离心等步骤提取AFP-L3的过程比较繁琐，耗时，导致检测方法非常麻烦。由于总AFP包括AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，如果能将AFP-L1、AFP-L2的浓度检测出来，则通过计算即可很方便的得到AFP-L3的浓度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测更加快速、方便的试剂盒，可将甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的浓度高灵敏度的检测出来，进而通过作差法间接得到甲胎蛋白异质体AFP-L3的浓度。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒，包括包被有LCA非竞争性AFP抗体的磁微粒混悬液，标记有LCA竞争性AFP抗体的酶结合物，含有LCA的样品稀释液，校准品，发光底物。
所述磁微粒混悬液的制备方法为：将粒径1.08um的磁微粒原液充分混匀、洗涤后，加入EDC和NHS活化剂，混匀震荡、洗涤后，加入LCA非竞争性AFP抗体，混匀震荡，采用乙醇胺终止反应，最后用封闭液封闭，2-8℃保存待用。
所述酶结合物的制备方法为：将含有TAPS和NaCl的纯化水作为缓冲液，加入1/1000的AFP-L3竞争性酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白（BSA）混合均匀，2-8℃保存待用。
所述样品稀释液的制备方法为：在含有Tris和乙二胺四乙酸二钠的纯化水中加入牛血清白蛋白混合均匀后，再加入体积百分数14%的LCA混合后2-8℃保存待用。
所述校准品选用pH7.4的缓冲液。
本发明试剂盒使用时，首先加入样本25uL，样品稀释液50uL，磁微粒混悬液20uL，混合均匀后37℃条件下反应15min后洗涤，然后加入100uL酶结合物，37℃条件下反应17min后洗涤，最后加入100uL发光底物，避光1分钟内测发光值，通过发光值拟合出AFP、AFP-(L1+L2)的浓度，进而计算出AFP-L3的浓度。
AFP-L3浓度的计算方法：
根据化学发光法绘制的标准曲线，按照公式 C1=C2-C3，首先求出AFP-L3的含量；式中C3为对照标准曲线求得的AFP-(L1+L2)的含量（mg/mL）；C2为对照标准曲线求得的AFP的含量（mg/mL）；C1为AFP-L3的含量。
然后根据公式AFP-L3（%）= C1/C2，即可求得AFP-L3的浓度。
化学发光标准曲线的绘制方法为：
首先取6个不同浓度梯度的校准品，如浓度可设定为（0、7、50、105、580、1140）ng/mL，重复测两次不同浓度梯度的校准品的发光值，求均值，以浓度为X轴，发光值以Lg10值为Y轴，（Lin-Log）四参数拟合。
本发明试剂盒属于改良的双抗体夹心法，操作简单方便，省事省力，利用LCA对AFP-L3的强吸附性，在样品稀释液中加入一定浓度的LCA，直接测定AFP-(L1+L2)的浓度，通过作差得出AFP-L3的含量，进而计算出AFP-L3的浓度，较与北京热景公司提供的检测AFP-L3的试剂盒相比，无需处理待测血清，更加方便快捷，且灵敏度高，特异性强。
附图说明
图1、图2、图3分别是本发明试剂盒中试第一批、第二批、第三批的HOOK检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释和说明。
实施例1 制备AFP-（L1+L2）检测试剂盒
1、制备磁微粒混悬液：将粒径1.08um的磁微粒原液（磁微粒通常都是保存在基液中，时间长时会产生沉淀）充分混匀、用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤干净后，加入30mg/mL的EDC 40uL和30mg/mL 的NHS 40uL（活化剂），混匀震荡1h，再次用PBS洗涤干净后，加入LCA非竞争性AFP抗体100 uL，混匀震荡2h，采用乙醇胺终止反应，最后用含有2%BSA的PBS封闭液封闭，2-8℃保存待用。
2、制备酶结合物：将含有3g TAPS和5g NaCl的纯化水1000mL作为酶结合物缓冲液，将AFP-L3（与LCA）竞争性酶标抗体按体积比0.1%加入酶结合物缓冲液中，然后再加入牛血清白蛋白（BSA）20g混合均匀，2-8℃保存待用；其中LCA竞争性酶标抗体筛选方法为：空白组样品稀释液中不加LCA，实验组样品稀释液中加入LCA，若是LCA竞争性酶标抗体则实验组发光值比空白组发光值降低，酶标抗体数量为300粒。
3、制备样品稀释液：取1000mL纯化水，加入Tris 10g，乙二胺四乙酸二钠 15g，牛血清白蛋白（BSA）20g混合均匀后，再加入体积比14%的LCA混合后2-8℃保存待用。
4、校准品选用pH7.4的缓冲液，添加1%的BSA保护蛋白。
实施例2 本发明试剂盒的灵敏度和特异性测定
取肝癌阳性样本200例，采用全自动发光测定仪（AutoLumo A2000Plus），设定反应模式为：样品稀释液50uL，校准品和样本各25uL，磁微粒混悬液20uL，37℃15min后洗涤，100uL酶结合物37℃17min后洗涤，加入100uL发光底物（鲁米诺＋H2O2），避光1分钟内测发光值。
本发明试剂盒检测、计算后得出的AFP-L3的浓度值与北京热景公司生产的甲胎蛋白异质体AFP-L3亲和吸附离心管（国食药监械(准)字2014第3401646号）处理后样本的结果进行对比，结果如下表1：
表1
从表1结果可以看出，本发明试剂盒的灵敏度可达98.36%，特异性达94.12%，总符合率为98.00%。
样品稀释液中加入不同体积比的LCA，甲胎蛋白AFP的成分含量测定结果见下表2，AFP-L3%含量见下表3：
表2
表3
从表2、表3结果可以看出，热景管处理后样本的AFP-L3%约为15%，通过在样稀中加入一定浓度的LCA来看，加入不同浓度的LCA对检测结果有一定的影响，样稀中加入3.5%LCA检测的AFP-L3%与热景管处理的AFP-L3%相差很大，样稀中加入14%LCA与热景管处理的AFP-L3%最为相近。
实施例3 本发明试剂盒的性能检测
1、灵敏度检测
LoB（配方为纯化水1000mL、NaH2PO4 0.2g 、Na2HPO4 3.2g、BSA 10g、MgSO4 1g、10%NaN3 2mL），准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；LoD（校准品S3以LoB为稀释液稀释），准备5份浓度范围为1-4倍LOB的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；FS：采用LoD实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、SD和CV%，最接近20%的浓度为功能灵敏度；灵敏度检测结果见下表4。
表4
从表4检测结果可以看出：中试第1批试剂盒能够准确检测出AFP-(L1+L2)的最低浓度为0.60ng/mL；中试第2批试剂盒能够准确检测出AFP-(L1+L2)的最低浓度为0.58ng/mL；中试第3批试剂盒能够准确检测出AFP-(L1+L2)的最低浓度为0.54ng/mL。可以看出本发明试剂盒的灵敏度完全能够满足临床检测需求。
2、特异性检测
2.1 内源性（血红蛋白、胆红素）干扰
准备高低值样本各一份，高值浓度为100ng/mL，低值浓度为25ng/mL血红蛋白分别用高值和低值样本配制（100、50、20、10、1）mg/dL五个浓度梯度；胆红素需先溶到二甲基甲砜（DMSO）中，分别用高值和低值样本配制（60、50、40、20、10）mg/dL五个浓度梯度，并做DMSO对照实验，每个浓度分别重复三次一天内完成考核三批；自身抗体（RF、ANA）干扰重复两次考核一批；结果见下表5、表6。
表5 血红蛋白干扰
由表5血红蛋白干扰检测结果，可以看出血红蛋白浓度50mg/dL以下，干扰<10%。
表6胆红素干扰
由表6胆红素干扰检测结果可以看出，本发明试剂盒检测胆红素浓度50mg/dL以下，干扰<10%。
2.2 类风湿性因子和自身抗体的干扰
考核类风湿性因子和自身抗体对本发明试剂盒的干扰，结果见下表7、表8。
表7类风湿性因子干扰
表8 自身抗体干扰
由表7、表8考核结果可以看出，RF、ANA对本发明试剂盒检测无干扰现象。
2.3 检验本发明试剂盒的 HOOK风险
抗原高值梯度稀释，抗原高值浓度为77万ng/mL，稀释11个梯度，稀释的最小浓度要在校准品上限浓度以下，每个梯度重复两次考核三批，结果如图1~3所示，可以看出，理论浓度到约12000 ng/mL时无HOOK风险。
实施例4 本发明试剂盒的临床验证
为了判断本发明试剂盒检测肝癌与临床上肝癌患者检测的符合率，取来自A06医院血清肝癌样本352例，正常人血清305例，肝硬化血清321例，肝炎血清289例，分别用本发明试剂盒与热景处理AFP试剂盒进行检测，检测结果见下表9。
表9
验证结果表明，本发明试剂盒对于原发性肝癌的符合率高达93%，肝硬化阳性率为12%，肝炎阳性率10%，说明本发明试剂盒可以突出对肝癌的鉴别诊断。
注：本申请中所用的全自动磁微粒化学发光仪（AutoLumo A2000Plus）由郑州安图生物工程股份有限公司提供。

Claims (5)

1.一种检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒，其特征在于：包括包被有LCA非竞争性AFP抗体的磁微粒混悬液，标记有LCA竞争性AFP抗体的酶结合物，含有LCA的样品稀释液和校准品。
2.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒，其特征在于：所述磁微粒混悬液的制备方法为：将粒径1.08um的磁微粒原液充分混匀、洗涤后，加入EDC和NHS活化剂，混匀震荡、洗涤后，加入LCA非竞争性AFP抗体，混匀震荡，采用乙醇胺终止反应，最后用封闭液封闭，2-8℃保存待用。
3.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒，其特征在于：所述酶结合物的制备方法为：将含有TAPS和NaCl的纯化水作为缓冲液，加入1/1000的AFP-L3竞争性酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，2-8℃保存待用。
4.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液的制备方法为：在含有Tris和乙二胺四乙酸二钠的纯化水中加入牛血清白蛋白混合均匀后，再加入体积百分数14%的LCA混合后2-8℃保存待用。
5.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-（L1+L2）的试剂盒，其特征在于：所述校准品选用pH7.4的缓冲液。
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