CN109254158A - 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒/试剂板 - Google Patents

一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒/试剂板 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测甲胎蛋白异质体AFP‑L3含量的试剂盒，包括生物素LCA，包被有甲胎蛋白抗体的磁微粒混悬液或包被板，辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体，辣根过氧化物酶标记/吖啶酯标记的链霉素及校准品。本发明试剂盒操作简单快捷，利用甲胎蛋白抗体磁微粒混悬液或甲胎蛋白抗体包被板对总AFP特异性结合，以及生物素化的LCA对AFP‑L3的强吸附性，形成夹心复合物，通过链霉素和生物素高亲和力放大效应，直接检测AFP‑L3的浓度。较与北京热景公司提供的检测AFP‑L3的试剂盒相比，无需多重繁琐步骤处理血清提取AFP‑L3，避免了提取AFP‑L3的繁琐步骤，节省时了间，检测更加方便快捷，且临床灵敏度、特异性较高，满足了临床检测需求。

Description

一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒/试剂板
技术领域
本发明涉及体外诊断技术，尤其是涉及一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒/试剂板。
背景技术
肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类，是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤。原发性肝癌起源于肝脏的上皮或间叶组织；继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏，一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移；肝癌病情发展迅速，致死亡率较高，所以对肝癌的早期诊断迫在眉睫。
目前肝癌的早期诊断方法为肝癌血清标志物检测：方法①是对血清甲胎蛋白（AFP）测定，该方法对诊断本病有相对的特异性，当免疫法测定持续血清中AFP≥400μg/L，并能排除妊娠、活动性肝病等，即可考虑肝癌的诊断。但是临床上约30%的肝癌患者AFP为阴性，如同时检测AFP异质体，则可使阳性率明显提高。方法②是血液酶学及其他肿瘤标志物测定，检查肝癌患者血清中γ-谷氨酰转肽酶及其同功酶、异常凝血酶原、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶，同功酶可高于正常，但缺乏特异性。
甲胎蛋白AFP是糖蛋白，其蛋白上含有不同糖链，依据不同糖链与小扁豆凝集素（LCA）的亲和力，可将总AFP分为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，其中：AFP-L1来源于良性肝病细胞（LCA非结合型）；AFP-L2来源于孕妇（LCA弱结合型）；AFP-L3来源于癌变肝细胞（LCA强结合型）。LCA是凝集素的一种，凝集素(Lectin)是指一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球(含血型物质)，故名凝集素。最常用的为植物凝集素，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A(Con convalina，ConA)、麦胚素(Wheat germ agglutinin,WGA)、花生凝集素(Peanut agglutinin，PNA)、大豆凝集素(Soybean agglutinin，SBA)、小扁豆凝集素(Lens cuinaris agglutinin，LCA)等。LCA结合的AFP糖链（AFP-L3）中具有与天门冬酞胺(Asn)连接的N一乙酞基葡萄糖残基,在此残基上结合有一个岩藻糖残基。
目前检测AFP-L3的试剂盒主要由北京热景公司提供，检测时，需要先将样本进行处理以提取甲胎蛋白异质体AFP-L3，而样本的处理过程包括离心、清洗液稀释、离心去保护液、加样、清洗离心、换离心柱洗脱离心等多个步骤，过程比较繁琐、耗时，导致检测方法非常麻烦。
若能利用LCA对AFP-L3的强吸附特点构建检测AFP-L3试剂盒，其临床意义可体现在以下几点：①在原发性肝癌（PLC）的辅助预测、诊断、疗效评估、预后判断及复发检测中均有重要应用价值。②对于低水平AFP人群，AFP-L3可辅助预测、诊断PLC。③有助于区分良恶性肝病的鉴别诊断。④可作为独立标志物监测PLC的预后及复发。若将其用于肝癌的早期诊断，预期可比影像学提早3-28个月发现肝癌，也就能为患者提供更多的治疗机会。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3更加快速、方便的试剂盒。
本发明所述的一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒，包括生物素LCA，包被有甲胎蛋白抗体的磁微粒混悬液或包被板，辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体，辣根过氧化物酶标记/吖啶酯标记的链霉素及校准品。
所述包被有甲胎蛋白抗体的磁微粒混悬液的制备方法为：加入EDC和NHS活化剂，混匀震荡、洗涤后，加入LCA非竞争性AFP抗体，混匀震荡；采用乙醇胺终止反应，最后用封闭液封闭，2~8℃保存待用。
所述包被有甲胎蛋白抗体的包被板的制备方法为：将LCA非竞争性AFP抗体按照5μg/ml投入PB/CB中，静置2~8℃条件下过夜，清洗后加入保护液室温封保4~6小时，甩干、干燥后2~8℃密封保存待用。
所述生物素LCA的配制方法为：用0.05~0.1mol Tris/TAPS/MOPS/MES/磷酸盐，0.15~0.2mol NaCl配制成pH=7.0~7.2的稀释用缓冲液，将-20℃保存的生物素化LCA原液稀释100倍后，2-8℃保存待用。
所述辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体的配制方法为：按照1/1500~1/2000将辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体置于牛血清蛋白和磷酸盐缓冲液中，2-8℃保存待用；其中的磷酸盐缓冲液中含有0.1 %体积的Proclin300或NaN3或MIT。
所述辣根过氧化物酶标记/吖啶酯标记的链霉素的配制方法为：将含有NaCl和TAPS、Tris、MOPS、MES、磷酸盐中任一组分的纯化水作为缓冲液，加入1/1000~1/1500的链霉素-HRP或吖啶酯标记的链霉素，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，2-8℃保存待用。
其中的辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体和辣根过氧化物酶标记/吖啶酯标记的链霉素可采用市售产品，或采用郑州伊美诺生物技术有限公司制备好的成品。
本发明试剂盒操作简单快捷，利用甲胎蛋白抗体磁微粒混悬液或甲胎蛋白抗体包被板对总AFP特异性结合，以及生物素化的LCA对AFP-L3的强吸附性，形成夹心复合物，通过链霉素和生物素高亲和力放大效应，直接检测AFP-L3的浓度。较与北京热景公司提供的检测AFP-L3的试剂盒相比，无需多重繁琐步骤处理血清提取AFP-L3，避免了提取AFP-L3的繁琐步骤，节省时了间，检测更加方便快捷，且临床灵敏度、特异性较高，满足了临床检测需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释和说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的试剂和仪器为本领域的市售产品，本发明采用的试验方法为本领域常规方法。
实施例1 制备磁微粒结构的AFP-L3含量检测试剂盒
1、配制生物素LCA溶液
取0.05~0.1mol Tris，0.15~0.2mol NaCl配制成缓冲液（pH=7.0~7.2），然后将-20℃保存的生物素LCA原液按1:100的体积比添加到缓冲液中， 2~8℃保存待用。
2、制备磁微粒混悬液（AFP-MB）：
2.1 将粒径1.03~1.25μm的磁微粒原液充分混匀；
2.2取20~40μL磁珠原液加入到300~500μL PBS缓冲液，重复洗涤3次；
2.3 加入25mg/mL EDC 30~60 μL和25mg/mL NHS 30~60 μL 混匀震荡1~1.5小时；
2.4 采用100~200μL 醋酸缓冲液重复洗涤4次；
2.5加入20~30μL LCA非竞争性AFP抗体混匀震荡3小时；
2.6 加入200~300μL 2mol/L乙醇胺终止反应0.5~1小时；
2.7 弃上清后，加入300~500μL封保液，洗涤3次；
2.8 加入封保液3mL，2~8℃备用 。
其中所用的封保液（配剂量1L）的配制方法为：首先添加Tris 7~9g至1L纯化水中，用6mol HCl 将溶液pH调至7作为缓冲液；再向缓冲液中添加BSA/Casein15~20g、BB2#/ADP0.5~1.5g、Proclin300/NaN3/MIT 1~3mL、丙三醇120~150mL、Bro2~2.5g，混合均匀即得封保液。
3、制备辣根过氧化物酶或吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体
取郑州伊美诺生物技术有限公司制备的辣根过氧化物酶或吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体原液，按照1/1500~1/2000的体积比将其置于牛血清蛋白和磷酸盐缓冲液中，2-8℃保存待用；其中的磷酸盐缓冲液中含有0.1 %体积的Proclin300或NaN3或MIT。
4、制备辣根过氧化物酶或吖啶酯标记的链霉素
取郑州伊美诺生物技术有限公司制备的辣根过氧化物酶标记的链霉素（链霉素-HRP）或吖啶酯标记的链霉素原液，将含有NaCl和TAPS、Tris、MOPS、MES、磷酸盐中任一组分的纯化水作为缓冲液，加入1/1000~1/1500的链霉素-HRP或吖啶酯标记的链霉素原液，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，2-8℃保存待用。
5、配制发光底物
若采用辣根过氧化物酶系统，则发光底物用鲁米诺+H2O2；若采用吖啶酯系统，则发光底物用NaOH+H2O2。
6、配制校准品
将含有NaCl和TAPS、Tris、MOPS、MES、磷酸盐中任一组分的纯化水作为缓冲液，加入10~20%质量的BSA/小牛血清蛋白/Casein，0.1~0.2 %体积的Proclin300或NaN3或MIT作为校准品稀释液，投入郑州伊美诺生物技术有限公司制备的AFP高值抗原，配制成浓度为0、6、45、100、600、1200ng/mL的六点校准品。
实施例2 制备板式结构的AFP-L3含量检测试剂盒
1、配制生物素LCA溶液
同实施例1。
2、制备甲胎蛋白抗体包被板
2.1 取甲胎蛋白抗体，用PB/CB溶液配制抗体浓度为5μg/mL，作为包被液；
2.2 96微孔板中各加入100μL包被液，2-8℃条件下静置过夜；
2.3 甩干后用清洗液清洗2~3遍，拍干；
2.4 加入保护液150~200μL/孔，室温静置4~6小时；
2.5 再次甩干并进行干燥过夜后，2~8℃密封保存待用。
其中所用的保护液（配剂量1L）的配制方法为：首先添加NaCl 6~9g、KCl 0.1~0.5g、KH2PO4 0.1~0.5g、K2HPO4 2~3.5g至1L纯化水中混匀作为缓冲液；再向缓冲液中添加BSA/Casein15~20g、蔗糖/葡萄糖20~30g、Bro 0.5~1.5g，混合均匀即得保护液。
3、制备辣根过氧化物酶或吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体
同实施例1。
4、制备辣根过氧化物酶或吖啶酯标记的链霉素
同实施例1。
5、配制发光底物
同实施例1。
6、配制校准品
同实施例1。
实施例3 本发明试剂盒的检测方法
1、实施例1试剂盒的检测方法
样本使用前先离心处理（10000r,5min），取上清使用。
全自动磁微粒化学发光仪抽取样本加入到盛装有磁微粒混悬液的试剂槽中进行反应，然后加入稀释后的生物素LCA溶液进行反应，反应过后，采用清洗液（市售产品）洗去未结合的生物素LCA；加入辣根过氧化物酶标记的链霉素进行反应，最后再加入发光底物（鲁米诺+H2O2各50μL），检测发光值，回算浓度即为AFP-L3的浓度C1（仪器直读）。
全自动磁微粒化学发光仪抽取样本加入到盛装有磁微粒混悬液的试剂槽中进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白抗体溶液进行反应，反应过后，采用清洗液（市售产品）洗去未结合的辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白抗体，最后再加入发光底物（鲁米诺+H2O2各50μL），检测发光值，回算浓度即为AFP的浓度C（仪器直读）。最终数据由Excel表格导出，其AFP-L3%=C1*100%/C。
注：本申请中所用的全自动磁微粒化学发光仪（AutoLumo A2000Plus）由郑州安图生物工程股份有限公司提供。
若采用吖啶酯系统，只需将发光底物替换为NaOH+H2O2即可。
2、实施例2试剂盒的检测方法
样本使用前先离心处理（10000r,5min），取上清使用。
在甲胎蛋白抗体包被板96孔板上，校准品和样本需复孔添加（25μL/孔），在其中一个样本孔中加入100μLAFP-HRP（最终发光值回算浓度为C2）,另外一个样本孔中加入100μL生物素LCA和100μL链霉素-HRP（最终发光值回算浓度为C3） 37℃水浴锅温育1h，洗板机清洗5遍，加入发光底物100μL（鲁米诺+H2O2各50μL）测发光值。最终数据Excel表格导出，用安图拟合工具软件，根据校准品浓度值和发光值拟合校准曲线回算各样本浓度值，计算AFP-L3%=C3*100%/C2。
注：本申请中所用的全自动洗板机（Autobio iWO），发光仪（LUMO）由郑州安图生物工程股份有限公司提供。
实施例4 本发明试剂盒的临床验证
1、灵敏度检测
LoB，准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；LoD，准备5份浓度范围为1-4倍LOB的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；FS：采用LoD实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、SD和CV%，最接近20%的浓度为功能灵敏度。
从下表1可以看出，第一批能够准确检测出AFP-L3的浓度是0.48ng/mL，第二批能够准确检出AFP-L3的浓度是0.52ng/mL，第三批能够准确检出AFP-L3的浓度是0.28ng/mL，均满足要求。
表1
2、特异性检测
为了验证一些抗癌药物的干扰，收集AFP高、低值大样样本各一例，参考罗氏、雅培、贝克曼、西门子等厂家做过的相关肿瘤项目的药物干扰实验的浓度，用本发明实施例1试剂盒进行检测，设定允许偏差为10%。检测数据详见下表2。
表2
从表2中数据可看出，本次共考核14种药物，其中干扰超过±10%的2种，其余均小于±10%。干扰率超过±10%的药物有：2.5mg/ml注射用头孢西丁钠、 0.1mg/ml环孢素软胶囊。
实施例5 本发明试剂盒的临床验证
为了判断本发明试剂盒检测肝癌与临床上肝癌患者检测的符合率，取来自A06医院血清肝癌样本483例，正常人血清285例，肝硬化血清306例，肝炎血清271例，分别用本发明实施例1试剂盒与标杆热景试剂盒进行检测，检测结果见下表1。
验证结果表明，本发明试剂盒对于原发性肝癌的符合率高达95%，肝硬化阳性率为32%，肝炎阳性率10%，说明本发明试剂盒可以突出对肝癌的鉴别诊断，很好的区分良恶性肝病，具有较好的临床实用性。

Claims (6)

1.一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒，其特征在于：包括生物素LCA，包被有甲胎蛋白抗体的磁微粒混悬液或包被板，辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体，辣根过氧化物酶标记/吖啶酯标记的链霉素及校准品。
2.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒，其特征在于：所述包被有甲胎蛋白抗体的磁微粒混悬液的制备方法为：
将粒径1.03~1.25μm的磁微粒原液充分混匀、洗涤后，加入EDC和NHS活化剂，混匀震荡、洗涤后，加入LCA非竞争性AFP抗体，混匀震荡；采用乙醇胺终止反应，最后用封闭液封闭，2~8℃保存待用。
3.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒，其特征在于：所述包被有甲胎蛋白抗体的包被板的制备方法为：
将LCA非竞争性AFP抗体按照5μg/ml投入PB/CB中，静置2~8℃条件下过夜，清洗后加入保护液室温封保4~6小时，甩干、干燥后2~8℃密封保存待用。
4.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒，其特征在于：所述生物素LCA的配制方法为：用0.05~0.1mol Tris/TAPS/MOPS/MES/磷酸盐，0.15~0.2molNaCl配制成pH=7.0~7.2的稀释用缓冲液，将-20℃保存的生物素化LCA原液稀释100倍后，2-8℃保存待用。
5.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体的配制方法为：按照1/1500~1/2000将辣根过氧化物酶/吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体置于牛血清蛋白和磷酸盐缓冲液中，2-8℃保存待用；其中的磷酸盐缓冲液中含有0.1 %体积的Proclin300或NaN3或MIT。
6.根据权利要求1所述的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记/吖啶酯标记的链霉素的配制方法为：将含有NaCl和TAPS、Tris、MOPS、MES、磷酸盐中任一组分的纯化水作为缓冲液，加入1/1000~1/1500的链霉素-HRP或吖啶酯标记的链霉素，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，2-8℃保存待用。
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