CN112255407B - 一种新型的血清甲胎蛋白异质体3测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种新型的血清甲胎蛋白异质体3测定试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种甲胎蛋白异质体3（AFP‑L3）测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：哌嗪‑1,4‑二乙磺酸(PIPES)缓冲液、NaCl、表面活性剂、助悬剂、防腐剂。试剂R2：哌嗪‑1,4‑二乙磺酸(PIPES)缓冲液、羊抗人AFP‑L3抗体包被胶乳颗粒、羊抗人AFP‑L3抗体包被磁性纳米颗粒、助悬剂、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒可以有效替代化学发光免疫分析仪试剂盒，是一种新型稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒，便于项目在临床的开展和应用。

Description

一种新型的血清甲胎蛋白异质体3测定试剂盒及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种甲胎蛋白异质体3测定试剂盒，还涉及所述甲胎蛋白异质体3测定试剂盒制备方法和应用。
背景技术
原发性肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食道癌而居第三位。我国是乙肝大国，大约有1.2亿例乙肝病毒携带者，每年有13万患者死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。与其他肿瘤普查一样，肝癌防治主要在于“三早”，即早期发现、早期诊断和早期治疗。早期肝癌，如得到科学治疗，5年生存率在50-70％以上，不少患者可以长期存活。中晚期肝癌通常伴有肝内外的转移，手术无法切除，药物治疗也难有显效，手术并发症多，疗效差，生存期短，一般发病后生存时间仅为6个月。临床肝癌治疗困难的最主要原因是临床确诊时已近晚期。因此对于肝癌，在亚临床阶段即可得出诊断非常重要。甲胎蛋白(AFP)已经被广泛应用于临床诊断，但是HCC和肝病患者血清中AFP均有升高，致使对AFP检测结果的解释产生混淆。从临床经验角度观察，AFP特异性不足限制了HCC早期诊断的价值。其中AFP的异质体AFP-L3是肝癌细胞所特有，可以作为检测HCC的一个新的肿瘤标志物。
AFP-L3临床意义：
（1）AFP-L3有助于鉴别AFP阳性的良、恶性肝病：甲胎蛋白异质体AFP-L3只由肝癌细胞分泌产生，因此检测甲胎蛋白异质体比率，可有效鉴别良、恶性肝病。
（2）AFP-L3有助于预警肝癌发生：在影像学检查尚未发现肝癌特征性占位病变时，相比较影像学技术，AFP-L3可以提前9-12个月被检测出，FDA报道有21个月预警的，对患者进行AFP-L3检测可以早期预警肝癌发生。如果患者血清中AFP-L3占AFP比例超过10%，即可定为阳性，提示肝癌的发生率大于95%。AFP-L3占总AFP的比例越高提示肿瘤的恶性程度越高。
目前检测甲胎蛋白异质体3的方法主要是双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)，该方法准确性和灵敏度高，但是仪器设备昂贵，试剂保存不方便，价格高。胶乳免疫比浊法法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现在国内并没有出现AFP-L3生化试剂盒，仅有AFP试剂盒。AFP-L3生化试剂盒研发困难，样本中含量低，反应不灵敏，本发明针对甲胎蛋白异质体3试进行剂盒的研发以满足临床检测以及化学分析的要求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种甲胎蛋白异质体3测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种甲胎蛋白异质体3测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
试剂R1中含有以下成分：
缓冲液 20-80mmol/L；
NaCl 9g/L；
助悬剂 10-40g/L；
表面活性剂 0.1%-2%；
防腐剂 0.5-1 ml /L。
试剂R2中含有以下成分：
缓冲液 20-80mmol/L；
羊抗人AFP-L3抗体包被胶乳颗粒 10-35mg/L；
羊抗人AFP-L3抗体包被磁性纳米颗粒 10-35mg/L；
表面活性剂 0.1%-2%；
助悬剂 10-40g/L；
防腐剂 0.5-1 ml /L。
其中所述百分比为体积比。
优选地，所述试剂R1的pH 为7.0-7.5。
优选地，所述试剂R2 的pH为6.5-7.5。
优选地，所述试剂 R1 和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100、聚氧乙烯烷基醚GLAURIN中的一种或多种。更优选地，表面活性剂为二乙二醇单月桂酸酯GLAURIN。
优选地，所述试剂R1和R2试剂中的助悬剂为牛血清白蛋白、海藻糖、丙三醇和聚乙二醇6000中的一种或多种。更优选地，助悬剂由牛血清白蛋白、海藻糖和聚乙二醇6000组成，质量比为1:1:1。
优选地，所述试剂R1 和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
上述所述的甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：一、羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被的磁性纳米颗粒的制备方法：取适量300nm修饰的聚乙二醇包覆的磁性纳米颗粒，加入到10ml缓冲液中，使颗粒终浓度为1.0% ；然后加入适量羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体、1ml mmol/L的16-巯基十六烷-1-醇溶液，室温下混合搅拌2小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，10000 rpm离心30分钟，去除上清，所得沉淀即为封闭完成的羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被的磁性纳米颗粒。二、羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒的制备方法：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0% ；然后加入适量羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基丁二酰亚胺，室温下混合搅拌3小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，12000 rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒；再按照比例加入其它物质溶解，制成甲胎蛋白异质体3测定试剂盒；所述的羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒为两种不同粒径大小的颗粒，分别为： 100nm和200nm，质量比为1:1。
本发明还公开了甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的应用，用于疾病的辅助诊断和治疗目的测定血清中甲胎蛋白异质体3的浓度。
本发明试剂盒采用胶乳免疫比浊法，其反应原理为试剂R1中提供稳定性试剂反应环境，去除干扰，然后被检测物与试剂R2中吸附在胶乳颗粒和磁性纳米颗粒上的抗 AFP-L3抗体产生抗原抗体的凝集反应，形成免疫复合物，通过测定该免疫复合物吸光度的变化，可算出样本中 AFP-L3 的含量。反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。
有益效果
1）本发明稳定的甲胎蛋白异质体3测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。
2）通过在试剂R2中加入牛血清白蛋白、海藻糖和聚乙二醇6000组成复合助悬剂，新型表面活性剂聚氧乙烯烷基醚GLAURIN，各组分协同作用，有效地提高了试剂中抗体磁性纳米颗粒和抗体胶乳颗粒的稳定性，使试剂稳定性能优异，有利于该试剂在市场中进一步的推广。
3）通过加入16-巯基十六烷-1-醇增强磁性纳米颗粒特异性，可以特异性的识别AFP-L3的糖链，较好的吸附AFP-L3，避免其他物质的干扰，有利于试剂后期的反应，提高试剂的分析灵敏度和准确度。
4）通过在试剂R2中加入两种不同粒径大小100nm和200nm的表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒和聚乙二醇包覆的磁性纳米颗粒，两种不同颗粒联合使用，可以提高试剂分析灵敏度、准确度，减少胶乳颗粒的用量，降低试剂成本。
5）该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，可以代替化学发光试剂，有利于该试剂在临床中推广和应用。
附图说明
图1为实施例1和对比例1准确度比对的相关性曲线；
图2为实施例1线性曲线；
图3为实施例1和对比例1稳定性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用速率法进行测定，检测主波长为600nm，操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品10µL，再加入200µL 的R1试剂，预孵育5min后再加入50µL的R2试剂，混匀，延迟1min，读取吸光度 A1，5min后读取吸光度A2，
计算∆A=(A2-A1)。
甲胎蛋白异质体3含量（（ng/ml））=（ΔA样本÷ΔA校准品）* 校准品浓度。
样本要求：
1.不溶血血清。
2.样本稳定性：标本2~8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。
实施例1
一种常规的甲胎蛋白异质体3测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1中含有以下成分：
哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)缓冲液 50mmol/L；
NaCl 9g/L；
牛血清白蛋白（BSA） 10g/L；
聚乙二醇6000 8g/L；
海藻糖 8g/L；
GLAURIN 1%；
proclin300 1 ml/L。
试剂R1的pH值为7.0。
试剂R2中含有以下成分：
哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)缓冲液 50mmol/L；
羊抗人AFP-L3抗体包被胶乳颗粒 15mg/L；
羊抗人AFP-L3抗体包被磁性纳米颗粒 15mg/L；
牛血清白蛋白（BSA） 5g/L；
聚乙二醇6000 5g/L；
海藻糖 5g/L；
GLAURIN 1%；
proclin300 1ml/L。
试剂R2的pH值为6.8。
其中所述百分比为体积比。试剂R2中磁性纳米颗粒粒径为300nm。试剂R2中胶乳颗粒的粒径100nm和200nm质量比为1：1。
上述所述的甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：一、羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被的磁性纳米颗粒的制备方法：取适量300nm修饰的聚乙二醇包覆的磁性纳米颗粒，加入到10ml缓冲液中，使颗粒终浓度为1.0% ；然后加入适量羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体、1ml mmol/L的16-巯基十六烷-1-醇溶液，室温下混合搅拌2小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，10000 rpm离心30分钟，去除上清，所得沉淀即为封闭完成的羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被的磁性纳米颗粒。二、羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒的制备方法：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0% ；然后加入适量羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基丁二酰亚胺，室温下混合搅拌3小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，12000 rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒；再按照比例加入其它物质溶解，制成甲胎蛋白异质体3测定试剂盒；所述的羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒为两种不同粒径大小的颗粒，分别为： 100nm和200nm，质量比为1:1。
对比例1
市售的化学发光甲胎蛋白异质体3测定试剂盒，使用化学发光免疫分析仪检测。
对比例2
与实施例 1 中甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中为无抗体包被的磁性纳米颗粒，其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例 1 中甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的区别仅在磁性纳米颗粒的抗体偶联剂16-巯基十六烷-1-醇更换为16-巯基十六烷基酸，其它与实施例1相同。
性能验证
试验一
准确度比对试验：实验方案为：实施例1、对比例1，同时检测了40个临床血清样本，对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以对比例1检测结果作为对照值，分别计算40对数据的相对偏差（r）。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10%（实施例1使用生化仪，对比例1使用化学发光免疫分析仪）。检测结果如表1所示，并获得了实施例1和对比例1试剂的相关性曲线（如图1所示）。
表1相关性对比实验结果
Figure 940716DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表2对比例1分别与实施例1的相关系数
Figure 326698DEST_PATH_IMAGE004
由表1和图1的可以看出，实施例1和对比例1的试剂盒血清测试偏差最大值为8.42％，两种试剂的相关系数为0.999，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂与对比例1试剂相关性良好，完全可以替代对比例1试剂。对比例2试剂无抗体包被的磁性纳米颗粒，检测结果较对比例1试剂，结果整体偏低。多种抗体颗粒联合使用可以提高试剂的准确度，使试剂性能满足临床需求。
试验二
精密度试验：实施例1和对比例1，对临床样品进行20次检测，计算20次检测结果平均值、标准差和变异系数。结果见表2。
表2 精密度检测数据表
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表2可以看出，实施例1和对比例1的检测数值标准偏差小，变异系数小，重复性较好，精密度较高。实施例1和对比例1精密度基本一致。对比例3由于更换了偶联剂，检测结果变异系数明显大于实施例1和对比例1，说明16-巯基十六烷-1-醇偶联效果优于16-巯基十六烷基酸。因此良好的偶联剂可以提高抗体与微球颗粒的偶联效果，事试剂精密度较好。实施例1精密度完全可以替代对比例1试剂，应用于临床。
试验三
线性实验：取甲胎蛋白异质体3高值样本为800ng/mL，并进行稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL浓度的样本，用实施例1试剂进行检测，每个浓度水平各样本分别测定3次，分别取其平均值。检测结果如表所示：
表3线性相关验证实验检测数据表
Figure 808233DEST_PATH_IMAGE006
由表3和图1可以看出，本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化，线性相关系数达到0.999，大于0.990，符合标准要求。说明实施例1线性范围较好，实施例1线性范围全可以替代对比例1试剂。实施例1试剂较好的线性变化更能够符合临床病例样本的要求。
试验四
稳定性实验：对实施例1和对比例1提供的甲胎蛋白异质体3测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1提供的试剂，每一例平行包含12组，一起放入2-8℃冰箱中存储，每月检测靶值为2.50±0.50 ng/mL的质控品，每组测试3次，求平均值，并监测质控品测定值的变化，结果见表5。
表5试剂热稳定性验证数据
Figure DEST_PATH_IMAGE007
由表5和图3可以看出，实施例1与对比例1稳定性基本一致，本发明提供的实施例1试剂和对比例1试剂在2-8℃条件下存储，12月内检测值虽有一定的下降，但是都在靶值范围内，稳定性较好。说明本发明缓冲液、磁性纳米颗粒和不同粒径胶乳微粒，以及新型表明活性剂、多种保护剂和悬浮剂的加入共同作用，显著提高甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的稳定性。
综上所述，该试剂盒采用修饰的特异性磁性纳米颗粒，不同规格的胶乳颗粒，新型表面活性剂，不同的保护剂和悬浮剂，是一种抗干扰性、稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (2)

1.一种甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的制备方法，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
试剂R1中含有以下成分：
哌嗪-1 ,4-二乙磺酸缓冲液 50mmol/L；
NaCl 9g/L；
牛血清白蛋白 10g/L；
聚乙二醇6000 8g/L
海藻糖 8g/L
GLAURIN 1%；
proclin300 1ml /L；
试剂R2中含有以下成分：
哌嗪-1 ,4-二乙磺酸缓冲液 50mmol/L；
羊抗人AFP-L3抗体包被胶乳颗粒 15mg/L；
羊抗人AFP-L3抗体包被磁性纳米颗粒 15mg/L；
牛血清白蛋白 5g/L；
聚乙二醇6000 5g/L
海藻糖 5 g/L
GLAURIN 1%；
proclin300 1ml /L；
其中所述百分比为体积比；试剂R1和试剂R2体积比为4:1；
甲胎蛋白异质体3测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：一、羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被的磁性纳米颗粒的制备方法：取适量300nm修饰的聚乙二醇包覆的磁性纳米颗粒，加入到10ml缓冲液中，使颗粒终浓度为1.0%；然后加入适量羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体、1ml 10mmol/L的16-巯基十六烷-1-醇溶液，室温下混合搅拌2小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，10000 rpm离心30分钟，去除上清，所得沉淀即为封闭完成的羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被的磁性纳米颗粒；二、羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒的制备方法：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0%；然后加入适量羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基丁二酰亚胺，室温下混合搅拌3小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，12000 rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒；再按照比例加入其它物质溶解，制成甲胎蛋白异质体3测定试剂盒；所述的羊抗人甲胎蛋白异质体3抗体包被胶乳颗粒为两种不同粒径大小的颗粒，分别为：100nm和200nm，质量比为1:1。
2.一种权利要求1所述的制备方法制备的试剂盒的应用，用于非疾病的辅助诊断和治疗目的测定血清中甲胎蛋白异质体3的浓度。
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