CN110320370B

CN110320370B - 肝癌肿瘤标志物afp、甲胎蛋白异质体、gp73抗原同步免疫检测试剂盒、方法及应用

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Publication number: CN110320370B
Application number: CN201910703230.7A
Authority: CN
Inventors: 万东山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: CN110320370A

Abstract

本发明涉及涉及肝癌肿瘤标志物AFP、甲胎蛋白异质体、GP73抗原同步免疫检测试剂盒、方法及应用，属于免疫检测技术领域。所述试剂盒包括分别被AFP、LCA‑BSA、GP73标记的磁微粒、AFP、GP73抗体偶联混合的吖啶酯、GP73、AFP校准品、第一激发液、第二激发液、洗液和各种稀释液。采用所述试剂盒和检测方法，灵敏度高、特异性强、准确性高，检测时间短，有助于良性肝病和恶性肝病的鉴别和肝癌的早期诊断。对于提高肝癌患者早期诊断率和延长生存率方面有重要的作用，具有广泛的临床应用价值。

Description

肝癌肿瘤标志物AFP、甲胎蛋白异质体、GP73抗原同步免疫检测试剂盒、方法及应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体地，涉及肝癌肿瘤标志物AFP、甲胎蛋白异质体、GP73抗原同步免疫检测试剂盒、方法及应用。

背景技术

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，五年生存率不到10%，已成为我国位居第二的恶性肿瘤致死病因。肝癌的早期症状不明显，一旦发现，往往就是晚期，失去了最佳的临床治疗期，目前临床对肝癌诊断主要采取影像学检查和血清标志物的检查相结合的方法，血清标志物检查的灵敏度高于影像学，而且操作简单，价格低廉，适合对高危人群大规模的筛查，甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、高尔基体蛋白73肿瘤标志物在肝癌早期诊断中有重要意义。

甲胎蛋白（AFP）是主要在胎儿肝中合成，人体在胚胎时期血液中含有的一种特殊蛋白，系肝细胞内粗面内网核糖颗粒所合成，分子量6.9万，胎儿出生后，血清甲胎蛋白（AFP）浓度下降，几个月至1年内降至正常，正常成人肝细胞失去合成AFP的能力，因此血清中含量极微（一般＜20μg/L），除肝细胞癌可显著升高外，妊娠、胚胎癌如睾丸癌、卵巢癌和极少数胃、胰、胆管、结肠直肠癌也可升高，但其绝对值不如肝细胞癌高。血清甲胎蛋白AFP升高为肝细胞癌最重要的标志物，阳性率达60-70%，如果血清AFP持续大于400ng/ml，持续4周以上，转氨酶正常，应高度怀疑肝癌。但是仅凭甲胎蛋白（AFP）升高不能确诊肝癌，不能做出肝癌的诊断，因为甲胎蛋白（AFP）存在变异体，非肝癌的患者也会升高。

甲胎蛋白异质体（Variants of AFP or molecular heterogenetic of AFP）是一种单链糖蛋白，含糖量约为4%左右，不同组织细胞合成的AFP，其糖链结构有所不同，对植物凝集素的结合能力也不相同，此种糖链结构不同的AFP的亚型或变异体，也称为AFP分子异质体。根据AFP与外源性凝集素结合能力，可分为不同的变异体，AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。AFP-L1不能与小扁豆凝集素（LCA）结合，AFP-L1主要存在于良性肝病中，AFP-L2存在于孕妇中，AFP-L3能与LCA结合，是肝细胞癌所特有的。

高尔基体蛋白73(GP73)是高尔基体II型跨膜蛋白,在正常人亦有表达,但是含量极低,其分子量为73kD,该蛋白的编码基因位于第9号染色体，在正常情况下，GP73是高尔基体顺面膜囊上的一种整合膜蛋白，疾病状态的时候GP73可从高尔基体顺面膜囊上循环出来，并到达胞内体以及细胞表面，应用糖蛋白组学技术发现，GP73与肝癌之间密切相关，在肝癌患者的血清中，血清中GP73表达显著提高。

在正常肝脏中，肝细胞几乎不表达GP73，但是在肝脏出现急性炎症或较严重的肝纤维化时，GP73在肝脏细胞中的表达明显上调，而发展到肝硬化时，GP73在肝脏细胞中的表达进一步提高，发展到肝癌时，GP73的表达达到高峰，因此GP73的表达与肝癌发生过程密切相关，成为肝癌诊断和监测的标志物之一。

GP73作为新发现的肝癌肿瘤诊断标志物，其诊断的敏感性和特异性均高于AFP，但是单项检查，均存在一定的假阳性和漏检的现象，采用多种肿瘤标志物联合检查，对于提高肝癌诊断的敏感性和特异性有重要意义。研究发现，GP73的表达与肝脏肿瘤组织的大小，分化程度，临床分期与血清AFP水平无明显的关联，与血管内皮生长因子（VEGF）在肝癌组织的表达呈正相关。

2005年，美国肝病协会提出对于肝癌高危患者的监测方案，即每6个月进行血清甲胎蛋白（AFP）水平的监测，AFP是目前应用最为广泛的肝癌标志物，应用了数十年，其敏感性45~65%，特异性76~96%不等，各国学者们一直在寻找更理想的肝癌标志物，能够将肝癌、肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等区分开来。

研究发现,通过检测血清标志物高尔基体糖蛋白-73(GP-73)来进行肝癌早期诊断,其敏感性可以达到76.9%，远高于传统方法甲胎蛋白(AFP)测定。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的一在于提供肝癌肿瘤标志物甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、高尔基体蛋白73抗原同步免疫检测试剂盒，目的二在于提供上述试剂盒的检测方法，目的三在于提供上述试剂盒的应用。采用所述试剂盒和检测方法，灵敏度高、特异性强、准确性高，检测时间短，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

肝癌肿瘤标志物AFP、甲胎蛋白异质体、GP73抗原同步免疫检测试剂盒，包括：

（1）微孔板；

（2）第一容器，其中容纳GP73抗体标记的磁微粒；

（3）第二容器，其中容纳AFP抗体标记的磁微粒；

（4）第三容器，其中容纳LCA-BSA标记的磁微粒；

（5）第四容器，其中容纳AFP、GP73抗体偶联混合的吖啶酯；

（6）分别容纳不同浓度GP73抗原校准品的若干容器；

（7）分别容纳不同浓度AFP抗原校准品的若干容器；

（8）分别容纳有校准品稀释液、洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器；所述洗液为磷酸盐缓冲液，内含吐温20；所述第一激发液为内含H₂O₂的硝酸溶液；所述第二激发液为NaOH溶液；所述磁微粒稀释液和吖啶酯偶联物稀释液均为内含牛血清白蛋白和吐温20的磷酸缓冲液；

其中，所述GP73抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1；所述AFP抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

作为对上述方案的进一步优化，所述AFP、GP73抗体偶联混合的吖啶酯是将GP73多克隆抗体标记吖啶酯和AFP单克隆抗体标记吖啶脂等比例混合后获得。

作为对上述方案的进一步优化，所述LCA-BSA是由牛血清蛋白第五片段标记的LCA。

作为对上述方案的进一步优化，所述磁微粒是粒径2.8μm的含有甲苯璜酰基团的磁微粒。

作为对上述方案的进一步优化，所述吖啶酯为吖啶琥珀酰亚胺酯。

作为对上述方案的进一步优化，所述校准品稀释液的配方为：磷酸氢二钠2.96g/L、磷酸二氢钠0.29g/L、氯化钠9.0g/L、吐温20 1.0mL/L、ProcoLin 300 1.0mL/L和300ml/L小牛血清；所述洗液的配方为：0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液、体积分数为0.05%的吐温20；所述第一激发液的配方为：0.05M硝酸溶液、体积分数为0.15%的H₂O₂；所述第二激发液的配方为：0.2M NaOH溶液；所述磁微粒稀释液的配方为：0.01M pH7.4磷酸缓冲液、质量体积百分数为0.5%的牛血清白蛋白和体积分数为0.1%的吐温20；所述吖啶酯偶联物稀释液的配方为：0.02M pH7.4磷酸缓冲液、质量体积百分数为1%的牛血清白蛋白和体积分数为0.1%的吐温20。

作为对上述方案的进一步优化，所述分别容纳不同浓度GP73抗原校准品的若干容器，包括：（1）第5.1容器，其中容纳浓度为50 ng/ml GP73抗原校准品S1；

（2）第5.2容器，其中容纳浓度为100 ng/ml GP73抗原校准品S2；

（3）第5.3容器，其中容纳浓度为250 ng/ml GP73抗原校准品S3；

（4）第5.4容器，其中容纳浓度为500 ng/ml GP73抗原校准品S4；

（5）第5.5容器，其中容纳浓度为1000 ng/ml GP73抗原校准品S5。

作为对上述方案的进一步优化，所述分别容纳不同浓度AFP抗原校准品的若干容器，包括：

（1）第6.1容器，其中容纳浓度为5 ng/ml AFP抗原校准品S1；

（2）第6.2容器，其中容纳浓度为25 ng/ml AFP抗原校准品S2；

（3）第6.3容器，其中容纳浓度为100 ng/ml AFP抗原校准品S3；

（4）第6.4容器，其中容纳浓度为300 ng/ml AFP抗原校准品S4；

（5）第6.5容器，其中容纳浓度为600 ng/ml AFP抗原校准品S5。

本发明还请求保护上述试剂盒的检测方法，步骤如下：

（1）将样品加入到微孔板的微孔中，将不同浓度的GP73抗原校准品、AFP抗原校准品分别加入到微孔中，加样量分别为50μL；

（2）将GP73抗体标记的磁微粒、AFP抗体标记的磁微粒和LCA-BSA标记的磁微粒分别加入到加有样品的不同微孔中，加入量均为15μg；

（3）将微孔板置37℃温育30分钟；

（4）微孔板施加磁力以吸住磁微粒，弃去微孔中液体并洗涤；

（5）将浓度为0.3μM的AFP、GP73抗体偶联混合的吖啶酯分别加入各孔中，加样量为100μL，37℃温育30分钟；

（6）微孔板施加磁力以吸住磁微粒，弃去孔中液体并洗涤；

（7）向各微孔中同时滴加第一激发液和第二激发液各50μL，同时用闪光发光仪检测各微孔的相对发光单位；

（8）根据AFP、GP73校准品的剂量和发光值，采用双对数拟合曲线，分别计算AFP、AFP-L3、GP73样品的浓度。

本发明还保护所述试剂盒在良性和恶性肝病的鉴别以及肝癌的早期诊断中的应用。

有益效果：

1、本发明采用甲胎蛋白AFP、高尔基体GP73单克隆抗体分别共价结合磁微粒,将标记有BSA的小扁豆凝集素（LCA）共价结合磁微粒，并将GP73的多抗标记吖啶酯，甲胎蛋白AFP单克隆抗体标记吖啶酯混合；G73、AFP通过双抗体夹心法，加入待测样本，反应后形成抗体—抗原结合物，并与加入的吖啶酯标记的抗体，形成抗体-抗原-吖啶酯标记抗体复合物，充分洗涤后，加入激发液，吖啶酯在激发液的作用下发光，相对发光强度( RLU)与样本中GP73、AFP含量呈正相关，根据校准曲线即可计算出样本中GP73的含量。而AFP-L3则通过间接法，LCA与样本中的AFP-L3抗原结合，AFP单抗标记的吖啶酯与样本中的AFP-L3抗原结合，洗涤后，加入激发液，吖啶酯在激发液的作用下发光，相对发光强度( RLU)与样本中AFP-L3含量呈正相关，根据校准曲线即可计算出样本中AFP-L3的含量。

2、通过测定患者血清中的AFP、AFP-L3和GP73，更加有助于良性肝病和恶性肝病的鉴别和肝癌的早期诊断。对于提高肝癌患者早期诊断率和延长生存率方面有重要的作用，具有广泛的临床应用价值。GP73、AFP、AFP-L3目前检查方法，除了免疫组织化学法外，酶联免疫法及化学发光法检测有相应试剂盒，均为单独检测，与本发明采用磁微粒标记三种GP73、AFP、LCA，吖啶酯标记吖啶酯发光截然不同，同时磁微粒化学发光免疫分析既具有化学发光法的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速、易于标准化操作的特点，且测试中不使用有害试剂，试剂保持期长，特别是适用于自动化操作，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，是体外诊断试剂发展的方向和未来。

3、本发明试剂盒，通过筛选原料并在制造过程添加清洁抗体，避免了不同抗原或抗体之间互相产生交叉反应的问题，可实现一次反应同时检测患者血样本三种AFP、GP73、AFP-L3抗原。

4、本发明提供的试剂盒和检测方法，灵敏度高、特异性强、准确性高，检测时间短，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。

具体实施方式

具体而言，在第一方面，本发明提供了同时检测样品中AFP、LCA、GP73抗原免疫检测试剂盒，其包括：

（1）第一容器，其中容纳GP73抗体标记的磁微粒；

（2）第二容器，其中容纳AFP抗体标记的磁微粒；

（3）第三容器，其中容纳LCA-BSA标记的磁微粒；

（4）第四容器，其中容纳AFP、GP73抗体偶联混合的吖啶酯；

（5）分别容纳不同浓度GP73抗原校准品的若干容器；

（6）分别容纳不同浓度AFP抗原校准品的若干容器；

（7）分别容纳有校准品稀释液、洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器；所述洗液为磷酸盐缓冲液，内含吐温20；所述第一激发液为内含H₂O₂的硝酸溶液；所述第二激发液为NaOH溶液；所述磁微粒稀释液和吖啶酯偶联物稀释液均为内含牛血清白蛋白和吐温20的磷酸缓冲液；

本发明人设计的该抗原采用单克隆制备方法，免疫制备单克隆抗体，多克隆抗体，经过纯化等步骤，能方便地连接于磁微粒上，仍旧保持效价高、特异性好的优势，并且能涵盖了AFP、GP73的测定。该抗原能够通过本领域技术人员所熟知的重组方法生产，当前已经有商业渠道提供重组生产蛋白（抗原）的服务。

优选在本发明第一方面的试剂盒中，磁微粒是粒径2.8μm的含有甲苯璜酰基团的磁微粒。本发明人研究发现这样的磁微粒对本发明的磁微粒标记率高，施加磁力后聚集迅速，并且吸附一致性好。在本发明的具体实施方式中，磁微粒是Dynabeads M-270 型号的磁微粒。更优选在本发明第一方面的试剂盒中，用抗体标记的磁微粒的制备方法包括：将抗体加入磁微粒，震荡标记，后加入BSA封闭，弃上清液，再洗涤。

优选在本发明的试剂盒中，吖啶酯是吖啶琥珀酰亚胺酯。本发明人研究发现该吖啶酯基本不影响本发明的抗原、抗体效价，而且发光好。

优选在本发明的试剂盒中，AFP、AFP-L3、GP73校准品由AFP、GP73抗原按照一定浓度进行稀释，形成的一系列抗原标准品，见下表1。

AFP抗原校准品可测定AFP、AFP-L3两个品种，计算AFP-L3（抗原量）/AFP（抗原量）的比值。

本发明人发现，由于操作人员水平的参差不齐，所以会出现带有倾向性的检测结果，通过设置这些不同浓度的校准品，计算样本的浓度值，可以有效避免检测结果受人为操作因素的影响。在本发明的具体实施方式中，S0~S5稀释液均为含有保护性蛋白，过滤除菌而制备得到的。

更优选在本发明第一方面的试剂盒中，磁微粒稀释液和吖啶酯偶联物稀释液的配方可以是相同的。

另外，本发明第一方面的试剂盒还可以包括记载其应用（如本发明第二方面的应用）的说明书。又如，本发明第一方面的试剂盒可以同磁板、微孔板和/或闪光发光仪等仪器搭配出售，因此本发明还提供包括本发明第一方面的试剂盒以及任选仪器的产品。

在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的试剂盒在同时检测样品中GP73抗原方法中的应用；相应地，本发明也提供了本发明第一方面的试剂盒在制备用于同时检测样品中AFP、AFP-L3、GP73的产品中的应用。

在本发明中，样品是潜在可能含有GP73抗原的离体样品，如血液、血液制品、体液等。本发明的检测方法所针对的目标——AFP、GP73、AFP-L3抗原，在本发明的具体实施方式中，检测AFP、GP73、AFP-L3抗原。

需要指出的是，本发明的检测用于对离体样品的检测，检测的直接结果是抗原的量值，而并非诊断结果。即使对于利用本发明的检测方法检测人血液样品中抗原，也只能直接得出抗原量值高低，还需要有经验的医生根据相应人的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出检测出的相应抗原的量是否能致病。因此无法根据抗原量而直接判断其是否患有疾病，所以本发明直接目的不是诊断。所以，本发明的试剂盒的应用不属于诊断方法。

在本文中，如无特别说明，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等序数词仅仅是对具有相同或相似用途的物品或物质的区分，并不对物品或物质的结构、组成、性质和形状等构成限定。例如，第5.1容器和第5.2容器可以是材料、形状完全相同的容器，但是是不同的容器，分别容纳不同浓度的校准品，容器可以是瓶、管或杯，使得其中的容纳物被分隔保存。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。其中的试剂均可通过商业渠道获得，经测试，磁微粒选用可购自Thermo Fisher公司的DynabeadsM-270 型号的磁微粒，吖啶酯选用可购自Sigma-Aldrich的吖啶琥珀酰亚胺酯。

实施例1 甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白异质体（AFP-L3）、高尔基体蛋白73（GP73）检测试剂盒的制备

经本发明人研究，选择AFP单抗（可购自sigma，货号SAB420074）标记磁微粒，AFP单抗抗体（可购自sigma，货号GW22680）标记吖啶酯。

经本发明人研究，选择LCA（可购自sigma，货号L1277）标记磁微粒，牛血清白蛋白第五片段（可购自sigma，货号B064）标记LCA。

经本发明人研究，选择GP73单抗（可购自Santa Cruz，货号Goy-kt0635）标记磁微粒，GP73多克隆抗体（可购自Abcam，货号yb-668Hu01）标记吖啶酯。

尽管不是所测试中效价最高的抗体，但是在同时检测中准确性最好，故分别使用单抗和多抗标记的磁微粒和吖啶酯偶联物。

GP73抗原纯品经研究，委托合成了氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的GP73重组抗原（生工生物工程(上海)股份有限公司），其氨基酸序列和结构与与天然的GP73抗原的比对，二者一致。使用它制备校准品。

AFP抗原纯品，采用AFP、AFP-L3抗原纯品经研究，委托合成了氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的AFP重组抗原（生工生物工程(上海)股份有限公司），其氨基酸序列和结构与与天然的抗原的比对，二者一致。使用它制备校准品。

1.1 LCA与BSA标记：

分别取 LCA和BSA，均采用0.01MPB(pH6.3)稀释至1mg/ml，将EDC按照每毫克蛋白加入0.5mg/ml的量，按照LCA与BSA1：1的质量比混合，称取EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），按照每毫克蛋白加入0.5mg加入EDC进行标记，在25℃均匀振荡18~24hr，取出用0.01MPBS（pH7.2），进行透析，-20℃存放备用。

1.2 标记的磁微粒的制备

1.2.1AFP单抗标记磁微粒：取10mg磁微粒，去上清，加入900μl的0.1M硼酸缓冲液pH9.5，加入300μg蛋白（蛋白浓度预先用0.1M硼酸缓冲液稀释至1mg/ml）,混匀。混匀震荡2~8℃10小时，加入10%BSA10μl，在2~8℃震荡混匀6小时。去上清，用洗涤液洗涤3次，获得的标记的磁微粒置于含1%（w/v，g/mL）牛血清白蛋白的0.01M PBS（pH7.4）中，于2-8℃保存。

1.2.2 LCA-BSA标记磁微粒：取10mg磁微粒，去上清，加入900μl的0.1M硼酸缓冲液pH9.5，加入100μg蛋白（蛋白浓度预先用0.1M硼酸缓冲液稀释至1mg/ml）,混匀。混匀震荡2~8℃10小时，加入10%BSA10μl，在2~8℃震荡混匀6小时。去上清，用洗涤液洗涤3次，获得的标记的磁微粒置于含1%（w/v，g/mL）牛血清白蛋白的0.01M PBS（pH7.4）中，于2-8℃保存。

1.2.3 GP73单抗标记磁微粒：取10mg磁微粒，去上清，加入900μl的0.1M硼酸缓冲液pH9.5，加入200μg蛋白（蛋白浓度预先用0.1M硼酸缓冲液稀释至1mg/ml）,混匀。混匀震荡2~8℃10小时，加入10%BSA10μl，在2~8℃震荡混匀6小时。去上清，用洗涤液洗涤3次，获得的标记的磁微粒置于含1%（w/v，g/mL）牛血清白蛋白的0.01M PBS（pH7.4）中，于2-8℃保存。

1.3吖啶酯偶联物的制备

1.3.1 GP73多克隆抗体标记吖啶酯

准确称量吖啶酯，用DMSO（二甲基亚砜）溶解固体吖啶酯，使得其浓度为1mg/mL,将GP73多克隆抗体用0.1MCB pH9.5缓冲液稀释至1mg/mL,按照每毫克的蛋白加入吖啶酯40μg的比例，混匀，在室温（25℃）分别反应30分钟，加入10%甘氨酸，使之浓度达到0.5%，封闭未反应的氨基，室温封闭30分钟，用0.01MPBS透析，加甘油至浓度50%。置-18℃以下保存。

1.3.2AFP单克隆抗体标记吖啶脂

准确称量吖啶酯，用DMSO（二甲基亚砜）溶解固体吖啶酯，使得其浓度为1mg/mL,将AFP单克隆抗体用0.1MCB pH9.5缓冲液稀释至1mg/mL,按照每毫克的蛋白加入吖啶酯20μg的比例，混匀，在室温（25℃）分别反应30分钟，加入10%甘氨酸，使之浓度达到0.5%，封闭未反应的氨基，室温封闭30分钟，用0.01MPBS透析，加甘油至浓度50%。置-18℃以下保存。

1.4 GP73校准品的制备

1.4.1校准品稀释液制备

磷酸氢二钠2.96g/L, 磷酸二氢钠0.29g/L，氯化钠9.0g/L,吐温20 1.0mL/L,ProcoLin 300 1.0mL/L，300ml/L小牛血清，溶解混匀后，保存于2~8℃。

1.4.2校准品S0的制备

若干体积的校准品稀释液。

1.4.3 校准品S1的制备

用校准品稀释液将GP73抗原纯品稀释至50ng/ml;

1.4.4校准品S2的制备

用校准品稀释液将GP73抗原纯品稀释至100ng/ml;

1.4.5校准品S3的制备

用校准品稀释液将GP73抗原纯品稀释至250ng/ml;

1.4.6校准品S4的制备

用校准品稀释液将GP73抗原纯品稀释至500ng/ml;

1.4.7校准品S5的制备

用校准品稀释液将GP73抗原纯品稀释至1000ng/ml;

1.5AFP校准品的制备

1.5.1校准品稀释液制备

1.5.2校准品S0的制备

若干体积的校准品稀释液。

1.4.3 校准品S1的制备

用校准品稀释液将AFP抗原纯品稀释至5ng/ml

1.4.4校准品S2的制备

用校准品稀释液将AFP抗原纯品稀释至25ng/ml;

1.4.5校准品S3的制备

用校准品稀释液将AFP抗原纯品稀释至100ng/ml;

1.4.6校准品S4的制备

用校准品稀释液将AFP抗原纯品稀释至300ng/ml;

1.4.7校准品S5的制备

用校准品稀释液将AFP抗原纯品稀释至600ng/ml;

实施例2 AFP、AFP-L3、GP73试剂盒确定

1.磁微粒的确定：分别将AFP、LCA-BSA、GP73磁微粒分别进行适当浓度的稀释。

2.吖啶酯的确定：将AFP、GP73标记的吖啶酯按照1:1的比例混合，用稀释液进行适当浓度的稀释。

3.本发明的同步检测试剂盒可以包括13个容器，分别装有制备的AFP、LCA-BSA、GP73标记的磁微粒、制备的吖啶酯偶联物以及AFP、GP73校准品S0~S5，另外，本发明的检测试剂盒还可以包括分别装有以下试剂的容器：洗液（其配方为：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4、0.05%（v/v）吐温20）、激发液A（其配方为：含0.05M硝酸溶液、0.15%（v/v）H₂O₂）和激发液B（其配方为： 0.2M NaOH溶液），另外还可以包括磁微粒稀释液（其配方为：0.01M磷酸缓冲液pH7.4，0.5%（w/v，g/ml）牛血清白蛋白，0.1%（v/v）吐温20）和吖啶酯偶联物稀释液（其配方为：0.02M磷酸缓冲液pH7.4、1%（w/v，g/ml）牛血清白蛋白，0.1%（v/v）吐温20）。在磁微粒稀释液和吖啶酯偶联物稀释液中分别加入1%的清洁抗体，避免AFP、AFP-L3、GP73抗体的交叉污染。

实施例3 AFP、AFP-L3、GP73试剂盒检测步骤及应用

一、检测具体过程如下：

（1）每份样品向各微孔中分别加入3孔，将AFP、GP73的S0~S5校准品分别加入微孔中，加样量分别为50μL；其中AFP S0~S5校准品加入2份微孔中。

（2）将AFP、LCA-BSA、GP73磁微粒，分别加入样品中，并将于微孔板的各孔中；磁微粒浓度0.3mg/ml,每孔50μl（15μg）。

（3）将微孔板置37℃温育30分钟；

（4）微孔板施加磁力以吸住磁微粒，弃去孔中液体并洗涤；洗涤5次。

（5）将吖啶酯（AFP、GP73混合吖啶酯）加入各孔中，加样量为100μL，37℃温育30分钟；吖啶酯的浓度为0.3μM。

（6）微孔板施加磁力以吸住磁微粒，弃去孔中液体并洗涤；洗涤5次。

（5）向各孔中同时滴加激发液A和激发液B各50μL，同时用闪光发光仪（可购自promage公司）进行检测各孔的相对发光单位（RLU）。

根据AFP、AFP-L3、GP73校准品的剂量和发光值，采用双对数拟合曲线，分别计算AFP、AFP-L3、GP73样品的浓度。加样模式如下表2所示。

表2：加样模式

样品+AFP磁微粒+吖啶酯混合物	AFP校准品+ AFP磁微粒+吖啶酯混合物
		样品+LCA-BSA磁微粒+吖啶酯混合物	AFP校准品+ LCA-BSA磁微粒+吖啶酯混合物
样品+GP73磁微粒+吖啶酯混合物	GP73校准品+ GP73磁微粒+吖啶酯混合物

二、AFP、AFP-L3、GP73试剂盒的性能测定

1.剂量反应关系测定

1.1 AFP：加入AFP磁微粒，测定AFP校准品,校准品浓度分别是0、5、25、100、300、600ng/ml,用双对数数学模型进行拟合曲线作图。计算其线性相关系数，其相关系数为0.996。

1.2 AFP-L3：加入LCA-BSA磁微粒，测定AFP校准品,校准品浓度分别是0、5、25、100、300、600ng/ml,用双对数数学模型进行拟合曲线作图。计算其线性相关系数，其相关系数为0.998。

1.3 GP73：加入GP73磁微粒，平行测定GP73校准品,校准品浓度分别是0、50、100、250、500、1000ng/ml,用双对数数学模型进行拟合曲线作图。计算其线性相关系数，其相关系数为0.993。

2.分析灵敏度测定

2.1 AFP：平行测定10孔零值校准品，计算发光值的标准偏差（SD）和平均值（Mean），计算M=Mean +2×SD，将计算结果M代入公式log（M/ Mean /（1- M/ Mean ）），其中Mean为S₀发光值的平均值，再将log（M/ Mean /（1- M/ Mean ））的计算结果代入线性公式中的Y值，将该值代入线性公式计算X 值，再计算Power即(Mean +2SD)时对应的浓度值,为分析灵敏度。该试剂的AFP分析灵敏度为0.31ng/ml。

2.2 AFP-L3：平行测定10孔零值校准品，计算发光值的标准偏差（SD）和平均值（Mean），计算M=Mean +2×SD，将计算结果M代入公式log（M/ Mean /（1- M/ Mean ）），其中Mean为S₀发光值的平均值，再将log（M/ Mean /（1- M/ Mean ））的计算结果代入线性公式中的Y值，将该值代入线性公式计算X 值，再计算Power即(Mean +2SD)时对应的浓度值,为分析灵敏度。该试剂的AFP-L3分析灵敏度为1.24ng/ml。

2.3 GP73：平行测定10孔零值校准品，计算发光值的标准偏差（SD）和平均值（Mean），计算M=Mean +2×SD，将计算结果M代入公式log（M/ Mean /（1- M/ Mean ）），其中Mean为S₀发光值的平均值，再将log（M/ Mean /（1- M/ Mean ））的计算结果代入线性公式中的Y值，将该值代入线性公式计算X 值，再计算Power即(Mean +2SD)时对应的浓度值,为分析灵敏度。该试剂的GP73分析灵敏度为0.23ng/ml。

3. 精密性：平行测定10孔AFP、GP73样本质控样本，计算测定结果的平均浓度（Mean）与标准偏差（SD），计算精密度（CV%）=SD/ Mean×100%。计算AFP、AFP-L3、GP73变异系数。结果下表3所示。

4.正常值区间

分别测定AFP、AFP-L3、GP73样本230例，按照95%百分位确定正常值上限。如下表4所示。其中AFP-L3测定的量值与AFP测定的量值比大于或等于10%，则具有诊断意义。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 万东山

<120> 肝癌肿瘤标志物AFP、甲胎蛋白异质体、GP73抗原同步免疫检测试剂盒、方法及应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 387

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Cys Ser Arg Arg Gln Lys Gly Leu Leu Gln Thr Gln Phe Cys Leu

1 5 10 15

Val Thr Val Ala Cys Leu Gln Ser Gln Val Phe Met Tyr Asn His Leu

20 25 30

Gln Gln Lys Val Arg Asn Ala Glu Ala Leu Ala Gln Lys Gln Gln Gln

35 40 45

Glu Ala Leu Ser Ala Gln Leu Gln Val Val Tyr Glu His Arg Ser Arg

50 55 60

Leu Glu Arg Ser Leu Gln Lys Glu Arg Gly Glu His Lys Lys Thr Lys

65 70 75 80

Glu Asp Phe Leu Val Tyr Lys Leu Glu Ala Gln Glu Ala Leu Asn Lys

85 90 95

Glu Lys Asn Gln His Asp Asp Val Lys Lys Gln Leu Ile Asp Ile Gln

100 105 110

Leu Gln His Asn Ser Leu Lys Leu Glu His Arg Lys Ala Leu Glu Thr

115 120 125

His Ser Gln Lys Tyr Ala Gln Leu Gln Gln Glu Lys Asp Ser Glu Val

130 135 140

Ser Asn Leu Val Glu Gly Asn His Leu Thr Gly Ser Ala Val Gly Ser

145 150 155 160

Gly Asp Leu Thr Ala Val Ser Cys Ser Cys Phe Thr Phe Gln Ser Pro

165 170 175

Gln Ala Gln Met Glu Glu Phe Arg Gln Leu Lys Glu Ala Leu Lys Met

180 185 190

Pro Ser Phe Lys Gly Gly Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Gln Phe Gln

195 200 205

Ala Leu Lys Glu Gln Pro Val Val Pro Ala Asn Ser Gln Leu Gln Leu

210 215 220

Gln Arg Gln Lys Ala Phe Pro Val Asn Gln Glu Asn Arg Pro Gly Gly

225 230 235 240

Asn Pro Leu Ala Ser Gln Val Ser Gln Val Gln Lys Gln Ala Gln Ala

245 250 255

Asp Gly Pro Leu Leu Gln Gln Gln Asn Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Pro

260 265 270

Arg Pro Gln Ala Asn Val Ile Phe Thr His Pro Ala Pro Leu Gln Asp

275 280 285

Ala Asn Ser Leu Pro Gln Ala Val Pro Ala Trp Pro Ala Arg Arg Gly

290 295 300

Asp Gly His Val Ile Arg Phe Thr Arg Thr Met Asn Ser Leu Pro Asn

305 310 315 320

Gly Asn Pro Asp Val Lys Met Val Met Arg Ile Gln Val Lys Ser Asn

325 330 335

Glu Glu Ser Gln Ala Pro Gly Leu Ser Pro Ser Asp Leu Lys Gln Pro

340 345 350

Ser Ala Ala Asp Lys Pro Gln Leu Pro Glu Ser His His Ser Pro Gln

355 360 365

Asn Lys Pro Val Gln Met Gln Arg Cys Pro Gly Gly Gly Gly Gly His

370 375 380

His His His

385

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ser Ser Glu Thr Met Lys Thr Ile Arg Ile Ile Thr Phe Ile Phe Phe

1 5 10 15

Ser Tyr Val Lys Cys Gln Thr Ile Gln Ser Ser Phe Ile Asp Ala Ala

20 25 30

Met Gln His Thr Asn Ser Gln Asn Tyr Leu Glu Glu Asn Leu Arg Asp

35 40 45

Met Tyr Ile Thr Glu Thr Ser Arg Lys His Pro Phe Ile Thr Gly Pro

50 55 60

Thr Ile Ile Thr Met Ser Ala Cys Tyr Glu Thr Ala Ile Gln Ser Cys

65 70 75 80

Cys Gln Glu Glu Asn Lys Thr Glu Cys Phe Gln Ile Lys Leu Glu Pro

85 90 95

Ile Arg Lys Thr Ile Lys Glu Ile Ser Ile Arg His His His Ile Cys

100 105 110

Glu Ile Gly Ile Lys Phe His Lys Val Ala Lys Ala Val Glu Leu Val

115 120 125

Leu Leu Thr Lys Lys Gln Pro Lys Ala Asn Phe Ser Glu Ile Ala Lys

130 135 140

Leu Ala Ile Asp Ile Lys Asn Leu His Glu Thr Cys Cys Asp Gly Asn

145 150 155 160

Ala Val Ala Val Phe Gly Arg Ser Gln Leu Met Asn Tyr Thr Cys Ser

165 170 175

Lys Gln Ala Ile Leu Ser Ser Lys Ile Thr Pro Cys Cys Ala Leu Pro

180 185 190

Ala Pro Phe Arg Gly Glu Cys Ile Ile Asn Ser Glu Asn Asp Glu Lys

195 200 205

Pro Asp Leu Ser Ser Gly Pro Leu Ser Arg Phe Thr Glu Asp Arg Phe

210 215 220

Val Cys Lys Gln Phe Thr Asp Lys Gln Asp Asp Phe Leu Gln

225 230 235

Claims

1.肝癌肿瘤标志物AFP、甲胎蛋白异质体、GP73抗原同步免疫检测试剂盒，其特征在于：

包括：

微孔板；

第一容器，其中容纳GP73抗体标记的磁微粒；

第二容器，其中容纳AFP抗体标记的磁微粒；

第三容器，其中容纳LCA-BSA标记的磁微粒；

第四容器，其中容纳AFP、GP73抗体偶联混合的吖啶酯；

分别容纳不同浓度GP73抗原校准品的若干容器1，所述若干容器1包括第5.1容器、第5.2容器、第5.3容器、第5.4容器和第5.5容器；

分别容纳不同浓度AFP抗原校准品的若干容器2，所述若干容器2包括第6.1容器、第6.2容器、第6.3容器、第6.4容器和第6.5容器；

分别容纳有校准品稀释液、洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器；所述洗液为磷酸盐缓冲液，内含吐温20；所述第一激发液为内含H₂O₂的硝酸溶液；所述第二激发液为NaOH溶液；所述磁微粒稀释液和吖啶酯偶联物稀释液均为内含牛血清白蛋白和吐温20的磷酸缓冲液；

其中，所述GP73抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1；所述AFP抗原的氨基酸序列如SEQID NO：2；

所述磁微粒是粒径2.8μm的含有甲苯璜酰基团的磁微粒；

所述AFP、GP73抗体偶联混合的吖啶酯是将GP73多克隆抗体标记吖啶酯和AFP单克隆抗体标记吖啶脂等比例混合后获得；

所述LCA-BSA是由牛血清蛋白第五片段标记的LCA；

所述吖啶酯为吖啶琥珀酰亚胺酯；

所述校准品稀释液的配方为：磷酸氢二钠2.96g/L、磷酸二氢钠0.29g/L、氯化钠9.0g/L、吐温20 1.0mL/L、ProcoLin 300 1.0mL/L和300ml/L小牛血清；所述洗液的配方为：0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液、体积分数为0.05%的吐温20；所述第一激发液的配方为：0.05M硝酸溶液、体积分数为0.15%的H₂O₂；所述第二激发液的配方为：0.2M NaOH溶液；所述磁微粒稀释液的配方为：0.01M pH7.4磷酸缓冲液、质量体积百分数为0.5%的牛血清白蛋白和体积分数为0.1%的吐温20；所述吖啶酯偶联物稀释液的配方为：0.02M pH7.4磷酸缓冲液、质量体积百分数为1%的牛血清白蛋白和体积分数为0.1%的吐温20。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述分别容纳不同浓度GP73抗原校准品的若干容器，包括：（1）第5.1容器，其中容纳浓度为50 ng/mL GP73抗原校准品S1；

（2）第5.2容器，其中容纳浓度为100 ng/mL GP73抗原校准品S2；

（3）第5.3容器，其中容纳浓度为250 ng/mL GP73抗原校准品S3；

（4）第5.4容器，其中容纳浓度为500 ng/mL GP73抗原校准品S4；

（5）第5.5容器，其中容纳浓度为1000 ng/mL GP73抗原校准品S5。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述分别容纳不同浓度AFP抗原校准品的若干容器，包括：

（1）第6.1容器，其中容纳浓度为5 ng/mL AFP抗原校准品S1；

（2）第6.2容器，其中容纳浓度为25 ng/mL AFP抗原校准品S2；

（3）第6.3容器，其中容纳浓度为100 ng/mL AFP抗原校准品S3；

（4）第6.4容器，其中容纳浓度为300 ng/mL AFP抗原校准品S4；

（5）第6.5容器，其中容纳浓度为600 ng/mL AFP抗原校准品S5。