CN102081100B - 一种肝癌多标志物微阵列试剂盒、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肝癌早期诊断用的蛋白微阵列试剂盒其制备方法及应用。本发明的试剂盒可用于监测慢性肝炎的发展水平和预后，还可用于肝癌的早期诊断。使用本发明的试剂盒对甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、高尔基蛋白GP73、高尔基蛋白GP73异质体表达水平进行监测，还能确定患者的预后水平及引发肝硬化和肝癌的几率，为肝癌和肝炎的预防、诊断、治疗提供直接的支持。

Description

一种肝癌多标志物微阵列试剂盒、其制备方法及其应用

技术领域

     本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明提供了一种针对甲胎蛋白及其异质体、高尔基蛋白GP73及其异质体的蛋白微阵列检测试剂盒其制备方法和应用。利用该试剂盒可以快速、准确地计算人体外周血中的甲胎蛋白及其异质体、高尔基蛋白GP73及其异质体的表达含量。

背景技术

    肝细胞癌HCC(hepatocellular carcinoma)主要的病因学是HBV或HCV慢性肝病毒感染，在肝癌发生前一般有长时间的潜伏期--即感染肝病毒至肝癌发生时间。据2006年1月26日《中国医药报》报道以及《癌症》2005年第六期中文章的介绍，我国现有乙肝病毒携带者1.2亿左右，约占世界乙肝病毒携带者的1/3；有症状的慢性乙肝患者2000万人，另外我国还有肝硬化患者360万人。由于众多的肝病患者和肝癌高危人群，我国的肝细胞癌发病率最高。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)估计，2000年全世界肝癌发病人数为56.4万，死亡54.9万人；我国肝癌发病人数30.6万，死亡30.0万人，约占全世界的50％。

    在高危人群中建立早期诊断和监测机制是非常重要的。早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键，而大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，高危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。另外要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。

    目前，HCC疾病传统上的监测是体检，肝超声影象分析和血清标志物系列检测。

    其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白AFP，由于甲胎蛋白AFP具有与HCC的相对特异性，因此目前得到广泛应用，但是部分良性肝病中AFP为阳性 (特异性≤75％)和部分肝癌中AFP为阴性(灵敏度≤70％)，使得依靠AFP 进行 HCC预警和监测具有一定的局限性，而且AFP检测对于HCV相关的HCC灵敏度不高。因此在临床上希望获得比甲胎蛋白特异性和灵敏度更高的新血清学指标， 或者能够与AFP 进行互补的指标。

    凝集素是一类广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。

    凝集素可与糖专一性地结合。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类：D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-岩藻糖；麦胚凝集素(WGA)可专一结合唾液酸。

    随着生物化学及其相关分析技术的进展与应用，发现AFP分子与外源性凝集素的亲和力不同，即存在不均一性的糖链异质性。应用不同的凝集素亲和电泳可以把它们分成若干个组分，也可以用等电聚焦技术来分离AFP 组分。AFP通过LCA亲和电泳可以分为三个部：AFP-L1(LCA非结合型)、AFP-L2(LCA弱结合型)、AFP-L3(LCA强结合型)。AFP-L1，来自良性肝病，是AFP的主要组分；AFP-L2来自孕妇；AFP-L3为HCC细胞所特有。因此由肝癌细胞合成、分泌的含岩藻糖苷化糖链的AFP异质体称为肝癌特异性AFP(AFP-L3) 。

     早在1970年，就有学者发现肝细胞癌患者血清AFP 淀粉凝胶电泳时常出现不同的迁移率，而新生儿、胎儿的AFP 电泳迁移率相同。当时认为系AFP所含的唾液酸含量不同所致，并提出AFP 异质体(AFP Variants AFP-V)的概念。 随后的研究表明，AFP 的糖链结构存在不同程度的变异，而所谓的异质性主要是因为AFP所含碳水化合物不同所致。AFP异质体形成的确切机制还不十分清楚， 其过程可能是这样的：增生的肝细胞及肝癌细胞于G1期和S期合成AFP，并将其分布于核周、内质网腔及高尔基分泌小囊中，位于粗面内质网及高尔基体中的AFP在糖基化转移酶参与下受到不同的糖基化修饰后分泌到循环中。由于糖基化的不同，导致了AFP异质性的差异。另一可能的原因是糖基化转移酶异常造成糖基化后AFP构象的改变。AFP的糖链结构能与多种凝集素相作用，与不同凝集素结合的AFP分子结构蛋白部分基本相同，但糖链部分有所差异。不同的糖链决定其与凝集素的亲和力。根据亲和性的不同，可将AFP 异质体分为不同类型，如扁豆凝集素(LCA)亲和型、豌豆凝集素不亲和型，刀豆凝集素(ConA)亲和型和ConA不亲和型。另有一种分类方法是将电泳获得的区带从阳极开始以1、2、3编号，结合凝集素进行命名。如使用 LCA 则命名为AFP-L1(LCA非结合型)、AFP-L2(LCA弱结合型)、AFP-L3(LCA强结合型)；国内外研究已经证明AFP-L3是由肝癌细胞特异产生的。

    AFP异质体许多糖链的结构尚未完全明了。与LCA相结合的基础是 AFP 糖链岩藻糖基化(LCA与岩藻糖有较强的亲和力)，由于胚胎期AFP几乎无岩藻糖成分，因而可以认为这种分子糖链的异常是糖基化异常的反映。AFP-L3与LCA 的结合位点是门冬酰胺连接的岩藻糖化的N-乙酰葡萄糖胺。含岩藻糖苷化糖链的AFP异质体是肝细胞特异分泌的，称为肝癌特异性AFP(AFP-L3)。

    目前认为，通常所说的AFP异质体实际是指与LCA 结合的AFP-L3，1999年第四届全国肝癌学术会议将其列为原发性肝癌临床诊断标准的肝癌标记物之一。被公认为是比单纯的AFP甲胎蛋白更为特异的原发性肝癌指标。

    AFP异质体检测的临床意义：鉴别肝癌与良性肝病。原发性肝癌患者AFP常升高，但许多良性肝脏疾病也可有AFP升高，单凭AFP结果有时很难区分良、恶性病变。此时AFP异质体检测就具有良好的临床意义，尤其对于AFP在30～ 400ng/ml之间者具有较好的价值。Yozhiaki对361 例肝硬化进行了前瞻性研究，在53例AFP在30ug/L以上的患者中，2年以后21例发展为肝癌，确诊肝癌时39％的患者AFP在400ug/L以下。对比研究开始时肝细胞肝癌(HCC)组与非HCC 组AFP测定值，未发现差异有显著性，研究发现病变时AFP 异质体的类型有所不同，对HCC诊断LCA阳性率87.12％假阳性率21.5％，ConA阳性率89.17％，假阳性率17.15％。目前的研究结果把AFP-L3含量大于15％作为肝癌的阳性指标。

    GP73(Golgi Protein73)是一种II型高尔基跨膜蛋白，也是一种新发现的与肝病病程相关的蛋白。GP73的分子量接近73KD(Kladney et al.，2000，Gene 249， 53-65)。GP73在病毒性感染的肝细胞中高表达(Kladney, et al.，2000，Gene 249， 53-65)，在胆汁上皮细胞中也有表达，而在正常肝细胞中表达量很少。相反的，肝病患者的肝细胞显示对GP73抗体的强免疫反应。GP73mRNA和蛋白在转染各种病毒(包括腺病毒)后的HepG2肝恶性肿瘤细胞中也有高表达。在患有病毒性肝病或非病毒性促成肝病如酒精性肝病，自身免疫性肝病等的患者中，GP73的表达量显著升高(Kladney，et al.，2002，Hepatology 35(6)：1431-40)。

    2005年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)资助的一个课题组论证了GP73作为肝癌早期诊断指标的应用。对于早期肝癌的检测，GP73的灵敏度比AFP高出2-3倍，被认为是未来最有希望的一个肝癌预警新指标。对352例肝病患者的研究显示，GP73对HCC诊断的灵敏度为69％，特异性为75％。而其对早期肝癌诊断的灵敏度为62％，显著高于AFP(25％)。AFP低于20ng/ml的HCC患者中，有超过一半(57％)的患者GP73升高，提示GP73对HCC早期诊断，尤其是AFP阴性的早期HCC的诊断具有显著的优越性。

    而相关研究也显示高尔基体蛋白异质体FUC-GP73比GP73的特异性更高，报道称特异性可到95％，灵敏度也可达到更高，而这种异质体也是核心岩藻糖基化。

    本发明的目的正是为了提供一种微阵列蛋白组合，可以同时测定 AFP\AFP-L3\GP73\FUC-GP73，提供了一种高灵敏度的肝癌蛋白芯片检测试剂盒，该试剂盒操作简便、准确灵敏，以便能尽早采取有效的综合治疗方案，预防肝硬化和肝癌的发生。

发明内容

    为了解决上述技术问题，在本发明的第一方面，提供了一种4个联合肝癌早期诊断指标的微阵列蛋白芯片制备方法，其试剂盒包括化学发光法和酶免斑点法。

    使用本发明的单克隆抗体和检测试剂盒，可以快速对外周血中甲胎蛋白 AFP、甲胎蛋白异质体AFP-L3、高尔基体蛋白GP73、高尔基体蛋白异质体 FUC-GP73的含量进行判断，进而对肝癌早期诊断作出判断。

附图说明

图1 微阵列包被板示意图，其中ABCD条包被AFP单抗，EFGH条包被GP73 单抗，测试时候，AB条加入AFP-HRP酶，CD条加入LCA-HRP；EF条加入GP73单抗-HRP 酶，GH 条加入LCA-HRP ；

图 2 微阵列斑点法示意图，其中A、C点包被AFP单抗；BD点包被GP73单抗；1# 图为点膜微阵列分布，2#图为反应后的可能形式之一(任一斑点为阳性)；

    图1为AFP/AFP-L3/GP73/FUC-GP73 4个联合指标的微阵列微孔板排布方式。

    图2为 AFP/AFP-L3/GP73/FUC-GP73 4个联合指标的微阵列膜斑点法排方式。

具体实施方式

    本发明提供了一种针对AFP\AFP-L3\GP73\FUC-GP73的化学发光酶免微阵列定量检测试剂盒。

    本发明还提供了一种针对 AFP\AFP-L3\GP73\FUC-GP73 的膜斑点酶免微阵列快速检测试剂盒。

    在本发明的某些优选实施方案中，上述试剂盒还可以含有酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记凝集素LCA和辅助试剂。其中对于化学发光检测试剂盒，所述辅助试剂中可含有发光底物luminol(鲁米诺)。对于膜斑点法试剂，显色底物含有4-氯-1-乙萘酚；在本发明的另一些优选实施方案中，所述单克隆抗体是包被在酶标板上或硝酸纤维素膜上的。

    在本发明的具体实施方案中，还提供了上述试剂盒的制备方法，所述方法包括抗体包被板的制备、酶标抗体的制备以及辅助试剂的配制。

    本发明试剂盒中的甲胎蛋白单抗、酶标记甲胎蛋白单抗、高尔基体蛋白单抗、酶标高尔基体蛋白多抗购买自SIGMA 公司，凝集素LCA购买自北京热景生物技术有限公司。

    在本发明的化学发光试剂盒中，辅助试剂可包括化学发光反应底物溶液、显色液和样本稀释液，一种上述试剂盒的辅助试剂如下：

    1)底物溶液A：EDTA(1. 0×10^-2M)、H₂O₂(7.5×10-3M)、HCl(1.0×10-2M) 和Tween20(1％)。

    2)显色液B：50mM pH9.6 碳酸盐缓冲液，含鲁米诺luminol5.0× 10^-4Mol/L；

     3)样本稀释液：含2％BSA的20mM  pH7. 4PBS 缓冲液

    本发明还提供了使用上述化学发光试剂盒检测AFP\AFP-L3\高尔基蛋白GP73\FUC-GP73的方法，所述方法包括下述步骤 ：

     a)包被：在96孔的ABCD孔条上包被AFP单抗，每孔为200ng/ml，在 EFGH孔条上包被GP73单抗，包被步骤为将单抗按照每孔200ng/ml的浓度稀释到50mmol/L的pH9.6碳酸缓冲液中，4度过液，然后取出用2％BSA封闭即可用。

    b)将孔条用彩色进行划分，做成微阵列排布，AB 条为红区、CD为绿区、EF区为黄区、GH区为白区。

    c)单抗捕获抗原反应：在试剂盒提供的抗体包被板的相对应微孔中分别加入100μl样本稀释液，然后加入10μl待测血清样品，37℃水浴保温30分钟，洗板。共4孔反应，分别为Al、Cl、El、Gl；

    d)将AFP-单抗-HRP溶液加入Al，将LCA-HRP溶液加入Cl孔、将GP73 单抗-HRP溶液加入El 孔每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。

     A 显色反应：每孔依次加入底物溶液 A，显色液B各50μl，读值。

   本发明还提供了应用膜斑点法检测AFP\AFP-L3\高尔基蛋白 GP73\FUC-GP73的方法，所述材料和方法包括下述步骤：

     A)点膜：硝酸纤维素膜(密里博公司)NC膜制成4×4mm的正方形，用10μl微量移液器在膜片4个区域(如附图2)滴加单抗。膜片室温干燥后放入含1％ BSA的0.01mol/L pH7. 4PBS中37℃作用30分钟，用PBST(0.01mol/L pH7.4PBS 中加入0.05％的Tween-20)洗3次，每次3分钟。凉干后即为快诊膜，置4℃冰箱干燥密封保存。装入壳体后，AB两孔为上半部，CD两孔为下半部。AB 两孔液体无法流入CD两孔。

     B)加样：加入血清40UL

     C)洗涤：PBST洗涤2次

     D)加酶：酶标稀释液1(2％BSA，PBST，pH7.4，含抗AFP单抗-HRP、抗 GP73单抗-HRP)加入膜的上半部分(AB两处)，酶标稀释液2(2％BSA，PBST，pH7. 4，含抗LCA-HRP)加入膜的下半部分(CD两处)

    E)底物：加入9mg 4-氯-1-萘酚(SIGMA 公司)溶于3ml无水甲醇中再加入 10ml PBST混匀，临用前加入4μl双氧水，摇匀使用。

     F)判断：显色为阳性，任一阳性为肝癌高危人群。

     实施例1：本发明的化学发光定量酶联免疫检测试剂盒的质量检测

     1)准确性：15 份正常体检阴性质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，无假阳性出现。10份肝癌HCC阳性质控血清的参考品检测结果无假阴性出现。

    2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份HCC抗原阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV15％。

     3)检测灵敏度：本试剂盒的检测灵敏度为5ng/ml。

     4)特异性：取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按实施例3中所述的方法进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于1.5％。

     5)回收率：用由浓度为20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml的标准品所检测得到的吸光度回归标准曲线得到的值进行回收率比较，回收率在89-132％之间。

     实施例 2：肝癌多标志物微阵列化学发光试剂盒的制备

     本实施例制备了一种本发明的肝癌多标志物微阵列化学发光试剂盒(96人份)，其组成包括：

     AFP/GP73单克隆抗体包被板(96孔)1块；

     辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP抗体1瓶、辣根过氧化物酶(HRP)标记GP73多克隆抗体1瓶，辣根过氧化物酶(HRP)标记的凝集素LCA溶液1瓶，分别为10ml/瓶；

    底物溶液1瓶：EDTA(1.0×10-2M)、H₂O₂(7.5×10-3M)、HCl(1.0×10-2M) 和Tween20(1％)

    显色液1瓶：luminol 5. 0×10-4Mol/L；

    样本稀释液 1瓶：含2％BSA的20mM pH7.4PBS缓冲液

    具体操作如下 ：

    1.制作AFP/GP73单克隆抗体包被板：

    酶标板采用Costar公司生产的12×8可拆条板。将步骤1)所述单克隆抗体用0.05mol/L，pH9.5的碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入化学发光板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液(PBST溶液，包含20mmol/LPBS，0.5％ Tween-20，pH7.4)洗板，再用该封闭液缓冲液(2%BSA，PBST溶液配制)封闭过夜， 甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被化学发光板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭。AFP单抗包被于ABCD条，GP73单抗包被于EFGH条；

    2.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP单抗、抗GP73多克隆抗体、凝集素LCA溶液

    按每毫升 10ng含量稀释于2％BSA 溶液中；

    3.配制底物溶液：EDTA(1.0×10^-2M)、H₂O₂(7.5×10^-3M)、HCl(1.0×10^-2M) 和Tween20(1%)；按5ml/瓶分装。

    4.配制显色液B：20mM pH7.4PBS缓冲液，含luminol5.0×10^-4Mol/L；按 5ml/瓶分装。

    5. 配制清洗缓冲液(20×浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。

    实施例3：肝癌多标志物微阵列化学发光免疫检测试剂盒的使用方法

    a) 单抗捕获抗原反应：在试剂盒提供的抗体包被板的相对应微孔中分别加入100μl样本稀释液，然后加入10μl待测血清样品，37℃水浴保温30分钟，洗板。共4孔反应，分别为Al、Cl、El、Gl；

    d)将AFP-单抗-HRP溶液加入Al，将LCA-HRP溶液加入Cl孔、将GP73单抗-HRP溶液加入El孔每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。

    c)显色反应：每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，读值。

    实施例4：本发明GP73定量酶联免疫检测试剂盒对临床血清样品的检测

    取解放军第302医院临床血清标本：120 份已知肝癌阳性标本、120 份体检健康血清和 80份慢性肝炎。检测结果见表1。

    表 1

    从以上结果可以看出，采用微阵列联合检测，不仅方便，而且灵敏度明显提高，而此时特异性没有显著变化。

   实施例5：酶免膜斑点法快速检测AFP\AFP-L3\高尔基蛋白 GP73\FUC-GP73的方法，包括下述步骤：

     A)点膜：硝酸纤维素膜(密里博公司)NC膜制成4×4mm的正方形，用10μl微量移液器在膜片4个区域(如附图2)滴加单抗。膜片室温干燥后放入含1％ BSA的0.01mol/L pH7.4PBS中37℃作用30分钟，用PBST(0.01mol/L pH7.4PBS 中加入0.05％的Tween-20)洗3次，每次3分钟。凉干后即为快诊膜，置4℃冰箱干燥密封保存。

    B)加样：加入血清 40UL

    C)洗涤：PBST洗涤2次

    D)加酶：酶标稀释液1(2％BSA，PBST，pH7.4，含抗AFP单抗-HRP、抗GP73单抗-HRP)加入膜的上半部分(AB两处)，酶标稀释液2(2％BSA，PBST，pH7.4，含抗 LCA-HRP)加入膜的下半部分(CD两处)

    E)底物：9mg 4-氯-1-萘酚溶于3ml无水甲醇中再加入10ml PBST混匀，临用前加入4μl双氧水，摇匀使用。加入ABCD孔。     F)判断：棕色斑点者为阳性，任一阳性为肝癌高危人群。

Claims (6)

1.一种肝癌多标志物微阵列试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测外周血中甲胎蛋白AFP、甲胎蛋白异质体AFP-L3、高尔基体蛋白GP73、高尔基体蛋白异质体FUC-GP73；

上述试剂盒含有酶标板，辣根过氧化物酶标记的AFP单抗，辣根过氧化物酶标记的GP73多抗或单抗，辣根过氧化物酶标记凝集素LCA和辅助试剂；其中AFP单克隆抗体、GP73单克隆抗体分别包被在酶标板上或硝酸纤维素膜上。

2.根据权利要求1所述的肝癌多标志物微阵列试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括化学发光酶免微阵列定量检测试剂盒和膜斑点酶免微阵列快速测试试剂盒。

3.根据权利要求2所述的肝癌多标志物微阵列试剂盒，其特征在于：所述膜斑点法酶免微阵列试剂盒的显色底物含有4-氯-1-萘酚。

4.根据权利要求2所述的肝癌多标志物微阵列试剂盒，其特征在于：所述化学发光酶免微阵列试剂盒的辅助试剂含有发光底物鲁米诺luminol。

5.根据权利要求2所述的肝癌多标志物微阵列试剂盒，其特征在于：上述化学发光试剂盒中的辅助试剂包括化学发光反应底物溶液、显色液和样本稀释液，其中底物溶液为：1.0×10^-2M的EDTA、7.5×10^-3M的H₂O₂和1%的Tween20，显色液为：50mM pH9.6碳酸盐缓冲液、鲁米诺luminol5.0×10^-4mol/L，样本稀释液为：含有2%BSA的20mM pH7.4 PBS缓冲液。

6.权利要求2所述肝癌多标志物微阵列试剂盒中化学发光反应试剂盒的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

(1)、制作AFP/GP73 单克隆抗体包被板，采用Costar公司生产的12×8可拆条板；将克隆抗体用0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入化学发光板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被化学发光板；

按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭；

AFP单抗包被于ABCD 条，GP73单抗包被于EFGH 条；

(2)、制备辣根过氧化物酶标记的AFP 单抗、辣根过氧化物酶标记的GP73多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的凝集素，按每毫升10ng含量稀释于2% BSA溶液中；

(3)、配制底物溶液：EDTA 1.0×10^-2M、H₂O₂ 7.5×10^-3M、HCl 1.0×10^-2M和1%的Tween20，按5ml/瓶分装；

(4)、配制显色液B：20mM pH7.4PBS缓冲液，含鲁米诺luminol 5.0×10^-4 mol/L；按5ml/瓶分装；

(5)、配制清洗缓冲液：pH为7.4的PBS配制的1%Tween20溶液，按15ml/瓶分装。