CN104698174A - 一种胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ联合检测试剂盒 - Google Patents

一种胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ联合检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104698174A
CN104698174A CN201510091154.0A CN201510091154A CN104698174A CN 104698174 A CN104698174 A CN 104698174A CN 201510091154 A CN201510091154 A CN 201510091154A CN 104698174 A CN104698174 A CN 104698174A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
kit
antigen
nucleotide sequence
recombinant protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510091154.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104698174B (zh
Inventor
杨雷
刘扬
刘琴
代丽
陶恒平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Yi Ruoweisheng Bioisystech Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Yi Ruoweisheng Bioisystech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Yi Ruoweisheng Bioisystech Co Ltd filed Critical Jiangsu Yi Ruoweisheng Bioisystech Co Ltd
Priority to CN201510091154.0A priority Critical patent/CN104698174B/zh
Publication of CN104698174A publication Critical patent/CN104698174A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104698174B publication Critical patent/CN104698174B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒，包括已包被抗PGⅠ和PGⅡ抗体的酶联板，抗PGⅠ抗体是将PGⅠ抗原部分基因序列PGⅠ-A和PGⅠ-B分别通过基因工程克隆表达得到PGⅠ-A和PGⅠ-B重组蛋白，并将其免疫小鼠制备得到单克隆抗体；PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；抗PGⅡ抗体是将PGⅡ抗原基因序列通过基因工程克隆表达得到PGⅡ重组蛋白，并将其免疫小鼠制备得到单克隆抗体，PGⅡ抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.3。本发明的试剂盒可同时检测PGⅠ和PGⅡ，操作简单，检测快速。

Description

一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒。
背景技术
胃癌是全球高危死亡率的第二大疾病，严重威胁着人类健康。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居各种恶性肿瘤前列，全球每年934,000新发胃癌病例，42%（近40万）的新发病例数在我国，胃癌在我国的患病率和死亡率均是世界水平的2倍多。其早期诊断、早期治疗是提高患者生存质量、降低死亡率的唯一途径，改善胃癌患者预后的关键是作好二级预防，血清PG检测可以作为胃癌筛查“二步法”中的初筛方法。近年来，血清PG 含量的变化与胃癌及其他胃部疾病的关系及其作为初筛手段在胃癌筛查中的应用已引起越来越多研究者的关注。联合测定PGⅠ 和PGⅡ的水平及其比值可起到胃黏膜“血清学活检”的作用，有利于胃癌的预防干预、早期诊断以及术后复发预测。
PG（PG）是一种门冬氨酸蛋白酶前体，是分子质量为42KDa的单链多肽。人类PG依其电泳迁移率可以分为7个组分，1-5组分的免疫原性相同，称为PGⅠ（PGⅠ）,主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6-7被称为PGⅡ（PGⅡ），除由胃体和胃底黏膜的泌酸腺的主细胞分泌外，泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PGⅡ。由于胃几乎是PG的唯一来源，并且在分泌阶段的分泌量会发生变化，因此，血清PGⅠ和PGⅡ不仅反映了胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。
通常情况下约有1%的PG通过胃黏膜进入血液循环，进入血液循环的PG在血液中非常稳定。血清PG水平是反映胃黏膜形态和功能的良好指标。大部分酶原进入胃腔，经酸解成具有活性的胃蛋白酶发挥其消化蛋白质的作用。但也有少量透过胃黏膜毛细血管进入血液，可从血清中检测。当胃粘膜发生病变时，血清中PG的含量也随之发生改变。血清PG含量的变化与胃癌及其他胃部疾病的关系及其作为初筛手段在胃癌筛查中的应用已引起越来越多研究者的关注。研究发现，在常规体检中大约有15%左右的人的血清PG水平异常，而进一步进行胃镜检查，其中90%以上的患者有不同程度的浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等胃部疾病。近年来，血清PG含量的变化与胃癌及其他胃部疾病的关系及其作为初筛手段在胃癌筛查中的应用已引起越来越多研究者的关注。
发明内容
本发明提供了一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒，可同时检测PGⅠ和PGⅡ两个项目，检测结果可用于胃部疾病的初筛。
本发明提供一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒，包括已包被抗PGⅠ和PGⅡ抗体的酶联板，所述抗PGⅠ抗体是将PGⅠ抗原部分基因序列PGⅠ-A和PGⅠ-B分别通过基因工程克隆表达得到PGⅠ-A和PGⅠ-B重组蛋白，并利用克隆表达的重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体；所述PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，所述PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；所述抗PGⅡ抗体是将PGⅡ抗原基因序列通过基因工程克隆表达得到PGⅡ重组蛋白，并利用克隆表达的PGⅡ重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体，所述PGⅡ抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.3。
优选地，所述试剂盒还包括酶标抗体，所述酶为辣根过氧化物酶，所述抗体为PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ的单克隆抗体。
优选地，所述试剂盒还包括酶标抗体稀释液，所述稀释液的配方为：0.1M Tris盐酸缓冲液，0.1%-1%BSA，0.5%-2.0%酪蛋白，1%-6%（NH4）2SO4，1%-5%SDS，0.1%-1%甘油，0.01%-0.1%DDT，5-10%蔗糖，pH8.5。
优选地，所述包被时的包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6；包被浓度为5μg/ml。
优选地，封闭所述抗PGⅠ和PGⅡ抗体时使用的封闭液为：0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA，2.0%酪蛋白；封闭液的pH值为7.4。
本发明还提供应用上述试剂盒联合检测胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的方法，步骤如下：
（1）在微孔板反应孔中分别加入10μl校准品、质控品和待测样本，再加入90μl稀释的酶标抗体，混匀；
（2）37℃孵育45分钟；洗涤；
（3）加入底物显色，加入终止液，在酶标仪上读取OD450数值，绘制胃蛋白酶原Ⅰ标准曲线和胃蛋白酶原Ⅱ标准曲线，根据胃蛋白酶原Ⅰ标准曲线和胃蛋白酶原Ⅱ标准曲线计算待测样本中胃蛋白酶原PGⅠ和PGⅡ具体含量。
优选地，步骤（1）中酶标抗体的稀释倍数为1000倍。
本发明的第三个目的是提供PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ在制备联合检测胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ在联合检测胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ中的应用。
本发明基于双抗夹心方法，利用抗原抗体特异性反应来检测血清中PGⅠ和PGⅡ的含量。本发明运用酶联免疫一步法快速检测技术，使用以0.1M碳酸盐缓冲液（pH9.6）为包被液制备的微孔板和加速抗原抗体反应的酶标抗体稀释液，使一步法反应快速、充分，从而达到快速、高灵敏度、特异性好级量程宽的目的。
本发明试剂盒使用特异性的抗体和抗原，从而能够将PGⅠ和PGⅡ两个项目整合到一个检测试剂盒，使得除微孔板外所有试剂组分都整合后通用，所以一个试剂盒可同时检测PGⅠ和PGⅡ两个项目，操作简单，检测快速，便于临床使用；本发明试剂盒灵敏度高，检测灵敏度达0.1μg/L；量程宽，检测样本不需要稀释；检测时间短，整个检测时间为1小时，比现有市场上同类产品检测时间缩短45-60分钟；检测样本需求量少，一次上样只需要50μl，比目前市场上同类产品上样量减少一倍。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为胃蛋白酶原PGⅠ的标准曲线；
图2为胃蛋白酶原PGⅡ的标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
本发明的胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ联合检测试剂盒由以下组分组成：
1、包被抗PGⅠ抗体的微孔板，制备方法如下：
（1）抗PGⅠ抗体的制备：将PGⅠ抗原部分基因序列PGⅠ-A和PGⅠ-B分别通过基因工程克隆表达得到PGⅠ-A和PGⅠ-B重组蛋白，并利用克隆表达的重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体；PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；两条核苷酸序列分别按照上述方法制备得到单克隆抗体后，以1:1的质量比混合；
（2）抗PGⅠ抗体的包被：用包被机或移液器将包被缓冲液按100μl/孔加入微孔板；用盖板膜封闭微孔板，放置于4℃冰箱过夜；用稀释后的0.05M洗涤液洗板5次。其中，包被缓冲液为：0.1M碳酸盐缓冲液（pH9.6）；包被浓度为5μg/ml；
（3）抗PGⅠ抗体的封闭：用包被机或移液器将封闭液按300μl/孔加入微孔板；盖板膜封闭微孔板，放置于37℃封闭1小时；用稀释后的0.05M洗涤液洗板5次。其中，封闭液为：0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA，2%酪蛋白（pH7.4）；
（4）真空包装：将上述处理后的微孔板放置于37℃烘箱干燥0.5小时；立即用真空封装机进行真空包装。
2、包被抗PGⅡ抗体的微孔板，制备方法如下：
（1）抗PGⅡ抗体的制备：将PGⅡ抗原的全部基因序列通过基因工程克隆表达得到PGⅡ重组蛋白，并利用克隆表达的PGⅡ重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体，PGⅡ抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.3；
（2）抗PGⅡ抗体的包被：用包被机或移液器将包被缓冲液按100μl/孔加入微孔板；用盖板膜封闭微孔板，放置于4℃冰箱过夜；用稀释后的0.05M洗涤液洗板5次。其中，包被缓冲液为：0.1M碳酸盐缓冲液（pH9.6）；包被浓度为5μg/ml；
（3）抗PGⅡ抗体的封闭：用包被机或移液器将封闭液按300μl/孔加入微孔板；盖板膜封闭微孔板，放置于37℃封闭1小时；用稀释后的0.05M洗涤液洗板5次。其中，封闭液为：0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA，2.0%酪蛋白（pH7.4）；
（4）真空包装：将上述处理后的微孔板放置于37℃烘箱干燥0.5小时；立即用真空封装机进行真空包装。
3、酶标抗体：PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ的单克隆抗体，标记的酶为辣根过氧化物酶；PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；PGⅡ为PGⅡ抗原的全部基因序列，具体参见SEQ ID No.3。
4、酶标抗体稀释液：0.1M Tris盐酸缓冲液，0.1%-1%BSA，0.5%-2.0%酪蛋白，1%-6%（NH4）2SO4，1%-5%SDS，0.1%-1%甘油，0.01%-0.1%DDT，5-10%蔗糖，pH8.5；
通过对酶标抗体稀释液配方的优化，能够加速抗原抗体反应，从而缩短检测时间。
5、校准品：将PGⅠ抗原部分基因序列（PGⅠ抗原部分基因序列为PGⅠ-A和PGⅠ-B，PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2）和PGⅡ抗原全部基因序列（参见SEQ ID No.3）通过基因工程克隆表达得到的PGⅠ和PGⅡ重组蛋白；将PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ按照一定比例混合并用校准品稀释液稀释，配制成以下浓度的校准品：
校准品浓度范围：PGⅠ为0-90μg/L，PGⅡ为0-48μg/L；具体为：
校准品1：（PGⅠ-A：0.0μg/L、PGⅠ-B：0.0μg/L、PGⅡ：0.0μg/L）
校准品2：（PGⅠ-A：15.0μg/L、PGⅠ-B：15.0μg/L、PGⅡ：6.0μg/L）
校准品3：（PGⅠ-A：35.0μg/L、PGⅠ-B：35.0μg/L、PGⅡ：12.0μg/L）
校准品4：（PGⅠ-A：60.0μg/L、PGⅠ-B：60.0μg/L、PGⅡ：24.0μg/L）
校准品5：（PGⅠ-A：90.0μg/L、PGⅠ-B：90.0μg/L、PGⅡ：48.0μg/L）
其中，校准品稀释液为：0.1M PBS，pH7.4。
6、质控品：将PGⅠ抗原部分基因序列（PGⅠ抗原部分基因序列为PGⅠ-A和PGⅠ-B，PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2）和PGⅡ抗原全部基因序列（参见SEQ ID No.3）通过基因工程克隆表达得到的PGⅠ和PGⅡ重组蛋白；将PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ按照比例混合，用校准品稀释液稀释得到质控品，质控品中各组分浓度为：PGⅠ-A：30.0μg/L、PGⅠ-B：30.0μg/L、PGⅡ：16.0μg/L。
7、底物液：0.2mg/ml过氧化脲，0.1M柠檬酸缓冲液pH5.5，TMB 0.5mg/ml，0.1% DMSO。
8、终止液：2M硫酸。
9、浓缩洗涤液：0.5M磷酸盐缓冲液，1.8%十二烷基硫酸钠，pH7.4。
10、说明书
本发明的试剂盒的检测方法如下：     （1）首先在微孔板反应孔中依次加入10μl待测样本和90μl稀释后的酶标抗体（用酶标抗体稀释液稀释酶标抗体1000倍后使用），混匀；校准品和质控品也按照上述方法加入；
（2）37℃孵育45分钟；
（3）用稀释好的洗涤液洗板5次，扣干；
（4）加入底物液100μl，盖上盖板膜，37℃温育避光显色15分钟；
（5）加入终止液50μl，然后立即用酶标仪测定450nm吸光值，绘制胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ的量为PGⅠ-A和PGⅠ-B之和）标准曲线和胃蛋白酶原Ⅱ标准曲线，根据标准曲线计算待测样本中胃蛋白酶原PGⅠ和PGⅡ具体含量。
待测样本检测结果所得OD450nm吸光值，经标准曲线计算出浓度值，浓度值参照以下范围判断：
PGⅠ正常值范围为：70-180ng/ml；
PGⅡ正常值范围为：0-16ng/ml；
PGⅠ/PGⅡ正常值范围为：≥7.0。
胃部疾病的判断：
慢性萎缩性胃炎：PGⅠ≤70且PGⅠ/PGⅡ≤7.0；
幽门螺旋杆菌感染：PGⅡ>16；
胃溃疡：PGⅠ>180且PGⅡ>16；
胃癌：PGⅠ≤30且PGⅠ/PGⅡ≤3.0。
应用本发明的试剂盒进行检测，检测结果与胃镜检查结果（金标准）相比较：慢性萎缩性胃炎的符合率为82.6%、幽门螺旋杆菌感染的符合率为78.2%、胃溃疡的符合率为67.5%、胃癌的符合率为73.8%。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>  江苏宜偌维盛生物技术有限公司
<120>  一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒
<170>  Patent In version 3.5
<210>  1
<211>  422
<212>  DNA
<213>  PGⅠ部分抗原核苷酸序列
<400>  1
atggcaccct ccctcctccc catggtgcaa ggttacaatg gaaaatgcct cagctggaaa       60
gatctcagaa tgtggctcag ggcagccaca atcttatcag gaacttctct gtatgggatc      120
agcggaaccg gtgactttca gaggccgata aggcgggacc caacttgtat ataaggggca      180
gctcatgctg ctgctctgca ccttactccc atcttgcctt ctccctcgag ttgggacccg      240
ggaagaacca tgaagtcgct gctgctgctg ggtctggtgg cgctctctga gtgcatcatg      300
tacaagtgag tccgggtggt gtgggtgtga agacgctgcc tcgcacatca cctttctttc      360
ctccgtgtct tccttcttcc ctctttggcc cctctctatt cagctgtctc catccccctt      420
tt                                                                    422
<210>  2
<211>  294
<212>  DNA
<213>  PGⅠ部分抗原核苷酸序列
<400>  2
ggtcaggaga atccttgcct aattcctgtt ccttctccaa accacagggt ccccctcatc       60
agaaagaagt ccatcaggcg caccctgtcc gagcgtggcc tgctgaagga cttcctgaag      120
aagcacaacc tcaacgcagc cagaaagtac ttcccccagt gggaggctcc caccctggta      180
gatgaacagc ccctggagaa ctacctggat gtgagtgtgt gggcaagtgg tggggccagc      240
tctgaggact tggcccgcag aaggagggtg tcccaggggt cttgaggagg gctg            294
<210>  3
<211>  1392
<212>  DNA
<213>  PGⅡ抗原核苷酸序列
<400>  3
cttcactcca ctgcgactgc agaactcaga gctgctcttc ctatgtggcc agttggggac       60
cagcatcatg aagtggatgg tggtggtctt ggtctgcctc cagctcttgg atgcagcagt      120
ggtcaaagtg cccctgcaga aatttaagtc tatccgtgag accatgaagg agaagggctt      180
gctgggggag tacctgagga cccacaagta tgatcctgct tggaagtacc gctttggtga      240
cctcagcgtg acctacgagc ccacggccta catggatgct gcctactttg gtgagatcag      300
catcgggact ccaccccaga acttcctggt ccttattgac accggctcct ccaacttgtg      360
ggtgccctct gtctaatgcc agagccaggc ctgcaccagt cactcccgct tcaaccccag      420
cgagtcgtcc acctactcta ccaatgggca gaccttctcc ctgcagtatg gcagtggcag      480
cctcaccggc ttctttggct atgacacact gactgtccag agcatccagg tccccaacca      540
ggagtgcggc ttgagtgaga atgagcctgg taccaacttc gtctatgcgc agtttgatgg      600
catcatgggc ctggcatacc ctgctctgtc cgtggatgag gccaccacag ctatgcaggg      660
catggtgcag gagcgcgccc tcaccagccc cgtcttcagc gtctacctca gcaaccagca      720
gggctccagc ggtggagcgg ttgtctttgg gggtgtggat agcagcctgt acacggggca      780
gatctactgg gcgcctgtca cccaggaact ctactggcag attggcattg acgagttcct      840
catcggcggc caggcctccg gctggagttc tgagggttgc caggccatcg tggacacagg      900
cacctctctg ctcactgtgc ctcagcagta catgagtgct cttctgcagg ccacaggggc      960
ccaggaggat gagtatggac agtctctcgt gaactgtaac agcattcaga atctgcccag     1020
cttgaccttc atcatcaatg gtgtggagtt cactctgcca ccttcctcct atatcctcag     1080
taacaacggc tactgcaccg tgggagtcga gtccacctac ctgtcctccc agaacggcca     1140
gcccctgtgg atcctcggcg atgtcttcct caggtcctac tattccgtct acgacttggg     1200
caacaacaga gtaggctttg ccactgccgc ctagacttgc tgcctcgaca cgtgagctcc     1260
cctcttcctc ttgaccctgc acgctcctag ggcattgtat ctgtctttcc actctggatt     1320
cagcctcctt tttctggact ctggactttc tctaataata aatagttctt ctttaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aa                                                        1392
序列表
<110>  江苏宜偌维盛生物技术有限公司
<120>  一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒
 
<170>  Patent In version 3.5
 
<210>  1
<211>  422
<212>  DNA
<213>  PGⅠ部分抗原核苷酸序列
 
<400>  1
atggcaccct ccctcctccc catggtgcaa ggttacaatg gaaaatgcct cagctggaaa       60
gatctcagaa tgtggctcag ggcagccaca atcttatcag gaacttctct gtatgggatc      120
agcggaaccg gtgactttca gaggccgata aggcgggacc caacttgtat ataaggggca      180
gctcatgctg ctgctctgca ccttactccc atcttgcctt ctccctcgag ttgggacccg      240
ggaagaacca tgaagtcgct gctgctgctg ggtctggtgg cgctctctga gtgcatcatg      300
tacaagtgag tccgggtggt gtgggtgtga agacgctgcc tcgcacatca cctttctttc      360
ctccgtgtct tccttcttcc ctctttggcc cctctctatt cagctgtctc catccccctt      420
tt                                                                    422
 
<210>  2
<211>  294
<212>  DNA
<213>  PGⅠ部分抗原核苷酸序列
 
<400>  2
ggtcaggaga atccttgcct aattcctgtt ccttctccaa accacagggt ccccctcatc       60
agaaagaagt ccatcaggcg caccctgtcc gagcgtggcc tgctgaagga cttcctgaag      120
aagcacaacc tcaacgcagc cagaaagtac ttcccccagt gggaggctcc caccctggta      180
gatgaacagc ccctggagaa ctacctggat gtgagtgtgt gggcaagtgg tggggccagc      240
tctgaggact tggcccgcag aaggagggtg tcccaggggt cttgaggagg gctg            294
 
<210>  3
<211>  1392
<212>  DNA
<213>  PGⅡ抗原核苷酸序列
 
<400>  3
cttcactcca ctgcgactgc agaactcaga gctgctcttc ctatgtggcc agttggggac       60
cagcatcatg aagtggatgg tggtggtctt ggtctgcctc cagctcttgg atgcagcagt      120
ggtcaaagtg cccctgcaga aatttaagtc tatccgtgag accatgaagg agaagggctt      180
gctgggggag tacctgagga cccacaagta tgatcctgct tggaagtacc gctttggtga      240
cctcagcgtg acctacgagc ccacggccta catggatgct gcctactttg gtgagatcag      300
catcgggact ccaccccaga acttcctggt ccttattgac accggctcct ccaacttgtg      360
ggtgccctct gtctaatgcc agagccaggc ctgcaccagt cactcccgct tcaaccccag      420
cgagtcgtcc acctactcta ccaatgggca gaccttctcc ctgcagtatg gcagtggcag      480
cctcaccggc ttctttggct atgacacact gactgtccag agcatccagg tccccaacca      540
ggagtgcggc ttgagtgaga atgagcctgg taccaacttc gtctatgcgc agtttgatgg      600
catcatgggc ctggcatacc ctgctctgtc cgtggatgag gccaccacag ctatgcaggg      660
catggtgcag gagcgcgccc tcaccagccc cgtcttcagc gtctacctca gcaaccagca      720
gggctccagc ggtggagcgg ttgtctttgg gggtgtggat agcagcctgt acacggggca      780
gatctactgg gcgcctgtca cccaggaact ctactggcag attggcattg acgagttcct      840
catcggcggc caggcctccg gctggagttc tgagggttgc caggccatcg tggacacagg      900
cacctctctg ctcactgtgc ctcagcagta catgagtgct cttctgcagg ccacaggggc      960
ccaggaggat gagtatggac agtctctcgt gaactgtaac agcattcaga atctgcccag     1020
cttgaccttc atcatcaatg gtgtggagtt cactctgcca ccttcctcct atatcctcag     1080
taacaacggc tactgcaccg tgggagtcga gtccacctac ctgtcctccc agaacggcca     1140
gcccctgtgg atcctcggcg atgtcttcct caggtcctac tattccgtct acgacttggg     1200
caacaacaga gtaggctttg ccactgccgc ctagacttgc tgcctcgaca cgtgagctcc     1260
cctcttcctc ttgaccctgc acgctcctag ggcattgtat ctgtctttcc actctggatt     1320
cagcctcctt tttctggact ctggactttc tctaataata aatagttctt ctttaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aa                                                        1392

Claims (9)

1.一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒，包括已包被抗PGⅠ和PGⅡ抗体的酶联板，其特征在于：所述抗PGⅠ抗体是将PGⅠ抗原部分基因序列PGⅠ-A和PGⅠ-B分别通过基因工程克隆表达得到PGⅠ-A和PGⅠ-B重组蛋白，并利用克隆表达的重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体；所述PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，所述PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；所述抗PGⅡ抗体是将PGⅡ抗原基因序列通过基因工程克隆表达得到PGⅡ重组蛋白，并利用克隆表达的PGⅡ重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体，所述PGⅡ抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.3。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标抗体，所述酶为辣根过氧化物酶，所述抗体为PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标抗体稀释液，所述稀释液的配方为：0.1M Tris盐酸缓冲液，0.1%-1%BSA，0.5%-2.0%酪蛋白，1%-6%（NH4）2SO4，1%-5%SDS，0.1%-1%甘油，0.01%-0.1%DDT，5-10%蔗糖，pH8.5。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述包被时的包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6；包被浓度为5μg/ml。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：封闭所述抗PGⅠ和PGⅡ抗体时使用的封闭液为：0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA，2.0%酪蛋白；封闭液的pH值为7.4。
6.应用权利要求1-5任一所述的试剂盒联合检测胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）在微孔板反应孔中分别加入10μl校准品、质控品和待测样本，再加入90μl稀释的酶标抗体，混匀；
（2）37℃孵育45分钟；洗涤；
（3）加入底物显色，加入终止液，在酶标仪上读取OD450数值，绘制胃蛋白酶原Ⅰ标准曲线和胃蛋白酶原Ⅱ标准曲线，根据胃蛋白酶原Ⅰ标准曲线和胃蛋白酶原Ⅱ标准曲线计算待测样本中胃蛋白酶原PGⅠ和PGⅡ具体含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1）中酶标抗体的稀释倍数为1000倍。
8.PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ在制备联合检测胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ试剂盒中的应用。
9.PGⅠ-A、PGⅠ-B和PGⅡ在联合检测胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ中的应用。
CN201510091154.0A 2015-02-28 2015-02-28 一种胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ联合检测试剂盒 Active CN104698174B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510091154.0A CN104698174B (zh) 2015-02-28 2015-02-28 一种胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ联合检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510091154.0A CN104698174B (zh) 2015-02-28 2015-02-28 一种胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ联合检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104698174A true CN104698174A (zh) 2015-06-10
CN104698174B CN104698174B (zh) 2017-10-31

Family

ID=53345513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510091154.0A Active CN104698174B (zh) 2015-02-28 2015-02-28 一种胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ联合检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104698174B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108020672A (zh) * 2016-11-03 2018-05-11 中国医学科学院基础医学研究所 检测rhbdd1蛋白的elisa方法及试剂盒
CN108414742A (zh) * 2018-02-07 2018-08-17 上海铭源数康生物芯片有限公司 胃蛋白酶原i和胃蛋白酶原ii联合检测试剂盒及其制备方法和检测方法
CN113267629A (zh) * 2021-05-13 2021-08-17 广东优尼德生物科技有限公司 一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102087279A (zh) * 2010-03-11 2011-06-08 北京美康生物技术研究中心 一种联合诊断胃病或评价胃癌风险的酶联免疫吸附试剂盒
CN202583208U (zh) * 2012-05-16 2012-12-05 江苏省原子医学研究所 一种胃蛋白酶原ⅱ生物素-链霉亲和素酶联免疫检测试剂盒
TW201411128A (zh) * 2012-08-09 2014-03-16 Fujirebio Kk Ｐｉｖｋａ－ｉｉ測定方法、測定試藥及測定套組
CN203688563U (zh) * 2013-10-18 2014-07-02 无锡宜偌维盛生物技术有限公司 一种胃蛋白酶原i酶联免疫一步法检测试剂盒
CN103995127A (zh) * 2013-10-16 2014-08-20 无锡宜偌维盛生物技术有限公司 一种pgi和pgii联合检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102087279A (zh) * 2010-03-11 2011-06-08 北京美康生物技术研究中心 一种联合诊断胃病或评价胃癌风险的酶联免疫吸附试剂盒
CN202583208U (zh) * 2012-05-16 2012-12-05 江苏省原子医学研究所 一种胃蛋白酶原ⅱ生物素-链霉亲和素酶联免疫检测试剂盒
TW201411128A (zh) * 2012-08-09 2014-03-16 Fujirebio Kk Ｐｉｖｋａ－ｉｉ測定方法、測定試藥及測定套組
CN103995127A (zh) * 2013-10-16 2014-08-20 无锡宜偌维盛生物技术有限公司 一种pgi和pgii联合检测试剂盒
CN203688563U (zh) * 2013-10-18 2014-07-02 无锡宜偌维盛生物技术有限公司 一种胃蛋白酶原i酶联免疫一步法检测试剂盒

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108020672A (zh) * 2016-11-03 2018-05-11 中国医学科学院基础医学研究所 检测rhbdd1蛋白的elisa方法及试剂盒
CN108414742A (zh) * 2018-02-07 2018-08-17 上海铭源数康生物芯片有限公司 胃蛋白酶原i和胃蛋白酶原ii联合检测试剂盒及其制备方法和检测方法
CN113267629A (zh) * 2021-05-13 2021-08-17 广东优尼德生物科技有限公司 一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法
CN113267629B (zh) * 2021-05-13 2022-06-24 广东优尼德生物科技有限公司 一种抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104698174B (zh) 2017-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6484562B2 (ja) 可溶性ｇｐｃ３タンパク質の測定方法
KR102549704B1 (ko) Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법
Chuang et al. Dengue virus-induced autoantibodies bind to plasminogen and enhance its activation
JPH0720127A (ja) 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬
CA2426571A1 (en) Detection of ovarian cancer
CN101672851B (zh) 人组织激肽释放酶elisa试剂盒的制备
CN114807054B (zh) 小鼠抗人IgG单抗杂交瘤细胞株、抗体、抗体组合物及试剂盒
CN203688563U (zh) 一种胃蛋白酶原i酶联免疫一步法检测试剂盒
CN104698174B (zh) 一种胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ联合检测试剂盒
Łupicka-Słowik et al. Development and evaluation of an immunoglobulin Y-based ELISA for measuring prostate specific antigen in human serum
JP7317379B2 (ja) 潰瘍性大腸炎及び原発性硬化性胆管炎の検査方法
CN112759639A (zh) N-末端脑钠肽前体多肽、抗体及试剂盒
KR102100152B1 (ko) Pivka-ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트
WO2015097928A1 (ja) 可溶性ｇｐｃ３タンパク質の測定方法
CN103995127B (zh) 一种pgi和pgii联合检测试剂盒
CN104730249A (zh) 一种检测人附睾分泌蛋白4的酶联免疫试剂盒
JP5856956B2 (ja) 血液検査方法
CN107746430A (zh) 一种gp73 c端抗原的制备及其应用
JP6037043B2 (ja) ＴＲＡＣＰ−５ｂ（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ５ｂ）に特異的なタンパク定量法
CN110133271A (zh) 一种将抗体或其抗原结合片段共价结合至颗粒表面的方法
CN103848889B (zh) Igf2bp1自身抗体识别的抗原多肽
JP3345696B2 (ja) 血液中のｎｃａ５０／９０の測定による結腸ガン患者の診断と監視
Yamaguchi et al. Development of des-γ-carboxy prothrombin (DCP) measuring reagent using the LiBASys clinical analyzer
EP4187246A1 (en) Method for assisting diagnosis of inflammatory bowel disease
CN108982858B (zh) 一种基于单克隆抗体检测人proGRP的双夹心ELISA试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant