CN103848889B - Igf2bp1自身抗体识别的抗原多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。其中，该多肽具有如SEQID？NO：1-3所示氨基酸序列至少之一。利用本发明的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽，能够有效地检测样品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液样品（例如血清样品）中的IGF2BP1自身抗体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽及其用途。更具体地，本发明涉及一种IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽、该多肽在制备检测肿瘤血清中IGF2BP1抗体的用途、一种用于检测样品中IGF2BP1抗体的试剂盒。
背景技术
肺癌是一种严重危害人类健康的恶性疾病，生物学特性十分复杂，早期无创性诊断困难，目前寻找肿瘤相关标志物已成为肺癌早期诊断和免疫治疗的研究热点。但现阶段应用于临床的肿瘤标志物仍然不多，且对肺癌的早期发现仍缺乏足够的敏感性、特异性和可重复性，因此，目前迫切需要寻找有效肿瘤相关标志物用于肺癌早期诊断。而近年研究表明，肿瘤患者自身免疫系统会对肿瘤相关抗原产生自身抗体，这些自身抗体存在于肺癌患者体循环中，甚至在肺癌临床症状出现5年前就可以出现了，因此自身抗体可能成为监测肿瘤发生的早期标志物。相较于血清中肿瘤抗原型标志物，血清中肿瘤抗原相应自身抗体同时具有丰度高，易检测等优势，可能成为更为可靠的血清肿瘤标志物，将有助于肿瘤的早期诊断。因此，寻找肺癌抗原相应自身抗体，对于肺癌早期诊断以及预后检测意义重大。然而，目前相关报道很少。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
近年来，研究发现IGF2BP1(insulin-likegrowthfactor2mRNAbingdingprotein1，胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1)属于高度保守的RNA结合蛋白，在mRNA转录后调控的多个方面发挥重要作用。IGF2BP1在睾丸癌早期原位癌中即有大量表达，提示其可能成为癌症发生的早期标志物；而在卵巢癌、结肠癌的研究中，则证明了IGF2BP1的高水平表达与癌症的复发转移以及不良预后相关；同时，在肺癌中，IGF2BP1的表达水平与肿瘤细胞低分化程度相关，并提示可能成为不良预后的标志物。在肝细胞癌的研究中发现IGF2BP1作为自身抗原，能引起患者血清中自身抗体的表达变化，这一变化与肝细胞癌密切相关。综上，发明人发现IGF2BP1自身抗体可能成为更为有效的肿瘤标志物。但是目前尚未有商品化的IGF2BP1自身抗体检测试剂盒。
本发明旨在解决现有技术的上述缺陷至少之一，而提供一种有用的商业选择。
为此，本发明提出了一种IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。根据本发明的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一：
1)SEQIDNo:1所示序列：MNKLYIGNLNESVTPADLEK；
2)SEQIDNo:2所示序列：IAPPETPDSKVRMVIITGPP；
3)SEQIDNo:3所示序列：RVIGKGGKTVNELQNLTAAE；
4)SEQIDNo:1-3所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
根据本发明的实施例，优选地，本发明的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽具有如RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO:3）所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体的效率。
另外，本发明还提出了前面所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽在制备检测肿瘤血清IGF2BP1抗体试剂盒中的用途。尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。
为此，本发明提出了一种用于检测样品中IGF2BP1抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。具体地，根据本发明的实施例，该试剂盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。进一步，该试剂盒可以进一步包括：阴性对照样品，所述阴性对照样品为IGF2BP1抗体为阴性的血清，或者/额外地可以进一步包括：标准样品，所述标准样品为IGF2BP1抗体浓度分别为1U/ml，5U/ml，10U/ml，15U/ml的血清。根据本发明的实施例，IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽的浓度可以为，每个反应孔1μg/ml。根据本发明的实施例，尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。
为此，在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽具有如SEQIDNO：1-3所示氨基酸序列至少之一。即，该多肽具有如下列所示氨基酸序列之一：
MNKLYIGNLNESVTPADLEK（SEQIDNO:1）；
IAPPETPDSKVRMVIITGPP（SEQIDNO:2）；
RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO:3）。
根据本发明的实施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能够有效地检测样品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液样品（例如血清样品）中的IGF2BP1自身抗体。
根据本发明的实施例，优选地所述多肽具有如RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO:3）所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体的效率。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述多肽在检测样品中IGF2BP1自身抗体的用途。
根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液样品。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中的IGF2BP1自身抗体。
根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液样品。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于检测样品中IGF2BP1自身抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的多肽。由此，利用根据本发明的实施例，可以有效地借助根据本发明的多肽对样品中的IGF2BP1自身抗体进行检测。
根据本发明的实施例，该试剂盒可以进一步包括：适于进行ELISA检测的试剂。由此，可以通过ELISA检测方法，利用根据本发明的多肽对样品中的IGF2BP1自身抗体进行检测，从而可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体的效率。
根据本发明的实施例，所述多肽设置于96孔板中。由此，可以方便地高通量地进行检测。可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体的效率。
根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液样品。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。根据本发明的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一：
1)SEQIDNo:1所示序列：MNKLYIGNLNESVTPADLEK；
2)SEQIDNo:2所示序列：IAPPETPDSKVRMVIITGPP；
3)SEQIDNo:3所示序列：RVIGKGGKTVNELQNLTAAE；
4)SEQIDNo:1-3所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
根据本发明的实施例，优选地，本发明的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽具有如RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO:3）所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体的效率。
在本发明的再一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽具有如SEQIDNO：1-3所示氨基酸序列至少之一。即，多肽具有如下列所示氨基酸序列之一：
MNKLYIGNLNESVTPADLEK（SEQIDNO:1）；
IAPPETPDSKVRMVIITGPP（SEQIDNO:2）；
RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO:3）。
需要说明的是，上述多肽均来自于IGF2BP1的全长序列所对应的（IGF2BP1的全长序列见NCBINP_006537）。另外，在本文中所使用的术语“多肽”是指至少两个氨基酸通过肽键连接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸残基的数目并不受特别限制。根据本发明的实施例，多肽可以含有20个氨基酸。当然，本领域技术人员可以理解的是，还可以对上述多肽进行化学修饰，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到ELISA板底。根据本发明的实施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能够有效地检测样品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液样品（例如血清样品）中的IGF2BP1自身抗体。发明人发现从IGF2BP1完整序列得到的上述多肽可以作为IGF2BP1的抗原表位，能够与血液样本中IGF2BP1自身抗体特异性的反应，因而，可以有效地用于检测对象血液样本中的IGF2BP1自身抗体，由此，可以有效地用于筛查肺癌疑似患者血清，为肺癌的诊断提供了一个新的检验指标。
根据本发明的实施例，优选地所述多肽具有如SFFFLSFHISNLQFNSSLED（SEQIDNO:1）所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体的效率。
本领域技术人员可以理解的是，可以有效地通过常规合成方法，合成上述多肽，从而代替重组表达的生物合成方式。
IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽的应用及试剂盒
由此，在本发明的又一方面，本发明还提出了前面所述多肽在检测样品中IGF2BP1自身抗体的用途。根据本发明的实施例，可以用上述多肽进行检测的样品的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，优选的样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样本。由此，可以利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样本中的IGF2BP1自身抗体，由此可以确定患者是否患有恶性肿瘤，为恶性肿瘤检测提供辅助手段，或者提供恶性肿瘤例如肺癌的早期筛查。另外，还可以通过检测对象血液中IGF2BP1自身抗体的存在，而对患者进行预后预测分析。
利用本发明的多肽检测样品中IGF2BP1自身抗体的方法并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法，借助本发明的多肽检测样品中的IGF2BP1自身抗体。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体的效率。作为示例，可以采用下列方法利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1抗体：
首先，用pH9.6的碳酸盐缓冲液（NaCO30.159g，NaHCO30.293g，加水至100ml，pH值为9.6）稀释多肽至1μg/ml，以100μl/孔的量加入到96孔酶标板的孔中，封板膜密封后4℃过夜。
接下来，弃去孔中的液体，0.1%TBS-T洗涤缓冲液（即含0.1%Tween-20的TBS-T溶液，其配制方法为：NaCl8.7g，Tris1.21g，加去离子水至1000ml，pH7.5，再加入Tween-201ml）洗涤酶标板5次，每次3min。
接着，向孔中添加5%BSA/0.05%TBS-T封闭缓冲液（其配制方法为：NaCl0.87g，Tris0.121g，加去离子水至100ml，pH7.5，再加入Tween-200.5ml，BSA5g），每孔300μl，封板膜密封后37℃孵育1h。
接着，添加待测样品。用5%BSA/0.05%TBS-T封闭缓冲液稀释血清，稀释比例为1:100，完全弃去孔中液体，每孔加血清稀释液100μl，每例血清样本3个复孔，每板设立2个阳性对照孔，加入已知阳性血清，每板设立2个空白对照孔，加入0.1%TBS-T洗涤缓冲液。封板膜密封后37℃孵育2h。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
接着，进行第二抗体免疫反应。利用5%BSA/0.05%TBS-T封闭缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，稀释比例1:5000，每孔加100μl，封板膜密封后37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
接着，加底物显色。按照常规ELISA试剂盒说明书（例如康为世纪TMB显色试剂盒），加入显色底物，每孔加入100μl，室温避光条件下显色10min，每孔加入50μl2MH2SO4终止反应。
接着，酶标仪492nm波长条件下测定光密度OD值。
最后，基于所得到的光密度OD值与预定的参考值的区别，确定待测样品是否来自于患有肺癌患者。根据本发明的实施例，可以利用确诊癌症患者和健康人（健康志愿者）的血液样品进行平行试验所得到的数值作为预定的参考值。
例如，用ELISA方法检测血液样本中的抗IGF2BP1的自身抗体水平。如果待测样本中的酶底物显色反应的光密度值高于X+2SD，则待测血清为肺癌疑似患者血清，其中，在X+2SD中，X为健康人血清中的酶底物显色反应的光密度平均值，2SD为健康人血清中的酶底物显色反应的光密度值的二倍标准差。具体地，根据本发明的实施例，本发明所采用的X+2SD值是通过下列方法获得的：按照前述利用本发明的多肽检测样品中IGF2BP1自身抗体的方法，采用89例健康对照血液样本，测定其酶底物显色反应的OD值，将测得的OD值以单样本K-S检验分析符合正态分布（p>0.05）后，计算获得各OD值的平均值（X=0.17）及标准差（SD=0.09），则以X+2SD（0.35）为正常值的上限。
根据本发明的另一方面，本发明还提出了前面所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽在制备检测肿瘤血清IGF2BP1抗体试剂盒中的用途。尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。另外，利用该试剂盒还可以通过检测对象血液中IGF2BP1自身抗体的存在，而对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。
为此，根据本发明的再一方面，本发明提出了一种用于检测样品中IGF2BP1抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。具体地，根据本发明的实施例，该试剂盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。进一步，该试剂盒可以进一步包括：阴性对照样品，所述阴性对照样品为IGF2BP1抗体为阴性的血清，或者/额外地可以进一步包括：标准样品，所述标准样品为IGF2BP1抗体浓度分别为1U/ml，5U/ml，10U/ml，15U/ml的血清。根据本发明的实施例，IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽的浓度可以为，每个反应孔1μg/ml。根据本发明的实施例，尤其是，该试剂盒可以用于检测的肿瘤为肺癌。在本发明的再一方面，本发明提出了前面所述多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中的IGF2BP1自身抗体。根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样品。由此，可以利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1自身抗体，由此可以确定患者是否患有恶性肿瘤，为恶性肿瘤检测提供辅助手段，或者监控恶性肿瘤例如肺癌的进展。另外，利用该试剂盒还可以通过检测对象血液中IGF2BP1自身抗体的存在，而对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于检测样品中IGF2BP1自身抗体的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的多肽。由此，利用根据本发明的实施例，可以有效地借助根据本发明的多肽对样品中的IGF2BP1抗体进行检测。根据本发明的实施例，该试剂盒可以进一步包括：适于进行ELISA检测的试剂。由此，可以通过ELISA检测方法，利用根据本发明的多肽对样品中的IGF2BP1抗体进行检测，从而可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1抗体的效率。根据本发明的实施例，所述多肽设置于96孔板中，例如可以包被96孔板的孔，例如可以通过常规处理如借助包被液和阻滞液进行。由此，可以方便地高通量地进行检测。可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的IGF2BP1抗体的效率。试剂盒中还可以包含其他试剂，例如冲洗缓冲液，样品稀释缓冲液，TMB底物溶液，反应终止液，辣根酶标记的二抗，阴性对照样品，标准样品。其中，阴性对照样品为IGF2BP1抗体为阴性的血清，标准样品为IGF2BP1抗体浓度分别为1U/ml，5U/ml，10U/ml，15U/ml的血清。
根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样品。
另外，利用该试剂盒还可以通过检测对象血液中IGF2BP1自身抗体的存在，而对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。
需要说明的是，在本文中，有时也将“IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽”简称为“多肽”，将“IGF2BP1自身抗体”简称为“IGF2BP1抗体”。
下面通过具体实施例，对本发明进行解释。需要说明的是，下列实施例仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本发明。另外，下列实施例中所采用的所有仪器、材料等均为市售可得的，如在下列实施例中没有明确指出的操作，可以通过本领域技术人员常规的操作方法进行。
实施例1多肽的制备
1.1一般方法
依据IGF2BP1蛋白的全长氨基酸残基序列（NP_006537），采用原位合成技术在活化纤维素膜表面合成长度为18~20的多肽的多肽芯片（PiptideArray），每个多肽直接顺序重叠10个氨基酸残基。
1.2原位合成制备多肽芯片（PiptideArray）
根据蛋白及多肽氨基酸残基长度、重叠序列长度进行多肽合成仪ASPSL（德国，intavis公司）MutilPep合成控制程序设定，依据程序控制在每个合成周期添加一种特定氨基酸到活化的硝酸纤维素膜表面合成位点，并催化氨基酸之间肽键形成。合成肽链长度为20个氨基酸残基，需进行20个周期的反应，按照ASPSL多肽合成仪的操作流程，将20种FMOC-基团保护的天然氨基酸溶液放到机器上对应的位置。每个周期之间氨基酸要经过帽化，FMOC-基团脱保护等一系列的过程才能与下一个氨基酸结合，最后一个周期结束时，要将氨基酸的侧链保护基团脱掉。其步骤为：多肽合成仪ASPSL将指定的氨基酸滴加到硝酸纤维素膜上特定的位置，2%的乙酸酐溶液洗膜5分钟，二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分钟。20%的哌啶溶液洗膜10分钟脱去FMOC-保护基团，二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分钟。乙醇洗膜2次，每次2分钟，晾干。重复上述操作，直到完成20个周期，最后一个周期结束时20%的哌啶溶液洗膜2次，每次10分钟。二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分钟。乙醇洗膜2次后晾干过夜。最后，10ml三氟乙酸，300μl二氯甲烷，200μl水充分混合，用混合液洗膜1小时，脱去侧链保护基团，二氯甲烷洗膜5次，每次2分钟。二甲基甲酰胺洗膜5次，每次2分钟。乙醇洗膜2次后晾干。多肽芯片合成后在－20℃密封保存备用。
实施例2筛选与肺癌相关的多肽
2.1多肽芯片的水化
首先，将实施例1所制备的多肽芯片浸入40ml100%乙醇中，摇床上摇5分钟。然后，将该多肽芯片浸入40ml75%乙醇中，摇床上摇5分钟。接下来，将多肽芯片浸入40ml50%乙醇中，摇床上摇5分钟。接着，加入150mlPBS浸泡30分钟（以膜上的白点完全退色为准）。最后，将将多肽芯片浸入40ml5%脱脂奶粉/PBS-T溶液中，室温下孵育3小时进行封闭。
2.2多肽阵列与血清反应
将10例肺癌患者血清等量混合，制备肺癌血清池，用5%脱脂奶粉/PBS-T溶液1∶1000稀释制备成免疫反应液，将多肽芯片放入杂交袋内，按0.1ml/cm2加反应液,去除袋内所有气泡，封膜机封口，4℃轻轻振荡过夜。
将10例健康对照血清混合，制备健康对照血清池，用5%脱脂奶粉/PBS-T溶液1∶1000稀释制备成免疫反应液，将多肽芯片放入杂交袋内，按0.1ml/cm2加反应液，去除袋内所有气泡，封膜机封口，4℃轻轻振荡过夜。
血清免疫反应结束后，剪开杂交袋，弃去反应液，PBS-T40ml洗多肽芯片6次，每次10分钟，将多肽芯片放入杂交袋内，加1：10000稀释的山羊抗人IgG溶液，按0.1ml/cm2加二抗反应液，封好杂交袋，室温下轻轻振荡2小时，40mlPBS-T洗膜3次，每次10分钟，40mlPBS洗膜3次，每次10分钟。
接下来，进行ECL显影，曝光，将胶片进行扫描，用AlphaView软件系统分析图像。
2.3筛选
根据上述PiptideArray免疫反应结果，挑选与肺癌患者血清反应阳性而与健康对照组血清反应阴性的差异多肽点（序列见表1），组成多肽原位Dot-Blot膜，按照实施例1中所述制备方法，制备包含这5条多肽及对照在内的多肽芯片，通过与29例肺癌患者血清进行免疫反应计算各点阳性频度值，确定特异性序列（见下表1）。如表1所示，其中，敏感性最高的是RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO：3）。
表1
实施例3ELISA检验
以实施例2中获得的多肽RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO：3）为抗原包被96孔板，运用ELISA方法对下列样本进行IGF2BP1自身抗体的检测：407例肺癌患者血清，66例肺部良性疾病患者血清，89例健康对照血清。
具体检测方法如下：
首先，用多肽合成仪MultiPepRS按照序列表中氨基酸残基顺序合成多肽RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO：3），并将所得到的肽偶联KLH，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到ELISA板底。
包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液（NaCO30.159g，NaHCO30.293g，加水至100ml，pH值为9.6）稀释合成的多肽RVIGKGGKTVNELQNLTAAE（SEQIDNO：3）至1μg/ml，以100μl/well加入96孔酶标板，封板膜密封后4℃过夜。
洗涤：弃去孔中的液体，0.1%TBS-T洗涤缓冲液（其配制方法为：NaCl8.7g，Tris1.21g，加去离子水至1000ml，pH7.5，再加入Tween-201ml）洗涤酶标板5次，每次3min。
封闭：5%BSA/0.05%TBS-T封闭缓冲液（其配制方法为：NaCl0.87g，Tris0.121g，加去离子水至100ml，pH7.5，再加入Tween-200.5ml，BSA5g），每孔300μl，封板膜密封后37℃孵育1h。
加待检血清：用5%BSA/0.05%TBS-T封闭缓冲液稀释血清，稀释比例为1:100，完全弃去孔中液体，每孔加血清稀释液100μl，每例血清样本3个复孔，每板设立2个阳性对照孔，加入已知阳性血清，每板设立2个空白对照孔，加入0.1%TBS-T洗涤缓冲液。封板膜密封后37℃孵育2h。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
第二抗体免疫反应：5%BSA/0.05%TBS-T封闭缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，稀释比例1:5000，每孔加100μl，封板膜密封后37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
加底物显色：使用TMB显色试剂盒，按照制造商所（康为世纪）所提供的说明书，室温避光条件下显色10min，每孔加入50μl2MH2SO4终止反应。
检测：酶标仪492nm波长条件下测定光密度OD值。
接着，将上述测得的89例健康对照组的OD值经单样本K-S检验分析符合正态分布（p>0.05）后，计算其OD值的平均值X及标准差SD，以X+2SD表示健康对照血清中抗IGF2BP1特异多肽的自身抗体正常值的上限。结果，各OD值的平均值X=0.17，标准差SD=0.09，则健康对照血清中抗IGF2BP1特异多肽的自身抗体正常值的上限X+2SD为0.35。
然后，基于上述获得的各血清样本的光密度OD值，以及健康对照血清中抗IGF2BP1特异多肽的自身抗体正常值的上限X+2SD（0.35），确定各血清样本是否为SEQIDNO：3所示多肽自身抗体阳性，并对利用该多肽检测肺癌及多种肺部良性肿块疾病患者血清IGF2BP1自身抗体的阳性率进行分析。结果见下表2-5。
其中，各血清样本中的IGF2BP1自身抗体阳性率如下表2所示：
表2
| 样本类型 | 例数 | 抗体阳性率 |
| 肺癌 | 407 | 99/407(24.3%) |
| 结核 | 24 | 1/24(4.2%) |
| 肺炎及慢支 | 23 | 0/23(0%) |
| 肺脓肿 | 19 | 0/19(0%) |
| 健康对照 | 89 | 6/89(6.7%) |
由表2的结果，比较阳性和阴性例数，结果如下表3：
表3
| 自身抗体 | 肺癌患者数 | 非肺癌患者数 |
| 阳性 | 99（a，即真阳性） | 7（b，即假阳性） |
| 阴性 | 308（c，即假阴性） | 147（d，即真阴性） |
然后，按照以下公式计算抗SEQIDNO：3所示多肽自身抗体在肺癌患者诊断中的特异性、敏感性以及阴性阳性预测值：
敏感性=（a/a+c）×100%
特异性=（d/b+d）×100%
阳性预测值=（a/a+b）×100%
阴性预测值=（d/c+d）×100%，
结果总结如表4：
表4
| 自身抗体 | 敏感性 | 特异性 | 阳性预测值 | 阴性预测值 |
| IGF2BP1 | 24.3% | 95.5% | 93.4% | 32.3% |
根据检测结果可知，利用SEQIDNO：3所示的多肽检测IGF2BP1自身抗体水平的灵敏度可以达到24.3%，特异性达到95.5%，阳性预测率达到93.4%，阴性预测率达到32.3%。
另外，对407例肺癌患者进行随访（其中，有351例随访时间大于36个月，最长达80个月），以对各患者进行无进展预后分析，结果见下表5。由下表5可知，260例IGF2BP1自身抗体表达阴性的患者中137例发生了复发转移，无进展生存率47.3%，91例IGF2BP1自身抗体表达阳性的患者中只有38例发生了复发或者转移，无进展生存率58.2%，具有统计学意义，P=0.029。
表5
综上所述，发明人发现，肺癌患者的IGF2BP1自身水平高于肺部良性疾病患者和健康对照组；肺癌患者随访观察，IGF2BP1自身抗体水平阳性患者预后较好，而IGF2BP1自身抗体阴性患者预后较差。由此，证明了本发明的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽，尤其是SEQIDNO:3所示的多肽，可有效用于肺癌的辅助诊断，尤其是肺癌的早期筛查，以及对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo:3所示：RVIGKGGKTVNELQNLTAAE。
2.权利要求1所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽在制备检测肺癌血清IGF2BP1自身抗体试剂盒中的用途。
3.一种用于检测样品中IGF2BP1抗体的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，包括：
96孔板，所述96孔板的孔中包被权利要求1所述的IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：阴性对照样品，所述阴性对照样品为IGF2BP1抗体为阴性的血清。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：标准样品，所述标准样品为IGF2BP1抗体浓度分别为1U/ml，5U/ml，10U/ml，15U/ml的血清。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述IGF2BP1自身抗体识别的抗原多肽的浓度为，每个反应孔1μg/ml。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述样品为肺癌血清。
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