CN104316695B - 用于检测肝癌与肝硬化相关多肽-蛋白组合式标志物的双抗体夹心试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及用于检测肝癌与肝硬化相关多肽‑蛋白组合式标志物的双抗体夹心酶联免疫吸附法或化学发光法试剂盒。该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体,其中,捕获抗体与前体蛋白HKa特异性结合;检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合。通过形成捕获抗体‑(HKP09/HKP15‑HKa)‑检测抗体复合物,实现对组合式标志物精确检测。该试剂盒具有良好的准确性和灵敏性,其最低检测限为1.7ng/mL,检测范围为6ng/mL~120ng/mL。其能显著区分肝癌、肝硬化样本和正常人样本,该试剂盒检测灵敏度和特异性高,适用于临床肝癌和肝硬化相关组合式标志物早期筛查。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及用于检测肝癌与肝硬化相关“多肽-蛋白组合式标志物“的双抗体夹心酶联免疫吸附法或化学发光法试剂盒。
背景技术
我国是肝癌发生率高的国家,发病率占全球55%,且呈年轻化的趋势;全国每年由此导致各种肝病的死亡人数超过30多万,死亡率占全球45%。肝癌已成为死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。多种损肝因素引起的肝脏损害和炎症是肝纤维化、肝硬化的病理学基础,“肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”的途径是肝癌发展的必经过程。尽管对于肝硬化转为肝癌几率的报道不尽相同,多数研究仍将肝硬化作为肝癌发生的最大风险因素。80%左右的肝癌患者伴随有肝硬化或晚期肝纤维化。因此要做到肝癌和肝硬化的早期发现、早期诊断、早期治疗,在肝硬化阶段即进行介入预防,将有效降低肝硬化转向肝癌的发生率及死亡率。
对于肝癌和肝硬化的诊断方法主要包括病理学、影像学和血清学诊断3种。其中,肝组织活检是诊断肝癌和肝硬化最为常用的检验金标准,但作为一种侵入性检查,其并发症的发生率为1%~5%,死亡率为1/10000~1/1000。肝穿刺盲目性大、取材不够、肝脏病变的不均一,均会导致取样误差,不能反复取材进行动态观察。患者心理承受能力也限制该微创检查。常用的无创性诊断方法有影像学诊断及血清学诊断,其中,影像学诊断主要是B超和CT,这些方法在检测伴有门静脉高压的晚期肝纤维化时,具有较高的灵敏度和特异性,但用于诊断早期肝癌和肝硬化的敏感性却不强,因此,通过检测血清标志物,观察并辅助判断肝癌和肝硬化,将具有很重要的临床意义。临床常用的肝癌和肝硬化血清标志物包括甲胎蛋白(AFP)和胆碱酯酶(CHE),但各有其局限性,主要表现为灵敏度仍然偏低。
相关研究表明,肿瘤在癌变过程中,细胞蛋白质和酶的增殖不但使血清蛋白变化,也影响到血清多肽。2006年Villanueva J的研究发现了61种具有癌症特征的肽段标志物和不同蛋白酶活性之间存在着直接关联,认为血清多肽组蕴含蛋白降解模式,携带具有重要临床价值的标志物信息,血清多肽比蛋白能更精细地区分某些肿瘤差异,血清多肽可能会识别其他标志物无法识别的肿瘤,并且指出几种肽段模式在临床上有望作为肿瘤的标志物,对前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌的诊断有一定研究意义。2002年以来,血清多肽已成功应用于多种肿瘤的诊断研究,如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、淋巴癌、脑胶质细胞瘤等。Petricoin等利用生物信息学手段对血清多肽图的组成等模式进行分析,成功地对早期卵巢癌进行了诊断,敏感性、特异性和阳性预测值分别为100%,95%和94%,显著优于传统的CAl25检测,特别是对早期卵巢癌(I期)的诊断也十分成功。
血清多肽与蛋白标志物在ELISA检测方法上仍存在诸多不足,尤其是多肽与蛋白标志物的联合检测尚处于简单的“混合型”模式。ELISA检测方法中,最常使用双抗体夹心ELISA,该方法在血清多肽和蛋白进行联合检测的研究中,一般将几种相关的,甚至无关联的蛋白或多肽标志物分别检测,可靠性大打折扣。Sogawa报道了采用肝纤维化多肽标志物FIC5.9的N端和C端来制备不同抗原表位的特异性多肽抗体,并形成了多肽标志物的双抗体夹心ELISA检测方法,具备一定的创新思维,但对于多数已经报道的潜在肿瘤多肽标志物来讲,一般分子量较小,尤其对于2kDa以下的小分子多肽,存在肽链短小、免疫原性弱等局限,难以通过抗N端表位、C端表位或中间表位的办法来建立双抗体夹心检测。
激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system,KKS)对于细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生和血管的生成有着重要作用。KKS是一种内源性的多蛋白体系,高分子量激肽原(HK)是其代谢通路中的一个典型蛋白,它以糖蛋白形式存在于血浆中,分子量120kDa,该分子可划分为6个结构域(D1-D6)。D1、D2和D3区组成重链;D3后是1个小区段D4,含有缓激肽片段;D5和D6区组成分子的轻链。HK在Lys362-Lys363和Arg371-Ser372之间被激活后,释放D4区缓激肽BK,产生HKa。HKa由含D1、D2和D3的重链和含D5和D6的轻链组成,重链和轻链由1个二硫键连接起来。HK转变为HKa后,发生结构重排、构象变化等使D5区暴露更加明显,从而发挥更好的生物学作用。AlvinH.Schmaier等认为HKa可以通过与内皮细胞结合抑制新血管的生成来阻止肿瘤的形成,同时HKa还可以通过阻断EGFR与uPAR的结合来抑制肿瘤的转移和侵袭。
但是,目前对于新型的“多肽-蛋白组合式标志物”仍鲜有研究,因此,研制一种能够用于肝癌或肝硬化检测的组合式标志物检测试剂盒十分必要。
发明内容
有鉴于此,本发明所要解决的技术问题在于提供用于检测肝癌与肝硬化相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心酶联免疫吸附法或化学发光法试剂盒,本发明提供的试剂盒能够实现对肝癌或肝硬化患者血清中HKP09/HKP15-HKa的灵敏和准确检测。
蛋白HKa和多肽HKP09、多肽HKP15同属于激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system,KKS)代谢通路。本发明通过实验发现,多肽标志物HKP15和HKP09由HKa代谢产生。具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D4区,具体位于HKa蛋白的381~389位氨基酸,命名为HKP09。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D5区,具体位于497~511位氨基酸,命名为HKP15。HKP09和HKP15即为HKa降解,多肽HKP09和HKP15以未完全解离的形式存在于HKa表面。采用多肽及其前体蛋白两种特异性抗体,对HKP15/HKP09-HKa标志物进行定量检测,或许可以更精确的反映样品中标志物的表达情况,更加精确的区分肝硬化、肝癌与正常人样本。
本发明提供的“多肽-蛋白组合式标志物”的关键是前体蛋白结构中的特定多肽与对应的游离型的特定多肽序列结构完全一致、免疫特性一致,多肽通过酰胺键或二硫键等化学键形式自然存在于前体蛋白表面,是前体蛋白的一个重要结构域,多肽和蛋白互不干扰各自的免疫学特异性结合位点。本发明提供的“多肽-蛋白组合式标志物”首次将激酶降解的多肽HKP09及HKP15与其前体蛋白HKa进行优化组合,在检测时可同时分析紧密联系的多肽和前体蛋白,而不能完全孤立的去分析蛋白或者多肽。突破“混合式”或单一标志物的局限,最终实现该新型标志物与疾病之间的内在联系。所述组合式标志物不同于单一蛋白标志物或者单一多肽标志物,也不能理解为单一多肽和蛋白的简单混合。
本发明提供了用于检测肝癌与肝硬化相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心酶联免疫吸附法或化学发光法试剂盒,包括捕获抗体和检测抗体;
捕获抗体与蛋白HKa特异性结合;
检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合;
多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;
多肽HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
蛋白HKa的全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明中通过对比肝癌、肝硬化患者和正常人血清差异谱,筛选出在肝癌和肝硬化中异常表达的多肽标志物HKP09和HKP15,再利用数据库和免疫共沉淀技术,查找出HKP09和HKP15的前体蛋白为HKa,并验证出共同存在于激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system,KKS)代谢通路,该代谢通路与肝癌和肝硬化的发生发展有着一定相关性,该组合式标志物中的多肽HKP09和HKP15通过酰胺键或二硫键等化学键形式自然存在于HKa表面。
作为优选,捕获抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的,捕获抗体为单克隆抗体。
作为优选,检测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的,检测抗体为单克隆抗体。
作为优选,捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌。
作为优选,检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。
其中,捕获抗体与蛋白HKa特异性结合;检测抗体与多肽HKP09和HKP15均特异性结合;同时,捕获抗体与检测抗体的抗原结合表位不同,进一步理解为捕获抗体不与多肽HKP09或多肽HKP15特异性结合。。
作为优选,检测抗体结合有标记物质。
优选的,标记物质为酶。
更优选的,酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP。
最优选的,检测抗体上标记HRP酶。
作为优选,本发明所提供的试剂盒还包括HKa标准品、碳酸盐包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、卵清蛋白封闭剂、底物液、硫酸终止液和96孔酶标板。
本发明提供的试剂盒中捕获抗体可以为独立分装,也可包被于酶标板,本发明对此不作限定,其实施皆在本发明的保护范围之内。
在本发明的实施例中,HKa标准品的浓度为0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL。
底物液以酶催化显色或发光,优选的,底物液为OPD显色液、TMB显色液或NBT/BCIP显色液。
更优选的,底物液为TMB显色液。
优选的,包被缓冲液为0.1mol/L,pH9.6的碳酸盐缓冲液。
优选的,洗涤缓冲液为20mmol/L,pH7.4的PBST缓冲液。
优选的,卵清蛋白封闭剂的质量分数为2%。
优选的,终止液为2mol/L的硫酸水溶液。
本发明提供的检测试剂盒在制备制备肝癌或肝硬化检测产品中的应用。
本发明还提供了试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
步骤1:以捕获抗体捕获待测样品中的组合式标志物中的蛋白HKa;
步骤2:以检测抗体检测上述已捕获的蛋白HKa的表位多肽HKP09或多肽HKP15;
步骤3:根据检测值绘制标准曲线,获得待测样品中“多肽-蛋白组合式标志物”的含量。
本发明提供的试剂盒的使用方法中,标准曲线以HKa标准品溶液的浓度为横坐标,以相应浓度孔中的OD450值的平均值为纵坐标。
作为优选,试剂盒中捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌。
作为优选,试剂盒中检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。
作为优选,试剂盒中的捕获抗体包被于固相载体。
优选的,固相载体为酶标板。
作为优选,试剂盒中的检测抗体上含有标记物质。
优选的,标记物质为辣根过氧化物酶HRP。
作为优选,捕获抗体的包被浓度为1000ng/mL。
作为优选,检测抗体的检测滴度为1:2000。
作为优选,本发明提供的试剂盒的使用方法包括以下步骤:
步骤1:取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板,分别加入0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL的HKa标准品或以1:20稀释的待测血清样本,每孔100μL。37℃静置孵育1.5小时;
步骤2:弃溶液,各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次,拍干;
步骤3:各孔加入100μL经HRP标记的检测抗体,37℃静置孵育40分钟;
步骤4:弃溶液,各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次,拍干;
步骤5:各孔加入100μL与HRP相作用的TMB底物显色液,37℃避光显色15分钟;
步骤6:各孔加入50μL,2mol/L的硫酸终止液,用酶联检测仪测定OD450值;
步骤7:平行测量3次,以HKa标准品的浓度为横坐标,以相应浓度孔中的OD450值的平均值为纵坐标,绘制标准曲线和线性方程,将待测样本的OD450值带入线性方程,计算得到样本中的标志物含量。
本发明提供了一种试剂盒及其应用,该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体;其中,捕获抗体与蛋白HKa特异性结合;检测抗体与多肽HKP09、多肽HKP15或蛋白HKa特异性结合。本发明提供的试剂盒可用于肝癌和肝硬化相关的“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的检测。具体的,该检测方法为双抗体夹心检测,其中包含两种抗体,分别为与HKa特异性结合的捕获抗体、与HKP09/HKP15特异性结合的检测抗体。采用本发明提供的试剂盒检测HKP09/HKP15-HKa具有良好的准确性和灵敏性。实验表明,本发明提供试剂盒的最低检测限为1.7ng/mL,检测范围为6ng/mL~120ng/mL。对108例正常人血清中HKP09/HKP15-HKa的含量进行分析统计,计算出正常人中该标志物的含量不高于28.4ng/mL。
本发明通过ROC曲线分析,本发明提供的试剂盒检测肝癌和正常样本的特异性为66.1%,灵敏度为96.9%,检测肝硬化和正常样本的特异性为82.6%,灵敏度为95.9%。上述结果表明,本发明的试剂盒能够显著区分肝癌、肝硬化和正常人样本,检测灵敏度和特异性高。
生物保藏说明
3D11,分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCC No.9331,于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2G6,分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCC No.9332,于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1示本发明提供试剂盒捕获抗体与检测抗体的检测条件优化;
图2示本发明提供试剂盒检测HKa标准品的标准曲线;
图3示HKP09/HKP15-HKa在108例正常人中含量分布;
图4示HKP09/HKP15-HKa在肝癌、肝硬化和正常人中含量对比;
图5示本发明提供的试剂盒检测肝硬化样品的ROC曲线图;
图6示本发明提供的试剂盒检测肝癌样品的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明提供了用于检测肝癌与肝硬化相关“多肽-蛋白组合式标志物“的双抗体夹心酶联免疫吸附法或化学发光法试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂及材料皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:捕获抗体与检测抗体的检测条件优化
1)将捕获抗体用包被缓冲液分别稀释成50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL,按照100μL/孔,4℃放置过夜。
2)取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板,各孔加入100ng/mL的HKa标准品,每孔100μL。37℃静置孵育1.5小时;
3)弃溶液,各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次,拍干;
4)用PBST将HRP标记的检测抗体分别按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀释,每孔加入100μL,37℃静置孵育40分钟;
5)弃溶液,各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次,拍干;
6)各孔加入100μL与HRP相作用的TMB底物显色液,37℃避光显色15分钟;
7)各孔加入50μL,2mol/L的硫酸终止液,用酶联检测仪测定OD450值。
以不同捕获抗体的包被浓度为横坐标,以不同检测抗体工作滴度所对应的OD450值为纵坐标,绘制散点图,以OD450值为1.5处的明显拐点所对应的捕获抗体浓度和检测抗体滴度为最佳的抗体工作条件。由图1中的椭圆形虚线框所标示处的拐点,可得捕获抗体的较优包被浓度为1000ng/mL,检测抗体的较优工作滴度为1:2000。
实施例2:试剂盒的制备
1、试剂的配制
碳酸盐包被缓冲液:pH9.6,0.1mol/L,称取Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g加去离子水至1000mL。
PBST洗涤缓冲液:pH值为7.4,其中包括80mmol/L的Na2HPO4、20mmol/L的KH2PO4、100mmol/L的KCl、1400mmol/L的NaCl、体积分数为0.5%的Tween-20。
TMB显色液:底物显色A液:醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3mL,蒸馏水加至500mL;底物显色B液:乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50mL,取0.15g TMB溶于3mLDMSO中,蒸馏水加至500mL。取底物显色A液与底物显色B液等体积混合,即得TMB显色液。
硫酸终止液:配制浓度为2mol/L的硫酸水溶液。
2、捕获抗体的包被
取保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆杂交瘤细胞株2G6,经小鼠体内诱生制得与HKa特异性结合的单克隆抗体,用包被液稀释至浓度为1000ng/mL。取100μL置于96孔酶标板板中,4℃放置过夜;弃包被液,用20mmol/L、pH7.4的PBST缓冲液300μL清洗5次,拍干;加入300μL质量分数为2%的OVA封闭液,37℃静置封闭2小时;弃OVA封闭液用20mmol/L、pH7.4PBST缓冲液300μL清洗5次,拍干。
3、检测抗体的标记
取保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆杂交瘤细胞株3D11,经小鼠体内诱生制得能与多肽HKP15/HKP09特异性结合的单克隆抗体,在抗体上标记HPR酶,以PBST缓冲液稀释,使最终检测滴度为1:2000。
4、分装
取PBST缓冲液、TMB显色液、硫酸终止液、经标记的检测抗体,包被有捕获抗体的酶标板分别独立包装,即得。
实施例3:试剂盒最低检测限及检测范围的鉴定
取实施例2制得的试剂盒,配制梯度浓度的HKa标准品溶液为待测样品,HKa标准品的浓度为:0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL。
取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板,分别加入不同浓度的HKa标准品溶液,每孔100μL,每一浓度重复3次。37℃静置孵育1.5小时;弃溶液,各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次,拍干;
各孔加入100μL以HRP标记的检测抗体,37℃静置孵育40分钟;弃溶液,各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次,拍干;
各孔加入100μL TMB显色液,37℃避光显色15分钟;加入50μL 2mol/L硫酸溶液,终止反应;用酶联检测仪测定OD450值。
以HKa标准品溶液的浓度为横坐标,以相应浓度孔中的OD450值的平均值为纵坐标,绘制标准曲线,结果如图2所示。该标准曲线回归方程为y=0.0146x+0.0043,R2=0.9993。
如图2所示,本发明提供的试剂盒的检测范围为6ng/mL~120ng/mL,最低检测限为1.7ng/mL,
实施例4试剂盒的使用
取实施例1制备的试剂盒,以肝癌、肝硬化患者的血清为实验组,以正常人血清为阴性对照样品,说明本发明提供试剂盒的使用方法。
实验设计如表1所示:
表1实验设计
分别取各组待测样品,每个血清样品以试剂盒中提供的PBST缓冲液按1:20稀释后,取100μL加入包被有捕获抗体的酶标板上,37℃静置孵育1.5小时;弃溶液,各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次,拍干;各孔加入100μL以HRP标记的检测抗体,37℃静置孵育40分钟;弃溶液,各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次,拍干;各孔加入100μL TMB显色液,37℃避光显色15分钟;加入50μL 2mol/L硫酸溶液,终止反应;用酶联检测仪测定OD450值。根据实施例3绘制的标准曲线,确定各血清样品中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的含量。
表2各组血清样品中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的含量
另外,“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”在正常人中的含量分布如图3所示,肝硬化、肝癌和正常人血清样品中的“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”含量差异如图4所示。
结果显示:108例正常人血清中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的平均含量为10.9mg/mL,检测值的标准偏差SD为8.78,以平均值+2SD作为其在正常人群的界定值,含量为28.4ng/mL,依据此界定值作为区分标准,则所检测的108例正常人样本中,有103例的检测值低于28.4ng/mL,与临床阴性符合率为95.37%。与正常样本相比,肝癌和肝硬化样本的标志物含量要显著升高(P<0.001)。其中,HKP09/HKP15-HKa标志物在肝硬化中的平均含量最高,在肝癌中的含量次之。
可见,采用本发明提供的试剂盒,通过检测“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”在血清中的含量,可以区分正常人与肝癌、肝硬化。正常人血清中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的界定值不高于28.4ng/mL。
实施例5试剂盒检测特异性和灵敏度检测
根据实施例4提供的检测结果,分别绘制各患者血清样品的ROC曲线(受试者工作特征曲线),结果表明:
检测肝硬化和正常样本的特异性为82.6%、灵敏度为95.9%,如图5;
检测肝癌和正常样本的特异性为66.1%、灵敏度为96.9%,如图6;
表明,本发明的试剂盒能够显著区分各肝癌患者样本和正常人样本,检测灵敏度和特异性高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种检测肝癌或肝硬化相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心酶联免疫吸附法或化学发光法试剂盒,其特征在于,包括捕获抗体和检测抗体,所述捕获抗体与蛋白HKa特异性结合;所述检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合;
所述多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;
所述多肽HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述蛋白HKa的全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示;
所述捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌;
所述检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述捕获抗体为单克隆抗体或多克隆抗体;所述检测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括HKa标准品、碳酸盐包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、卵清蛋白封闭剂、底物液、硫酸终止液和96孔酶标板。
4.如权利要求1~3任一项所述的试剂盒在制备肝癌或肝硬化检测产品中的应用。
5.权利要求1~3任一项所述的试剂盒的非疾病治疗或诊断目的的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:以捕获抗体捕获待测样品中的组合式标志物中的蛋白HKa;
步骤2:以检测抗体检测上述已捕获的蛋白HKa的表位多肽HKP09或多肽HKP15;
步骤3:根据检测值绘制标准曲线,获得待测样品中“多肽-蛋白组合式标志物”的含量。
6.根据权利要求5所述的使用方法,其特征在于,所述捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌;所述检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。
7.根据权利要求5或6所述的使用方法,其特征在于,所述试剂盒中的捕获抗体包被于固相载体;优选的,固相载体为酶标板。
8.根据权利要求5或6所述的使用方法,其特征在于,所述试剂盒中的检测抗体上含有标记物质;优选的,标记物质为辣根过氧化物酶HRP。
9.根据权利要求8所述的使用方法,其特征在于,所述捕获抗体的包被浓度为1000ng/mL;所述检测抗体的检测滴度为1:2000。
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