CN117214437A

CN117214437A - 一种食管癌生物标志物、抗原、抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117214437A
Application number: CN202311003941.6A
Authority: CN
Inventors: 黄国良; 汪婧; 林洁; 李文凯
Original assignee: Guangdong Medical University
Current assignee: Guangdong Medical University
Priority date: 2023-08-09
Filing date: 2023-08-09
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本发明公开了一种食管癌生物标志物、抗原、抗体及其制备方法和应用，所述生物标志物为人SERPINB3乙酰化多肽，多肽序列为DAIK‑K(acetyl)‑FYQTSVESVDC。所述抗原为人SERPINB3乙酰化多肽与载体蛋白的偶联物。所述抗体可用于检测生物样本中人SERPINB3乙酰化多肽K125位点的乙酰化水平。本发明的检测试剂盒可用于检测不同样本之间人SERPINB3蛋白K125位点乙酰化水平的差异，本发明探讨SERPINB3蛋白K125位点乙酰化对肿瘤细胞增殖、迁移以及侵袭过程的影响，为肿瘤的诊断和预后判断、探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供新的工具。

Description

一种食管癌生物标志物、抗原、抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种食管癌生物标志物、抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor，Serpin)超家族是迄今为止发现的最大的蛋白酶抑制剂家族，该家族参与调控机体的许多生理和病理过程，比如血液凝固、纤维蛋白溶解、细胞凋亡、炎症、补体激活和细胞迁移。其中B亚族(Serpin Bfamily)是人类Serpin中最大的一个成员。Serpin B家族中很多成员都与肿瘤的发生发展密切相关，目前在消化系统肿瘤中研究较多的是Serpin B1、Serpin B3、Serpin B4、SerpinB5，其中Serpin B3能够抑制半胱氨酸蛋白酶如组织蛋白酶K、L、S和V活性，具有抗细胞调亡、促进细胞增殖和迁移作用。Serpin B3在肿瘤发生发展中有着重要作用。研究表明Serpin B3与宫颈癌、肺癌、食管癌和头颈部肿瘤等鳞状细胞癌的发生及侵袭迁移密切相关。

蛋白质乙酰化修饰，指的是在蛋白质原有基础上面嫁接上乙酰化基团，它属于蛋白质翻译后修饰的一种，包括组蛋白乙酰化和非组蛋白乙酰化，主要发生位点在赖氨酸上。蛋白质乙酰化修饰会影响蛋白质的功能作用的发挥，比如酶的活化与失活、蛋白质稳定性、亚细胞结构定位和特殊功能复合体的形成等。非组蛋白乙酰化也参与了与生理学和疾病相关的关键细胞过程，如基因转录、DNA损伤修复、细胞分裂、信号转导、蛋白质折叠、自噬和代谢。总之，对蛋白质新的乙酰化位点的研究以及乙酰化修饰组学研究能够为揭示更多病症的原因提供重要指导意义，并为疾病的治疗提供新的思路。

食管癌(又称食管鳞癌)是世界上常见十大恶性肿瘤之一，我国是世界食管癌高发国家，组织类型主要为鳞状细胞癌。食管癌起病时症状不明显，多数患者在就诊时已处于晚期，而中晚期患者术后5年总体生存率仅10％左右，如果在早期食管癌阶段即接受手术，5年生存率可达90％。因此，找到食管癌早期发现的关键技术，是减少食管癌发病率和死亡率的重要途径。目前，胃镜是临床诊断食管癌最有效的检查，但是消化道内镜检查具有侵入性，操作不便，患者较痛苦，还有感染、出血等风险，而且检测费用较贵。因此，目前亟需一种对于预测食管癌患病风险具有较高特异性和敏感性的食管癌生物标志物对食管癌进行早期筛查，以指导临床尽早进行干预和治疗。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种食管癌生物标志物、抗原多肽以及可与其特异性结合的抗体，用于检测食管癌细胞中SERPINB3多肽K125位点乙酰化水平。

本发明提供一种食管癌生物标志物，所述生物标志物为人SERPINB3乙酰化多肽，所述人SERPINB3乙酰化多肽的序列为DAIK-K(acetyl)-FYQTSVESVDC，其中acetyl表示乙酰化。

进一步的，所述食管癌生物标志物为食管癌诊断、预后、治疗效果检测的标志物中的任意一种。

本发明还提供一种抗原，所述抗原为所述人SERPINB3乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白选自KLH、OVA、THY或BSA。

本发明还提供一种抗体，可与所述人SERPINB3乙酰化多肽或所述的抗原特异性结合。

进一步的，所述多克隆抗体为利用DAIK-K(acetyl)-FYQTSVESVDC和载体蛋白的偶联物免疫非人动物接着纯化提取所述非人动物的血清后获得的。

进一步的，所述抗体用于检测生物样本中SERPINB3蛋白K125乙酰化位点的乙酰化水平。

本发明还提供一种抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1：人工合所述的人SERPINB3乙酰化多肽；

S2：人SERPINB3乙酰化多肽与载体蛋白偶联；

S3：动物免疫与采血；

S4：抗体效价检测；

S5：抗体亲和纯化；

S6：纯化后的抗体进行鉴定。

进一步的，所述的生物标志物或所述抗原或所述抗体在制备用于食管癌检测的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供一种食管癌筛查试剂盒，包括所述抗体。

进一步的，所述筛查试剂盒还包括抗原修复液、PBS缓冲溶液、酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

(1)本发明提供了一种用于检测食管癌的生物标志物，填补了食管癌乙酰化修饰蛋白标志物的空白，为生物标志物的鉴定提供新的思路。

(2)本发明采用人工合成的方式制成一段SERPINB3蛋白K125乙酰化位点的抗原多肽，以及制备相应的多克隆抗体。

(3)本发明的多克隆抗体能够特异性识别SERPINB3蛋白K125乙酰化位点，检测该位点的乙酰化水平。

(4)本发明提供了一种用于食管癌筛查的试剂盒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明的流程示意图；

图2为本发明实施例1的食管正常组织和食管癌组织中差异表达前十的乙酰化修饰蛋白热图(按差异大小由上到下排列)；

图3为本发明实施例4的ELISA实验检测结果；

图4为本发明实施例5的免疫组化切片图；

图5为本发明实施例5的差异表达箱线图；

图6为本发明实施例5的生存曲线图；

图7为本发明实施例5的ROC曲线图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明的操作流程如图1所示。

实施例1SERPINB3乙酰化多肽的合成

一、SERPINB3乙酰化多肽的获取

1.根据GenBank获得人SERPINB3蛋白氨基酸序列见如下：

>NP_008850.1

1MNSLSEANTKFMFDLFQQFRKSKENNIFYSPISITSALGMVLLGAKDNTAQQIKKVLHFD

61QVTENTTGKAATYHVDRSGNVHHQFQKLLTEFNKSTDAYELKIANKLFGEKTYLFLQEYL

121DAIKKFYQTSVESVDFANAPEESRKKINSWVESQTNEKIKNLIPEGNIGSNTTLVLVNAI

181YFKGQWEKKFNKEDTKEEKFWPNKNTYKSIQMMRQYTSFHFASLEDVQAKVLEIPYKGKD

241LSMIVLLPNE IDGLQKLEEKLTAEKLMEWTSLQNMRETRVDLHLPRFKVEESYDLKDTLR

301TMGMVDIFNGDADLSGMTGS RGLVLSGVLHKAFVEVTEEGAEAAAATAVVGFGSSPTSTN

361EEFHCNHPFL FFIRQNKTNS ILFYGRFSSP

2.用ProtParam软件分析人SERPINB3蛋白特性，结果见表1：

表1SERPINB3蛋白特性

Number of amino acids	390
		Molecular weight	27900
Theoretical pI	6.52

结果显示，人SERPINB3蛋白共含有390个氨基酸，分子量为27900道尔顿，等电点为6.52，为中性蛋白。

3.通过质谱分析获得食管正常组织和食管癌组织中差异表达的SERPINB3乙酰化，得到其125位赖氨酸发生乙酰化突变，如图2所示，相对于正常组织，SERPINB3蛋白K125乙酰化水平在食管癌中显著下调。

结果表明：SERPINB3氨基酸序列中K125位点位于SERPINB3的胞内段序列区，是SERPINB3蛋白乙酰化修饰的一个位点。SERPINB3蛋白K125位点乙酰化水平高低可能作为食管癌诊断的标志物。

经过上述分析，选用的多肽序列为DAIK-K(AC)-FYQTSVESVDC。

二、多肽的合成

为便于与载体蛋白偶联，合成多肽在C端加入一个半胱氨酸，而且第125位赖氨酸为乙酰化状态：DAIK-K(AC)-FYQTSVESVDC。同时合成一段含有非乙酰化的第125位赖氨酸多肽序列：DAIKKFYQTSVESVDC作为对照。多肽由苏州百远生物科技有限公司合成。

1.采用固相合成法合成，即先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以该结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链，重复操作，直到达到所要合成的肽链长度为止，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

2.纯化：RP-HPLC纯化

(1)HPLC条件：

流动相：A)0.1％TFA水溶液；B)0.1％TFA乙腈溶液；

梯度：A/B(90/40)到A/B(40/90)30min；

流速：1mL/min；

温度：室温(23℃)；

检测：214nm的紫外光；

样品：冻干的粗品。

(2)步骤：

a.将粗品溶解在流动相中；

b.注入20-30mg(2-2.5mL)样品；

c.将主峰收集到50mL管中；

d.冻干。

(3)鉴定：LC/MS

条件：流动相：A)0.05％TFA水溶液；B)0.1％TFA乙腈溶液；

梯度：A/B(90/10)到A/B(40/60)15min；

流速：1mL/min；

温度：室温(23℃)；

检测：214nm的紫外光；

大气压电离质谱(MS API)：电喷雾离子源(ESI)。

多肽合成结果见表2。

表2多肽合成结果

多肽合成号	多肽序列	多肽纯度(％)
			20072402	DAIK-K(AC)-FYQTSVESVDC	96.81％
20072412	DAIKKFYQTSVESVDC	96.32％

实施例2SERPINB3乙酰化多肽与载体蛋白偶联

化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)，卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽交联载体。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。

多肽偶联流程：

1.溶液准备：偶联缓冲液(AH液)包括Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，NaCl，EDTA，调pH至7.2。

2.实验步骤：

(1)柱床准备：

纯水及偶联缓冲液洗涤柱床。

(2)准备：

少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解多肽，静置半小时，待溶液中无颗粒状不溶物，加适量AH液配制成6mg/mL的多肽溶液，从多肽溶液中分出需要偶联的量。

(3)KLH、Sulfo-SMCC准备：

根据质量比，偶联多肽总量：纯KLH＝1：1，计算出纯KLH的量；按照质量比，纯KLH：Sulfo-SMCC＝10：1，计算出Sulfo-SMCC的量。

(4)KLH和Sulfo-SMCC反应与反应物收集：

将称取的KLH溶于适量的AH液配置成终浓度10mg/mL，Sulfo-SMCC用DMSO溶解成100mg/mL的溶液，将二者混合摇匀，室温反应4h并间断混摇使其充分反应，用层析柱分离样品。

(5)KLH与Sulfo-SMCC的反应物与多肽偶联：

向每一管需偶联的多肽中加入相应量KLH与Sulfo-SMCC反应物，室温反应2h或室温过夜，并用垂直混合仪混匀，将偶联好的多肽至于-20℃保存；注：使用KLH载体蛋白偶联合成多肽，所得偶联肽作免疫抗原用。

实施例3抗SERPINB3多肽兔多克隆抗体制备

1.免疫与采血流程见表3：

表3免疫与采血流程

2.抗体效价ELISA检测方法

①血清ELISA检测：

(1)溶液准备：

包被液：50mM Na₂CO₃(pH9.6)，20mM Tris HCl(pH8.5)或10mM PBS(pH7.4)；

封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等；

洗涤液：PBST或纯水。

(2)实验步骤：

a.将抗原按适当浓度溶解于包被液中；

b.在对应的孔中加入100μL抗原，4℃过夜；

c.倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；

d.每孔加200μL封闭液，37℃孵育1小时；

e.倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；

f.每孔加100μL一抗，37℃孵育1小时；

g.倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；

h.每孔加100μL二抗，37℃孵育1小时；

i.倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；

j.拍干孔中残留液体，每孔加100μL显色液，7℃避光显色10min；

k.每孔加50μL 2M H₂SO₄终止显色，并立即读取450nm的OD值。

(3)血清ELISA检测结果见表4：

表4血清ELISA检测结果

注：以上兔号混合血清ELISA显示转阳(1：27000，OD值>1.0)，进行抗原亲和纯化并进行ELISA抗体鉴定。

②抗体亲和纯化结果见表5：

表5抗体亲和纯化结果

③抗体ELISA结果见表6：

表6抗体ELISA结果

该项目免疫的R01751血清及抗体(SA201124X02)ELISA检测(与乙酰化抗原反应)为阳性，且抗体在浓度为0.125μg/mL时与乙酰化抗原(20072402)的反应远大于与非乙酰化抗原(20072412)的反应值；R01752血清及抗体(SA201125X02)ELISA为阳性，且抗体在浓度为0.125μg/mL时与乙酰化抗原(20072402)的反应远大于与非乙酰化抗原(20072412)的反应值；两步亲和法纯化抗体，共获得乙酰化化抗体9.05mg。

以上结果表明本实施例制备的抗体效果良好，制备成功。

实施例4抗SERPINB3多肽兔多克隆抗体鉴定

一、抗SERPINB3(acK125)多克隆抗体的ELISA鉴定

鉴于acSERPINB3-Lys125位点的乙酰化尚未见相关报道，因此本发明委托公司定制了acSERPINB3-Lys125抗体。

(1)将多肽SERPINB3-Lys125(Lys125未乙酰化的对照组)和acSERPINB3-Lys125(Lys125乙酰化处理的实验组)，用1×CBS包被液溶解成0.2μg/100μL，铺至每个酶标板的孔中100μL，4℃过夜包被。

(2)第二天取出包被好的酶标板，甩干包被液，拍板。

(3)加封闭液(3％BSA)，每个孔加200μL，37℃孵育2h。

(4)封闭完毕后，取出酶标板，洗板三次，每个孔中加入300μL的PBST静置2min后甩干(避免孔与孔之间的污染)，将板拍在干净的纱布上，将孔内的液体拍干为佳。

(5)可直接进行下一步实验，也可用自封袋包装好，4℃保存备用。

(6)将SERPINB3一抗以1:4000的稀释浓度，加入每孔100μL，37℃孵育1h。

(7)1h后将酶标板取出，洗板三次后加入HRP二抗，37℃孵育30min。

(8)30min后将酶标板取出，洗板三次后加入TMB显色剂37℃避光孵育15min。

(9)15min后将酶标板取出(变蓝)，立即加入终止液，酶标仪震荡30s，450nm读数，分析结果。

如图3所示，acSERPINB3-Lys125抗体与acSERPINB3-Lys125抗原结合的OD值是明显大于acSERPINB3-Lys125抗体与非乙酰化SERPINB3-Lys125抗原结合的OD值，并且acSERPINB3-K125抗体与acSERPINB3-K125抗原结合的OD值是随着抗体浓度的稀释而减小的，结果提示该acSERPINB3-K125抗体为具有一定特异性的acSERPINB3-K125位点的抗体。

上述试验结果证明本发明的乙酰化多克隆抗体可特异性识别SERPINB3蛋白acK125乙酰化位点。

实施例5抗SERPINB3(acK125)多克隆抗体的组织免疫组化鉴定

选用食管癌组织芯片进行免疫组化，验证ac-SERPINB3(K125)抗体在食管癌和食管癌旁组织中的表达差异。

1.实验步骤：

(1)入60℃烤箱烤片2小时。

(2)切片脱蜡水化程序：

a.环保透明剂摇床脱蜡10分钟3次；

b.100％—95％—85％—75％—50％乙醇各浸泡5分钟。

(3)超纯水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。

(4)抗原热修复：将EDTA(1X)抗原修复液与微波盒中将热至沸腾，将石蜡切片放入放入沸腾的抗原修复液中，中档微波处理20～30分钟。

(5)停止加热，室温冷却20～30分钟。

(6)将抗原修复后切片置超纯水，浸泡2次各3分钟，之后用PBS摇洗3次各3分钟。

(7)将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3％H₂O₂，避光室温孵育15分钟。PBS缓冲液摇洗3次各5分钟。

(8)取出切片，滴加一抗60μL，滴加一抗后放入专用孵育盒内，4℃冰箱过夜。

(9)第二天，取出切片复温30分钟，随后放入PBS缓冲液中清洗3次各5分钟，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色(前两次的PBS倒掉)。

(10)擦干组织周围液体后滴加60μL辣根酶标羊抗兔IgG聚合物(根据实际情况要求覆盖样本)，室温孵育20分钟，PBS缓冲液洗涤3分钟重复3次。

(11)显色，滴加现配适量DAB显色剂，室温显色，5～20分钟。自来水终止显色。

(12)复染，苏木素染液中染色5～10分钟，水洗，将切片置于盐酸乙醇快速分化液浸泡15秒左右，继续水洗，将切片至于0.5％氨水中10秒，水洗。

(13)将切片依次置于75％乙醇—85％乙醇—95％乙醇—100％乙醇中各3分钟。

(14)取出后将切片依次置于透明剂浸泡5分钟重复3次。

(15)中性树胶封片，光学显微镜下观察。

2.鉴定结果

将免疫组化实验过后的食管癌切片于显微镜下观察如图4所示，食管癌组织中染色部分相对与癌旁组织中较少。免疫组化统计结果如图5所示，SERPINB3(acK125)蛋白在癌旁组织中的表达量高于食管癌；对于食管癌芯片180个点的癌与癌旁做统计分析，使用日本滨松数字病理扫描仪进行芯片扫描，使用image Pro plus软件进行染色强度评分。对癌组织的SERPINB3-K125乙酰化蛋白表达量进行了ROC分析，选取了特异性和敏感性程度最高的点作为划分标准，对于高低表达分组进行了划分。Kaplan-Meier生存分析结果显示如图6所示，在癌组织中，SERPINB3-K125乙酰化蛋白表达量高时，患者生存时间明显延长(P<0.0001)。本实施例对于癌和癌旁组织的表达量进行了统计分析，结果如图7所示，ROC曲线显示其曲线下面积为0.81，具有诊断意义。

以上结果证明本发明的SERPINB3(acK125)蛋白在癌组织中对患者生存有利，与肿瘤细胞密切相关，乙酰化多克隆抗体可特异性识别SERPINB3乙酰化K125位点，检测该位点的乙酰化水平，可以达到肿瘤诊断及临床预后判断的目的。

实施例6一种检测试剂盒及使用方法

一、检测试剂盒具体包括如下组分：

多克隆抗体(实施例3所制备的抗体)。

还可以包含抗原修复液、PBS缓冲溶液、酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。

抗原修复液可为EDTA(1X)抗原修复液；

PBS缓冲溶液pH为7.4；

阻断剂为内源性过氧化物酶阻断剂，如3％H₂O₂；

环保透明剂为Van-Clear环保透明剂。

二、本实施例还提供上述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将待检测组织常规石蜡切片，经过环保透明剂、乙醇分别摇床脱蜡，超纯水漂洗。

(2)将抗原修复液加热至沸腾，将石蜡切片放入沸腾的抗原修复液中，中高档微波处理，室温冷却后置于超纯水中浸泡，之后用PBS摇洗3次。

(3)将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3％H₂O₂，避光室温孵育，PBS缓冲液摇洗。

(4)取出切片，滴加经过稀释的针对人SERPINB3蛋白K125位点的乙酰化抗体(实施例3制备的抗体)，放入孵育盒内，4℃冰箱过夜，放入PBS缓冲液中充分洗涤。

(5)擦干组织周围液体后滴加辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育，PBS缓冲液洗涤，滴加现配适量DAB显色剂，室温显色，自来水终止显色，苏木素染液中染色，水洗后将切片置于0.5％氨水中浸泡，继续水洗。

(6)将切片依次置于乙醇中，取出后将切片置于透明剂，用中性树胶封片，光学显微镜下观察。

本发明选择了SERPINB3蛋白包含第125位苏氨酸位点(K125)的附近14肽作为候选多肽，并用人工方法进行包含acK125的多肽合成及完全抗原制备。通过质谱分析获得食管正常组织和食管癌组织中差异表达的SERPINB3乙酰化，得到其125位赖氨酸发生乙酰化突变，确定合适的一段肽序列进行人工合成。将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过五次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用多肽包被的溴化氰活化的琼脂糖(CNBr-activated sepharose)亲和纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA及免疫组化鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别SERPINB3蛋白acK125位点。通过生存曲线以及ROC曲线分析，表明可通过检测肿瘤细胞该位点的乙酰化水平为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种食管癌生物标志物，其特征在于，所述食管癌生物标志物为人SERPINB3乙酰化多肽，所述人SERPINB3乙酰化多肽的序列为DAIK-K(acetyl)-FYQTSVESVDC，其中acetyl表示乙酰化。

2.根据权利要求1所述的食管癌生物标志物，其特征在于，所述食管癌生物标志物为食管癌诊断、预后、治疗效果检测的标志物中的任意一种。

3.一种抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1所述的人SERPINB3乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白选自KLH、OVA、THY或BSA。

4.一种抗体，其特征在于，所述抗体可与权利要求1所述人SERPINB3乙酰化多肽和/或权利要求3所述的抗原特异性结合。

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述多克隆抗体为利用DAIK-K(acetyl)-FYQTSVESVDC和载体蛋白的偶联物免疫非人动物接着纯化提取所述非人动物的血清后获得的。

6.根据权利要求4～5任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体用于检测生物样本中SERPINB3蛋白K125乙酰化位点的乙酰化水平。

7.一种抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：人工合成权利要求1所述的人SERPINB3乙酰化多肽；

S2：人SERPINB3乙酰化多肽与载体蛋白偶联；

S3：动物免疫与采血；

S4：抗体效价检测；

S5：抗体亲和纯化；

S6：纯化后的抗体进行鉴定。

8.权利要求1所述的生物标志物或权利要求3所述抗原或权利要求4～6任一项所述抗体在制备用于食管癌检测的试剂或试剂盒中的应用。

9.一种食管癌筛查试剂盒，其特征在于，包括权利要求4～6任一项所述的抗体。

10.根据权利要求9所述的筛查试剂盒，其特征在于，所述筛查试剂盒还包括抗原修复液、PBS缓冲溶液、酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。