JP5978128B2 - 線維症バイオマーカアッセイ - Google Patents
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Description
線維形成は、通常は組織損傷から生じる複雑な細胞および分子機構を含む動的過程である6。線維形成は、漸進的な機能障害を伴う、組織の大きさと密度の増大をもたらす巨大分子の濃度を変化させる正常なECM調節が不均衡である結果である。これらの巨大分子は、主として、コラーゲンおよびプロテオグリカンなどの構造および接着機能を有する線維性タンパク質である。
コラーゲンは人体に広く分布する、すなわち人体のタンパク質質量の約30%がコラーゲンから成る。コラーゲンは大部分の結合組織のECMの構造的完全性に関与する。ECM含量は、遺伝子発現とタンパク質分泌の調節を介して、同時にまた内因性プロテアーゼ阻害ならびにメタロプロテイナーゼおよびシステインプロテアーゼによるタンパク質分解を介して、厳密に制御される合成と分解の微妙なバランスから生じる7〜9。表2は、主要なコラーゲン型をそれらの主要な組織分布と共に列挙する。
エラスチンは、多くの結合組織、主として弾性の結合組織中に存在するタンパク質である。アミノ酸のグリシン、バリン、アラニンおよびプロリンの非常に高い含量を有し、分子量は64〜66kDaである。830個のアミノ酸から成る不規則なまたはランダムなコイル立体配座で構成されている。エラスチンは、リシルオキシダーゼによって触媒される反応において、多くの可溶性トロポエラスチンタンパク質分子を連結し、不溶性で耐久性のある巨大な架橋アレイを作製することによって作られる。
ビメンチンは、中間径フィラメントファミリーのタンパク質の成員である。中間径フィラメントは真核細胞の重要な構造特徴である。それらは、微小管およびアクチンミクロフィラメントと共に、細胞骨格を構成する。大部分の中間径フィラメントは安定な構造であるが、線維芽細胞においては、ビメンチンは動的構造体として存在する。このフィラメントは中胚葉由来組織についてのマーカとして使用され、それ自体、肉腫の免疫組織化学的マーカとして使用されてきた。
プロテオグリカンは、様々な数のグリコサミノグリカン(GAG)側鎖をコアタンパク質に共有結合連結する、多様な巨大分子群である16。これらのGAGは二糖の繰り返し単位(例えばN−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン)の重合体であり、それらは二糖単位上のヒドロキシル、カルボキシルおよび硫酸側鎖のために酸性である(負に荷電している)。これによりGAGは高度に親水性であり、従って水および陽イオン(例えば細胞外液からのナトリウム)の拡散を助ける17。さらに、GAGは、例えばヒアルロン酸鎖と非共有結合連結を形成して、さらに一層大きな分子複合体を形成する能力を有する16。表4は、結合組織に関連する、最も広く検討されているプロテオグリカンを列挙する。
C反応性タンパク質(CRP)は、炎症、感染または外傷などの種々の臨床状態に応答して肝臓によって産生される急性期血清タンパク質である29。CRPの産生は、罹患組織または損傷組織から放出される、IL−6などのサイトカインによって誘導される。CRPの生理的役割はまだ不明であり、その前炎症作用または抗炎症作用に関する検討が進められている。
線維形成の間のECMの合成と分解の不均衡は、低密度の内皮下マトリックスの、間質コラーゲンに富むマトリックスへの変換から生じる。コラーゲンおよびプロテオグリカンの増加は、(1)タンパク質産生の減少および(2)タンパク質分解の低下の一方または両方によると考えられる。タンパク質分解の低下は、最近ますます関心を集めている。このプロセスの調節において、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)およびそれらの組織阻害剤(TIMP)は、システインプロテアーゼおよびシスタチンなどの他のプロテアーゼおよびそれらの阻害剤と同様に、重要な役割を果たす。
MMPは、ECMの、すべてではないにせよ大部分の成分を分解することができる、エンドペプチダーゼの大きな群である。現在、25を超えるMMPが発見されている。MMPは、金属原子、典型的には亜鉛を含む活性部位を特徴とし、チモーゲンとして分泌される。種々のMMPが種々の組織で発現される。表5では、肝臓中のMMPを示す。
線維芽細胞活性化タンパク質αサブユニット(FAPαまたはFAP、α)は、セリンプロテアーゼファミリーに属する内在性膜ゼラチナーゼである。FAPαは、170kDaメラノーマ膜結合ゼラチナーゼ、内在性膜セリンプロテイナーゼ、およびセプラーゼとしても知られるヘテロ二量体膜結合プロテイナーゼ複合体のαサブユニットであり、DPP4(CD26)はβサブユニットである。一部の細胞はFAPαホモ二量体だけを作製し、また別の細胞はDPP4ホモ二量体だけを作製する。単量体は不活性である。FAPαは、上皮癌の反応性間質線維芽細胞、治癒創傷の顆粒組織、ならびに骨および軟組織肉腫の悪性細胞において選択的に発現される33。このタンパク質は、発生、組織修復および上皮癌発生の過程で線維芽細胞増殖の制御または上皮間葉相互作用に関与すると考えられる。FAPの発現は線維症の病期と共に上昇することが示されている34、35。
多くの生化学的マーカが、疾患の特異的な生成物ではないが、線維性疾患に関して示唆されてきた。表7は、臨床試験で使用される肝線維症の生化学的マーカの例である。加えて、他の線維性疾患のバイオマーカの数多くの例が存在する12、36〜42。
前記試料中に天然に存在するタンパク質断片を、プロテイナーゼによるタンパク質の切断によって形成されるネオエピトープと反応性の免疫学的結合パートナと接触させるステップと、前記ネオエピトープを含むタンパク質断片を測定するために、ここで、前記免疫学的結合パートナへのペプチド断片の結合の程度を測定するステップとを含む方法によって実施され、前記タンパク質は、ニューロカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、セルグリシン、シンデカン、βグリカン、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、CRPまたはビメンチンであり、但し、ネオエピトープがI型コラーゲンの切断によって形成される場合、切断は、I型コラーゲンがカテプシンKによって切断される部位ではないことを条件とする。場合により、本発明によるアッセイは、III型コラーゲン以外の上記に挙げたタンパク質の1つに基づくか、またはIII型コラーゲンに基づく場合、切断部位で形成されるネオエピトープ、PGIPGRNGDP* 配列番号1、*ESCPTGPQNY 配列番号2、またはPKGDTGPRGP* 配列番号3(*は切断部位を示す)の1つに対する免疫学的結合パートナを利用する。
I型コラーゲン
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位(「.」で示す)でI型コラーゲンを切断すると判定した。
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位(*で示す)でIII型コラーゲンを切断すると判定した。
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位(「.」で示す)でIV型コラーゲンを切断すると判定した。
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位(「.」で示すか、または「.」が存在しない場合は配列の末端)でV型コラーゲンを切断すると判定した。
本発明者らは、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位(「.」で示すか、または「.」が存在しない場合は配列の末端)でVI型コラーゲンを切断すると判定した。
本発明のもう1つの態様では、前記ペプチド断片は、プロテオグリカンのバーシカン、ルミカン、パールカン、ビグリカンおよびデコリンの断片であり、それらはすべて線維性組織において同定される。
いくつかの候補プロテアーゼは線維組織中のCRPの消化に関与すると考えられ、文献は、線維性組織中の多くの異なるプロテアーゼを報告している。おそらく、これは、最終的に線維症へと至る広範囲の複雑なプロセスの結果である。しかし、本発明者らの評価では、初期は様々なMMPで構成され得るが、後期はマトリックスのカテプシンK分解に大きく依存すると考えられ、疾患のレベルに依存して異なるネオエピトーププロフィールを生じさせる。本発明者らは、純粋な天然タンパク質の様々なインビトロ切断を通して、以下の表に列挙する酵素が少なくとも以下の切断部位(表20では*で示すが、表21では各配列の末端)でCRPを切断すると判定した。
いくつかの候補プロテアーゼは、線維性組織中のエラスチンの消化に関与し得る。本発明者らは、純粋な天然タンパク質の様々なインビトロ切断を通して、以下の表に列挙する酵素が、少なくとも以下の配列の各末端の切断部位で、または「.」で示す切断部位で、または「.」が示されていない場合は配列の末端でエラスチンを切断すると判定した。
いくつかの候補プロテアーゼは、線維性組織中のビメンチンの消化に関与し得る。本発明者らは、純粋な天然タンパク質の様々なインビトロ切断を通して、以下の表に列挙する酵素が、少なくとも以下の配列の各末端の切断部位で、または「.」で示す切断部位で、または「.」が示されていない場合は配列の末端でビメンチンを切断すると判定した。
方法
切断:ヒト胎盤から単離したIII型コラーゲンを10mM酢酸に溶解した(1mg/ml)。次に混入断片を除去するためにタンパク質溶液をフィルター(Microcon Ultracel YM−10)に通した。MMP−9を酢酸4−アミノフェニル水銀(APMA、Sigma)で37℃にて3時間予備活性化した。活性化後、III型コラーゲンとMMP−9を100:1で混合し、37℃で3日間、振とうしながらインキュベートした。
方法:40匹の雌性Sprague−Dawleyラット(6ヶ月齢)をNordic Bioscienceの動物実験施設に収容した。実験は、デンマーク法務省の実験動物委員会(Experimental Animal Committee of the Danish Ministry of Justice)によって承認され、臨床試験実施基準のヨーロッパ規格(European Standard for Good Clinical Practice)(2008/561−1450)に従って実施された。ラットを、敷き料および巣材(Altromin 1324;Altromin,Lage,Germany)と共に標準的なIII−H型ケージに18〜22℃で収容し、精製水(Milli−Q system;Millipore,Glostrup,Denmark)を自由に摂取させた。ラットを12時間の明/暗周期の条件下で飼育した。
CO3レベルを、3つの異なる線維性疾患(慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症およびC型ウイルス性肝炎(HCV))を有するヒトからの血清中で測定した。血清試料はSera Laboratories International Ltd(SLI Ltd),UKから入手した。CO3レベルは、3つの異なる線維性疾患において上昇していた(図3)。
III型コラーゲン(Abcam,Cambridge,UK)を活性化MMP−9(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)によってインビトロで2日間分解した。分解断片をLS−MS/MSによって配列決定し、MASCOT検索によって同定した。特定ペプチド配列、610KNGETGPQを抗体作製のために選択した。この配列のN末端はヒトIII型コラーゲンの残基610である。合成ペプチドをオボアルブミンに結合した後、4〜6週齢のBalb/Cマウスを乳化抗原約200μLおよびCO3−610C(KNGETGPQGPGGC−OVA)50μgにより皮下免疫した。安定な血清力価レベルに達するまで、フロイント不完全アジュバント中、2週間の間隔で連続免疫を実施した。2回目の免疫時からマウスを採血した。各採血時に、血清力価を測定し、最も高い抗血清力価を有するマウスを融合のために選択した。4回目の免疫後、このマウスを1ヶ月間休息させ、次に0.9%塩化ナトリウム溶液100μL中のCO3−610C 50μgで3日間静脈内追加免疫した後、細胞融合のために脾臓を単離した。
試験動物
40匹の6ヶ月齢の雌性Sprague−DawleyラットをNordic Bioscience,Copenhargen,Denmarkの動物実験施設に収容した。実験は、デンマーク法務省の実験動物委員会によって承認され、臨床試験実施基準のヨーロッパ規格(2008/561−1450)に従って実施された。ラットを、敷き料および巣材(Altromin 1324;Altromin,Lage,Germany)と共に標準的なIII−H型ケージに18〜22℃で収容し、水を自由に摂取させた。ラットを12時間の明/暗周期の条件下で飼育した。
20匹のラットにおいて、肝線維症を総BDLによって誘発した。手術手順は無菌条件下で実施した。ラットを麻酔し、胆管の位置を特定して、2か所で結紮し、次いで結紮の間を切断して、腹部を閉じた。その他の20匹のラットは偽手術に供し、胆管結紮を行わずに腹部を閉じた。次にラットを2つの群に分けた。第1群(BDLラット10匹と偽手術ラット10匹)は2週間後に犠死させ、第2群(BDLラット10匹と偽手術ラット10匹)は4週間後に犠死させた。試験期間(2または4週間)の終了時に、少なくとも14時間の絶食後、すべての生存動物をCO2によって窒息させ、瀉血によって犠死させた。
基線時および終了時に軽いCO2/O2麻酔下で、少なくとも14時間の絶食後にラットの後眼窩洞から血液試料を採取した。血液を室温で30分間放置して凝固させ、次いで1500gで10分間遠心分離した。血餅を取り除いた液体全部を新鮮な管に移し、再び1500gで10分間遠心分離した。次に血清を清浄な管に移し、−80℃で保存した。
ラットを安楽死させた後、肝臓を慎重に切開し、計量して、4%ホルムアルデヒド中に少なくとも24時間固定し、適切な切片に切断して、パラフィンに包埋した。5μmの厚さの切片を切断し、スライドガラスに載せて、シリウスレッドで染色した。肝切片を、構造、炎症の存在、胆管の増殖および線維症の評価によって組織学的に評価した。実質中の新たな胆管形成を、以下の採点法を用いて半定量的に評価した:正常=0、軽度の変化(1/3以下の罹患小葉)=1、中等度の変化(1/3〜2/3の罹患小葉)=2、および重度の変化(2/3以上の罹患小葉)=3。40倍および100倍の倍率のOlympus BX60顕微鏡とOlympus 5050ズームデジタルカメラ(Olympus,Tokyo,Japan)を使用してデジタル写真を撮影した。
市販のQuickZyme Collagen Assay(QuickZyme Bioscience,Leiden,The Netherlands)を使用して総コラーゲン濃度を検定した。市販のRat CTX−IIキット(IDS Nordic,Herlev,Denmark)を使用してCTX−IIの濃度を検定した。すべての試料を2回重複して検定した。
肝組織試料中のIII型コラーゲン(Col3a1)の転写産物の数を、蛍光レポータープローブを用いて定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって測定した。試料中のCol3a1コピー数を、Col3a1プラスミドcDNA Image Clone 7097081(Geneservice,Cambridge,UK)を希釈標準品として使用して得た標準曲線から推定した。Col3a1の量を、ハウスキーピング遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(Hprt1)の量で基準化した。Col3a1およびHprt1 mRNAについてのプライマーおよびプローブは、それぞれNCBI参照配列NM_032085.1およびNM_012583.2(TIB Molbiol GmbH,Berlin,Gemany)を鋳型として用いて設計した。Absolutely RNA Miniprepキット(Stratagene,La Jolla,CA,USA)を製造者の指示に従って使用して全RNAを凍結肝試料から抽出し、2100 Bioanalyzer装置(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)を用いてその品質をRNAナノチップ中で評価した。RNAの単離後すぐに、1μgのRNAを鋳型として用いて、Transcriptor First Strand cDNA合成キット(Roche,Basel,Switzerland)で相補的DNA(cDNA)を合成した。試験した各々の試料について、反応混合物から逆転写酵素を除いた、cDNA合成陰性対照を含めた。Col3a1およびHprt1について別々のPCR反応を、Lightcycler Faststart DNA Master Plus Hybprobeキット(Roche)を製造者の指示に従って使用して20μL形式で実施した。リアルタイム蛍光データをLightcycler 2.0装置(Roche)で収集した。
組織をスチール製粉砕機中の過剰の液体窒素中で粉砕した。次に試料を1.5mlエッペンドルフ管に移し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含有する0.5M酢酸溶液中、4℃で一晩振とうした。次に試料を、60%振幅の5パルスを用いて超音波で破砕し(U50 control、IKA Labortechnik)、4℃でさらに2時間放置した後、13,000rpmで5分間遠心分離した。上清を慎重に取り出し、新しいエッペンドルフ管に移して、−80℃で保存した。
Silk Scientific(give city,country)からのUN−SCAN−ITバージョン6.1を用いてデンシトメトリー測定を実施した。
シリウスレッドで染色した組織学的切片を、Visiopharmソフトウエアバージョン3.2.8.0(give city,country)を用いて分析した。Pixelink PL−A623C顕微鏡デジタルカメラを用いて画像を取得した。
組織抽出物20μgを、還元剤(InvitrogenからのNuPAGE、NP0004)を含有する充填緩衝液(Invitrogen LDS 4x、NP0007)と混合した。次に試料を4〜12%ビス−トリス勾配ゲル(InvitrogenからのNP0332BOX)に充填し、200Vで52分間泳動させた。その後i−Blotトランスファーシステム(Invitrogen)を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、(? Need to spell out?)TTBS中5%乳を用いて4℃で一晩ブロックした。βアクチン抗体(AbCam ab8229,give company,city country?)を充填対照として使用した。
平均値および平均の標準誤差(SEM)を、GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA,USA)を用いて計算し、正規分布を仮定した統計的有意性のスチューデント両側ペアードt検定によって(α=0.05)、またはマン−ホイットニー両側ノンパラメトリック検定によって(α=0.05)比較した。相関係数(R2)および対応するp値を線形回帰によって決定した。
肝臓の外観:犠死の時点で、対照動物の肝臓は正常な全体形態を示したが、BDL動物の肝臓は腫脹していた。肝重量は、偽手術対照と比較してBDLラットでは有意に増大していた(犠死時の平均重量:手術後2週間目、偽手術では8.1g;BDLでは14.1g;手術後4週間目、偽手術では9.0g;BDLでは19.4g)(図4、パネルA)。0〜3等級を用いた肝切片の半定量的採点は、2週間目と比較して4週間目では肝臓の有意に大きな構造変化を示した(図4、パネルB)。図4、パネルAは、胆管結紮(BDL)ラットまたは偽手術ラットにおける肝重量を示す。データは平均+SEMで示している。***、P<0.0001。パネルBは、各群の肝臓における構造変化の採点を示す。データは平均+SEMで示している。**、P=0.0094。パネルCは、手術後2週間目と4週間目の偽手術ラットおよびBDLラットにおける肝構造を示すシリウスレッド顕微鏡写真を示す。門脈路の周囲の肝構造は、偽手術ラットと比較してBDLラットでは明らかに破壊されている。コラーゲンを赤色で強調している。もとの倍率は40倍であった。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)(n=5)、強皮症(n=5)、慢性C型肝炎ウイルス感染症(n=5)を有する患者、および健常対照(n=5)からヒト血清試料を得た。CO3−610断片の濃度を測定するために血清試料をCO3−610ELISAにおいて試験した(上記実施例4参照)。結果を図10に示す。健常被験者からの血清試料は30ng/ml未満のCO3−610C断片の濃度を有していたが、疾患被験者は循環中で高いレベルを有することが認められ、罹患線維症組織における大量の組織リモデリングを示唆した。
マウスを、オボアルブミンに結合した合成ペプチドKAFVFP(配列番号1167)(KAFVFPKESD−GGC−OVA(配列番号1049))で免疫し、脾細胞を融合のために使用して、モノクローナル抗体を、ストレプトアビジンで前被覆したマイクロタイタープレートのウエル中に固定化したビオチニル化KAFVFP(配列番号1167)、すなわち(KAFVFPKESD−ビオチン(配列番号1049))に対する反応性に関して試験した。ビオチニル化KAFVFPKESD(配列番号1049)に結合する抗体をさらなる特徴づけのために選択し、前記抗体は、KAFVFPKESD(配列番号1049)との共インキュベーションによって阻害され得るが、伸長ペプチドRKAFVFPKESD(配列番号1166)によっては阻害されない。好ましいモノクローナル抗体をNB94−37−1A7と称した。
試験動物および肝硬変の誘発:
この試験は、線維症または肝硬変を有する52匹の雄性Wistarラットと35匹の雄性Wistar対照ラットを含んだ。ラットに線維症または肝硬変を発症させるために、四塩化炭素(CCl4)およびフェノバルビタール処置による誘発プログラムに3ヶ月齢の動物を含めた。CCl4を吸入によって週に2回投与し、フェノバルビタール(0.3g/l)を飲料水に添加した。試験期間を通じて動物には水と飼料を自由に摂取させた。
肝切片(4μm)を飽和ピクリン酸(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)中の0.1%シリウスレッドF3B(Sigma−Aldrich)で染色した。各動物につきシリウスレッド染色肝切片の36視野を分析することによって相対的線維症面積(総肝面積のパーセンテージとして表す)を評価した。各々の視野を10倍の倍率で取得した[E600顕微鏡(Nikon)およびRT−Slider SPOTデジタルカメラ(Diagnostic Instruments,Inc.,Sterling Heights,MI)。結果をコンピュータ化Bioquant Life Science形態計測システムを用いて分析した。相対的線維症面積を評価するため、測定されたコラーゲン面積を正味の視野面積で除して、次に100を乗じた。総視野面積から血管内腔面積を差し引いて正味線維症面積の最終算定を得た。分析した各動物から、パーセンテージとしての線維症の量を測定し、平均値を提示した。
動物を線維症および肝硬変の4つの異なる病期に分類し(A群:中等度の線維症、B群:進行した線維症、C群:中等度の肝硬変、およびD群:進行した肝硬変)、この分類は、シリウスレッド陽性肝面積のパーセンテージによって決定した(A群:<5%、B群:5〜10%、C群:10〜15%およびD群:>15%)。このために、対照ラットと線維症/肝硬変ラットを、CCl4処置の間の4つの異なる時点:肝硬変誘発プログラムの開始後8、12、16および20週間目を考慮して検討した。
サンドイッチELISAキット(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN,USA)を用いて血清ヒアルロナンを測定した。
結果の統計分析は、適切な場合は不対スチューデントt検定によって実施した。データは平均±S.E.M.として表し、0.05以下のp値を有意とみなした。
このプロトコールに含めた動物を以下の群の1つに無作為に割り当てた。A/8週間のCCl4処置、B/12週間のCCl4処置、C/16週間のCCl4処置およびD/20週間のCCl4処置。並行して、4つの対照群を同じ時点で検討した。13匹の線維症ラットと7匹に対照ラットを各々の群に含めた。試験終了時に、3日間の適応地期間中ラットを標準的な代謝ケージ(Tecniplast Deutschland,Hohenpeissenberg,Germany)に入れ、その後24時間の尿収集を実施した。尿量を重量測定で決定した。適応期間中、ラットに水道水と飼料を自由に摂取させた。次に、24時間の尿試料を2,500rpmで5分間遠心分離し、10のポリプロピレンチューブに分取した(各々400μL)。尿試料をその後の分析のために−80℃で保存した。
モデルの組織学的有効性確認:
肝コラーゲンを、肝切片のシリウスレッド染色によってすべての試験動物において定量した。各動物についての最終データを、36の連続する顕微鏡視野で観察されたレッド染色の平均として収集した(図12)。
マウスをPBSまたはブレオマイシンの皮膚への適用によって処置した。MMP−9媒介性III型コラーゲン(CO3)分解断片CO3−610Cの尿中レベルの上昇は、マウスにおける皮膚線維症の進行と関連した。
Claims (1)
- 線維症の患者から採取された生体液試料中に天然に存在するネオエピトープ含有タンパク質断片を免疫検定法により測定する方法であって、前記免疫検定法が、
前記試料中に天然に存在するタンパク質断片を、ペプチド配列:KNGETGPQからなるネオエピトープと反応性の免疫学的結合パートナと接触させること、および前記ネオエピトープを含むタンパク質断片を測定するために前記免疫学的結合パートナへのペプチド断片の結合の程度を測定することを含む方法によって実施される、方法。
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