JP6389168B2 - 病的な軟骨代謝回転の決定 - Google Patents
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Description
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸77であり、フラグメントは、配列番号18のC末端から始まり配列番号18のN末端に向かって伸長する配列番号18の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸88であり、フラグメントは、配列番号19のC末端から始まり配列番号19のN末端に向かって伸長する配列番号19の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸90であり、フラグメントは、配列番号20のC末端から始まり配列番号20のN末端に向かって伸長する配列番号20の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸104であり、フラグメントは、配列番号21のC末端から始まり配列番号21のN末端に向かって伸長する配列番号21の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸190であり、フラグメントは、配列番号22のC末端から始まり配列番号22のN末端に向かって伸長する配列番号22の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸194であり、フラグメントは、配列番号23のC末端から始まり配列番号23のN末端に向かって伸長する配列番号23の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸226であり、フラグメントは、配列番号24のC末端から始まり配列番号24のN末端に向かって伸長する配列番号24の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸531であり、フラグメントは、配列番号25のC末端から始まり配列番号25のN末端に向かって伸長する配列番号25の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸554であり、フラグメントは、配列番号26のC末端から始まり配列番号26のN末端に向かって伸長する配列番号26の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸574であり、フラグメントは、配列番号27のC末端から始まり配列番号27のN末端に向かって伸長する配列番号27の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸577であり、フラグメントは、配列番号28のC末端から始まり配列番号28のN末端に向かって伸長する配列番号28の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸657であり、フラグメントは、配列番号29のC末端から始まり配列番号29のN末端に向かって伸長する配列番号29の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸691であり、フラグメントは、配列番号30のC末端から始まり配列番号30のN末端に向かって伸長する配列番号30の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸710であり、フラグメントは、配列番号31のC末端から始まり配列番号31のN末端に向かって伸長する配列番号31の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸725であり、フラグメントは、配列番号32のC末端から始まり配列番号32のN末端に向かって伸長する配列番号32の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含む。
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸78であり、フラグメントは、配列番号33のN末端から始まり配列番号33のC末端に向かって伸長する配列番号33の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸89であり、フラグメントは、配列番号34のN末端から始まり配列番号34のC末端に向かって伸長する配列番号34の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸91であり、フラグメントは、配列番号35のN末端から始まり配列番号35のC末端に向かって伸長する配列番号35の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸105であり、フラグメントは、配列番号36のN末端から始まり配列番号36のC末端に向かって伸長する配列番号36の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸191であり、フラグメントは、配列番号37のN末端から始まり配列番号37のC末端に向かって伸長する配列番号37の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸195であり、フラグメントは、配列番号38のN末端から始まり配列番号38のC末端に向かって伸長する配列番号38の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸227であり、フラグメントは、配列番号39のN末端から始まり配列番号39のC末端に向かって伸長する配列番号39の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸532であり、フラグメントは、配列番号40のN末端から始まり配列番号40のC末端に向かって伸長する配列番号40の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸555であり、フラグメントは、配列番号41のN末端から始まり配列番号41のC末端に向かって伸長する配列番号41の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸575であり、フラグメントは、配列番号42のN末端から始まり配列番号42のC末端に向かって伸長する配列番号42の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸578であり、フラグメントは、配列番号43のN末端から始まり配列番号43のC末端に向かって伸長する配列番号43の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸658であり、フラグメントは、配列番号44のN末端から始まり配列番号44のC末端に向かって伸長する配列番号44の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸692であり、フラグメントは、配列番号45のN末端から始まり配列番号45のC末端に向かって伸長する配列番号45の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸711であり、フラグメントは、配列番号46のN末端から始まり配列番号46のC末端に向かって伸長する配列番号46の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸726であり、フラグメントは、配列番号47のN末端から始まり配列番号47のC末端に向かって伸長する配列番号47の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含む。
軟骨サンプル及び滑液サンプルの両方に対して、COMP(配列番号1)中のネオエピトープの同定を以下で説明するようにして行った。また例えば血液、血清などの他のサンプル源でもよい。本実施形態の目的は疾患と非疾患とを区別することであるため、正常な軟骨代謝回転中に存在するネオエピトープを除外した。
この例では、3つの患者グループ及び1つの参照グループからの軟骨を研究した:
グループ1:関節リウマチ(RA)を有する患者であり、その関節軟骨組織は、関節置換(臀部及び膝)のための外科手術のときに入手し、以下このような患者をRA患者と呼ぶ。
切開、粉砕、及び抽出:
全体厚さがおよそ1×1cmの軟骨断片を各組織から解剖で取り出した。目で見て正常な関節軟骨サンプルを底から採取した。関節軟骨の同じ部分(負荷をかけた領域)をそれぞれの個体において解剖で取り出した。正常な対照については、以下の軟骨組織:関節軟骨(大腿骨骨頭(F)、上腕骨頭(H)、及び脛骨内側顆(knee medial tibial condyle)(K))、椎間板(線維輪(AF)及び髄核(NP))、及び最後に半月板(M)(36〜51歳)をそれぞれ5人の個体から抽出した。上記で説明した個体とは異なる個体(24〜36歳)から気管(T)及び肋骨(R)の軟骨サンプル(n=6)を得た。
典型的には、体積200μlの抽出物を2mlのチューブに移し、4mMのDTTで還元し(+56℃で30分振盪)、16mMのIAAでアルキル化した(暗所で室温で1時間)。抽出物をエタノール(9:1)により+4℃で一晩沈殿させ、その後、遠心分離(13200rpm、+4℃で30分)を行い、続いて−20℃で4時間エタノール洗浄を行うことにより、残留したGuHCl及び他の塩を除去した。サンプルをSpeedVacで乾燥させ、100μlの0.1Mの炭酸水素トリエチルアンモニウム(pH8.5)に懸濁し、その後、振盪機で、2μgのトリプシンゴールドにより+37℃で約16時間消化した。50μlのアリコートを乾燥させ、iTRAQでの標識付けに使用した。
強陽イオン交換(SCX)カラム(内径2.1mm×100mm、5μmのポリスルホエチルアスパルトアミド、孔サイズ300Å、ポリLC、Columbia、MD、USA)を使用したマイクロ−LCシステム(SMART、Pharmacia、Uppsala Sweden)で最初のイオン交換分離を行った。溶出は、99.5%の溶媒A(10mMのリン酸カリウム、20%のアセトニトリル、pH2.8)及び0.5%の溶媒B(1MのKCl、10mMのリン酸カリウム、20%のアセトニトリル、pH2.8)の均一濃度を用いて13分、続いて塩濃度を130mMに増加させる直線的な濃度勾配で60分で行われた。その後、濃度勾配を15分かけて385mMのKClまで高めて、最後に6分かけて1Mの塩まで高めた。300〜500μlの画分を、0.5mlのエッペンドルフチューブ(Safelock(商標)、Eppendorf AG、Hamburg、Germany)に集めた。
オフラインSCX分離からの画分を乾燥させ、60μlの0.2%のギ酸中に再溶解させ、そのうち10μlを精製し、厚さ4ディスク分の自社製逆相チップを使用して濃縮した(Rappsilberら、Anal.Chem.(2003)、75巻、663〜670頁)。0.1%のギ酸中の50%のアセトニトリル10μlを使用して保持されたペプチドをオートサンプラー用ガラスバイアル(Qsert、Waters、Milford、MA、USA)に溶出させた。SpeedVacを使用して有機溶媒を蒸発させ、ペプチドを10μlの0.2%ギ酸中に再溶解させ、その後、様々なLC−MSシステム上に注入した。サンプルをサンプルセットに混合する前に各サンプルの少量のアリコートをイオントラップLC−MSシステムに注入することによって標識付けの効率を試験した。
Q−tof MS(Q−TOFマイクロ、Waters)を、上記で説明したのと同じタイプのプレカラム及びWatersのSymmetry、C18、3.5μmの粒子、長さ150mm×内径75μmの分析カラムを備えたCapLC(Waters)に連結した。分析カラムをPicoTip(商標)ニードル(New Objective、Woburn、MA、USA)と組み合わせた。約250nl/分の流速、及び5%のB(イオントラップLC−MSの場合と同様の移動相)から51%のBの60分での直線的な濃度勾配、続いて95%のBでの6分の洗浄、及び12分の初期条件への再調節を使用して、オンラインの逆相分離を行った。画分間の交差汚染を最小化するために、以前と同様にしてブランクの試行を行った。それらが多価である場合と同等の長さの時間にわたり(MSMSの場合は2秒以内に)最も強いイオン4種を選択することによるデータ依存性取得を使用して、機器を操作した。
Protein Lynx2.1(Waters)及び較正物質として716.45Daにおけるエリスロマイシンのピークを使用したナノロックスプレーによる補正を使用して、マススペクトロメトリーの生データを加工した。加工済みファイルを、MASCOTを以下の検索パラメーター:iTRAQ(N−ターム)、iTRAQ(K)及び固定された修飾としてカルバミドメチル化(C)を使用して検索した。一方で、可変の修飾としてマンノシル化(W)、iTRAQ(Y)、脱アミド(N、Q)、酸化(M、P)を考慮した。他のMASCOT検索パラメーターは:モノアイソトピック質量、±0.2Daのペプチド質量許容差、±0.2DaのMSMSフラグメント質量許容差、2の最大切断ミス、対象となるイオンスコア>20であり、最高位のペプチドのみが一致し、分類学的にヒトであった。使用される酵素から予測される一方の末端にだけ部位を含有する半様式的な切断を、単離の前に起こる内因性の(生物学的な)切断を含有するペプチドを同定するための検索基準に適用した。
iTRAQ定量化パラメーターは、有意な閾値がp<0.05であり、重みつき比率、標準化なし、ペプチドの最小数1、最小の前駆体の電荷2、少なくとも0.05の相同性であり、各レポーターのソフトウェアの補正係数も包含した。
アフィニティーカラム:
親和性を強化するために、1mgのCOMP抗体P2D3又は0.75mgのCOMP抗体12a11をMiniLeak(KemEnTec、Denmark)のゲルアリコートに添加し、4℃で一晩インキュベートした。未結合抗体を0.15MのNaClで洗浄して落とした。未反応の部位をブロックするために、ゲルを0.2Mのエタノールアミンと共に室温で3時間インキュベートした。カップリング効率は、抗体P2D3の場合、39%(結合した抗体が390μgであることに対して)及び抗体12a11の場合、76%(結合した抗体が570μgであることに対して)と決定された。
RAと診断された患者(罹患期間9ヶ月)からの滑液(8ml)及びOAと診断された患者からの滑液(5ml)を5mMのNEM(N−エチルマレイミド(ethylmalemide))と共にインキュベートし、その後、1000g、室温で20分遠心分離した。急性外傷を有する患者からの滑液を、20mMのホスファート、150mMのNaCl、0.8%w/vのSDSで2倍の体積に希釈し、室温で2時間インキュベートした。1倍量の4%トリトン−X100のPBS溶液の添加により過量のSDSを中和し、室温で一晩インキュベートした。まず、非特異的な結合物質を除去するために、抗体を用いずにMiniLeakカラムにサンプルを通過させた。次いで未結合のサンプルをP2D3カラムに入れて、P2D3カラムからのフローを直接12a11カラムに入れた。両方のカラムを15mlのHBS(10mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4)で洗浄し、続いて2mlの高塩濃度緩衝液(10mMのHEPES、650mMのNaCl、pH7.4)で洗浄し、最後に5mlのHBSで洗浄した。溶出させるために、800μlの0.1Mシトラート(pH3)の画分をカラムに添加した。排水画分を200μlの1.5Mのトリス(pH8.8)で即座に中和した。
SDS−PAGEの前に、溶出したサンプルをエタノール(9:1)を用いて+4℃で一晩沈殿させ、その後、遠心分離(13200rpm、+4℃で30分)し、続いて−20℃で4時間エタノール洗浄を行った。沈殿したペレットを、還元剤を用いずにSDS−PAGEサンプル緩衝液(Laemmli、Nature(1970)、227巻、680〜685頁)に溶解させ、濃度勾配4〜16%のSDS−ポリアクリルアミドゲルで分離した。各バンドを3種の異なる酵素で消化できるように、各サンプルを3連で実験した。ブルーシルバー染色で一晩染色した後(Candianoら、Electrophoresis(2004)、25巻(9)、1327〜33頁)、対象のバンドを切り出し、10mMのDTT(Sigma)で56℃で30分還元し、50mMのヨードアセトアミド(Sigma)を用いて室温で30分アルキル化した。25mMのNH4HCO3中の20ng/μlのトリプシン(Promega)、25mMのNH4HCO3中の50ng/μlのキモトリプシン(Roche)、又は50mMのホスファート(pH8)中の40ng/μlのAsp−N(Roche)のいずれかを用いてバンドを37℃で一晩消化した。1%TFA、0.1%TFA中の50%アセトニトリルで2回、及び100%のアセトニトリルでペプチドを連続的に抽出した。乾燥後、抽出したペプチドを10μlの0.1%TFAに溶解させ、上記で説明したC18ステージチップで精製した。
精製したペプチドサンプルを10μlの0.2%のギ酸に溶解させ、サンプル(8μl)をEsquire HCTイオントラップ(Bruker Daltonik GmbH)に注入した。このイオントラップには、Pepmap(商標)ナノ−プレカラム(LC Packings、C18、内径300μm及び長さ5mm)及びAtlantis(商標)分析カラム(Waters、C18、3μmの粒子、内径150μm×長さ150mm)を有するアルティメットHPLCシステム(LC Packings)が備えられていた。分析カラムを、マイクロフローネブライザーを介してMS機器に組み合わせた。前の章で説明したようにしてオンラインの逆相分離を行った。データベース検索設定は、ITRAQ修飾以外はこれまでに述べた設定と同じであった。ペプチド及びフラグメントの質量許容差は±0.4Daに設定した。
以下の表2に、病的なCOMP代謝回転で同定された切断部位を示す同定されたネオエピトープを列挙する。表2において、太字で表示される切断部位の一部は、MSによって同定された配列に属し、(切断位置を示す)ネオエピトープの末端アミノ酸を包含する。
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸77であり、フラグメントは、配列番号18のC末端から始まり配列番号18のN末端に向かって伸長する配列番号18の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸88であり、フラグメントは、配列番号19のC末端から始まり配列番号19のN末端に向かって伸長する配列番号19の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸90であり、フラグメントは、配列番号20のC末端から始まり配列番号20のN末端に向かって伸長する配列番号20の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸104であり、フラグメントは、配列番号21のC末端から始まり配列番号21のN末端に向かって伸長する配列番号21の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸190であり、フラグメントは、配列番号22のC末端から始まり配列番号22のN末端に向かって伸長する配列番号22の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸194であり、フラグメントは、配列番号23のC末端から始まり配列番号23のN末端に向かって伸長する配列番号23の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸226であり、フラグメントは、配列番号24のC末端から始まり配列番号24のN末端に向かって伸長する配列番号24の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸531であり、フラグメントは、配列番号25のC末端から始まり配列番号25のN末端に向かって伸長する配列番号25の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸554であり、フラグメントは、配列番号26のC末端から始まり配列番号26のN末端に向かって伸長する配列番号26の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸574であり、フラグメントは、配列番号27のC末端から始まり配列番号27のN末端に向かって伸長する配列番号27の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸577であり、フラグメントは、配列番号28のC末端から始まり配列番号28のN末端に向かって伸長する配列番号28の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸657であり、フラグメントは、配列番号29のC末端から始まり配列番号29のN末端に向かって伸長する配列番号29の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸691であり、フラグメントは、配列番号30のC末端から始まり配列番号30のN末端に向かって伸長する配列番号30の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸710であり、フラグメントは、配列番号31のC末端から始まり配列番号31のN末端に向かって伸長する配列番号31の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのC末端は、配列番号1のアミノ酸725であり、フラグメントは、配列番号32のC末端から始まり配列番号32のN末端に向かって伸長する配列番号32の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含む。
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸78であり、フラグメントは、配列番号33のN末端から始まり配列番号33のC末端に向かって伸長する配列番号33の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸89であり、フラグメントは、配列番号34のN末端から始まり配列番号34のC末端に向かって伸長する配列番号34の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸91であり、フラグメントは、配列番号35のN末端から始まり配列番号35のC末端に向かって伸長する配列番号35の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸105であり、フラグメントは、配列番号36のN末端から始まり配列番号36のC末端に向かって伸長する配列番号36の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸191であり、フラグメントは、配列番号37のN末端から始まり配列番号37のC末端に向かって伸長する配列番号37の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸195であり、フラグメントは、配列番号38のN末端から始まり配列番号38のC末端に向かって伸長する配列番号38の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸227であり、フラグメントは、配列番号39のN末端から始まり配列番号39のC末端に向かって伸長する配列番号39の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸532であり、フラグメントは、配列番号40のN末端から始まり配列番号40のC末端に向かって伸長する配列番号40の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸555であり、フラグメントは、配列番号41のN末端から始まり配列番号41のC末端に向かって伸長する配列番号41の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸575であり、フラグメントは、配列番号42のN末端から始まり配列番号42のC末端に向かって伸長する配列番号42の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸578であり、フラグメントは、配列番号43のN末端から始まり配列番号43のC末端に向かって伸長する配列番号43の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸658であり、フラグメントは、配列番号44のN末端から始まり配列番号44のC末端に向かって伸長する配列番号44の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸692であり、フラグメントは、配列番号45のN末端から始まり配列番号45のC末端に向かって伸長する配列番号45の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸711であり、フラグメントは、配列番号46のN末端から始まり配列番号46のC末端に向かって伸長する配列番号46の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含み、又は
フラグメントのN末端は、配列番号1のアミノ酸726であり、フラグメントは、配列番号47のN末端から始まり配列番号47のC末端に向かって伸長する配列番号47の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含む。
表2に表示された、COMP(配列番号1)の病的な切断によって生成したネオエピトープを示すペプチドを合成し、標準的なプロトコールに従ってウサギを免疫化するのに使用する。配列中のその番号で表示される切断部位によって切り離された最も末端にある非置換アミノ酸と、3つのグリシン残基の配列と、続いて逆の末端にシステインとを含む、表2(第3列)に表示された5つの末端アミノ酸を含有するペプチドを合成した。これらのペプチドをそれらの末端のシステインを介してキーホールリンペットヘモシニアン(Key Limpet Hemocyanin)に連結し、標準的なプロトコールによってウサギを免疫化するのに使用する。ペプチド合成及び抗体産生は、Genscript Ltd(Hong Kong)によって提供される標準的な方法を使用する顧客サービスである。
関節の吸引により滑液を収集して、即座に遠心分離して細胞や任意の粒子を除去する。滑液を、血清サンプルのようなサンプル希釈剤で1:10に希釈する。
滑液サンプル(50μl)を、1倍量の100mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)、20mMのEDTA、及び1MのNaClで希釈した。希釈した滑液に、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)、10mMのEDTA、及び0.5MのNaCl中の50%(w/v)ポリエチレン−グリコール6000(Merck KGaA、Germany)35μlを添加した。この混合物を室温で60分インキュベートし、次いで12000g、4℃で15分遠心分離した。収集されたペレットを200μlの20mMのトリス、150mMのNaCl(pH7.4)に再懸濁し、75μlのプロテインAセファロースを含有するチューブに移した。この混合物を15分インキュベートし、チューブを300gで2分遠心分離した。上清を収集し、9倍量の95%エタノールで沈殿させた。沈殿したタンパク質を、還元のための10%の2−メルカプトエタノール含有又は非含有の電気泳動サンプル緩衝液(2%SDS、0.125Mのトリス−HCl(pH6.8)、0.002%ブロモフェノールブルー、及び20%グリセロール)に溶解させ、100℃で4分沸騰させ、4%スタッキングゲルを含む濃度勾配ポリアクリルアミド(4〜16%)スラブゲル上で分離した。分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレン(Millipore)に移した。免疫ブロッティング用に、メンブレンを、0.05%トゥイーン20含有トリス緩衝食塩水(pH7.2)中の3%ウシ血清アルブミン中で4℃で一晩ブロックし、次いでトリス緩衝食塩水(pH7.2)中3%のウシ血清アルブミンで1:2000に希釈した抗体と共に室温で1時間インキュベートした。0.05%トゥイーン20含有トリス緩衝食塩水(pH7.2)で3回洗浄した後、一次抗体として同じ溶液で1:25000に希釈した抗ウサギIgGホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体(Jackson Laboratories、USA)を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、ECLウェスタンブロッティング検出システム(Thermo Scientific)でシグナルを発生させ、Agfa Cronex5フィルムを使用して検出した。図3に、ネオエピトープ抗体のうち1種を用いたウェスタンブロットを示す。
プロテインAセファロースステップの後に12.5%のPEG6000を用いて2回目の沈殿ステップを行いサンプル体積を少なくしたことを除いては、例3で説明されているようにして滑液サンプルを調製した。ペレットをトリス緩衝液食塩水(pH7.2)に再懸濁して、滑液の元の体積にした。サンプルのアリコートを還元し(10mMのジチオスレイトール、DTT)、アルキル化し(50mMのヨードアセトアミド、IAA)、その後、トリプシン(Promega)を用いて37℃で一晩消化した。トリプシン処理したサンプルを、脱塩のために30kDaのスピンフィルター(Nanosep 30k、PALL life sciences)、続いてC18スピンフィルター(SS18V、Nest Group,Inc.、USA)に通過させてろ過した。1.25μlの滑液サンプルに相当する注入体積を、トリプル四重極型質量分析計(TSQ Vantage、Thermo Scientific、USA)に注入し、ネオエピトープペプチド(S195VCINTR)に関して多重反応モニタリング(MRM)実験を行った。ペプチド前駆体(425.22、2+)からフラグメントイオンy4、y5、及びy6が測定された。図4に示されたこれらのフラグメントのシグナル(転位)の合計によれば、二重の注入(a、b)は、それぞれ2つの急性外傷サンプル及び2つの関節リウマチサンプルに関してなされた。急性外傷サンプルは、RAサンプルよりも高いレベルのネオエピトープを含有していたが、それでもなお試験された全てのサンプルでネオエピトープが検出された。この例におけるサンプルは、ネオエピトープを発見するためのサンプルとは異なることに留意されたい。加えて、実際の切断部位の相補側は、初期OAの組織からの組織サンプル(上述したように、グループ3)で検出された。
Claims (7)
- 病的な軟骨代謝回転を決定するための方法であって、
サンプル中で、哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質COMPの少なくとも1種のネオエピトープの存在を検出するステップであって、該少なくとも1種のネオエピトープが該哺乳動物COMPを切断することによって形成され、該少なくとも1種のネオエピトープの存在を検出するステップが、
該サンプルと単離された抗体とを接触させるステップであって、該単離された抗体が哺乳動物COMPを切断することによって形成されるネオエピトープに特異的に結合する上記ステップと、
該単離された抗体に基づいて、該サンプル中で、該少なくとも1種のネオエピトープの存在を検出するステップと
を含み、
該単離された抗体が
からなる群から選択されるN-末端ネオエピトープに特異的に結合し、
又は
該単離された抗体が
からなる群から選択されるC-末端ネオエピトープに特異的に結合する、
上記方法。 - 前記少なくとも1種のネオエピトープの検出に基づいて、病的な軟骨代謝回転と良性の軟骨代謝回転とを区別するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記病的な軟骨代謝回転が、変形性関節症、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、若年性慢性関節炎、心臓血管疾患、腱の疾患、骨粗鬆症、骨軟化症、骨折修復、動脈硬化症、強皮症、線維症の皮膚、外傷、及び関節の外傷からなる群から選択される疾患によって引き起こされる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記サンプルが、軟骨サンプル、及び体液サンプルからなる群から選択される、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液サンプルが、滑液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、及び尿サンプルの少なくとも一つから選択される、請求項4に記載の方法。
- 哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質COMPを切断することにより形成された少なくとも1種のネオエピトープに特異的に結合する抗体の産生方法であって、
該哺乳動物COMPを切断することによって形成されるN−末端ネオエピトープに対応するN−末端アミノ酸配列を有するペプチド又は該哺乳動物COMPを切断することによって形成されるC−末端ネオエピトープに対応するC−末端アミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体を発生させるステップと、
N-末端ネオエピトープ又はC-末端ネオエピトープに特異的に結合する該抗体を単離するステップとを含み、
ここで該N-末端ネオエピトープが
からなる群から選択され、
及び該C-末端ネオエピトープが
からなる群から選択される、
上記方法。 - 単離された抗体が、哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質COMPを切断することによって形成されるN−末端ネオエピトープに対応するN−末端アミノ酸を有するペプチドに特異的に結合し、該N-末端ネオエピトープが、
からなる群から選択され、
又は
単離された抗体が、哺乳動物軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質COMPを切断することによって形成されるC−末端ネオエピトープに対応するC−末端アミノ酸を有するペプチドに特異的に結合し、該C-末端ネオエピトープが、
からなる群から選択される、
上記単離された抗体。
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