ES2683076T3 - Determinación de recambio de cartílago patológico - Google Patents
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Abstract
Un método de inmunoensayo para distinguir entre recambio de cartílago patológico y recambio de cartílago benigno o normal, comprendiendo el método: a) detectar, en una muestra, la presencia de, al menos, un neoepítopo N- o C-terminal de proteína oligomérica de matriz de cartílago, COMP, de mamífero, en la que dicho, al menos, un neoepítopo N- o C-terminal se forma por corte de dicha COMP de mamífero en el recambio de cartílago patológico, en la que dicho, al menos, un neoepítopo N- o C-terminal no se forma en el recambio de cartílago benigno o normal, y en la que la detección de dicho, al menos, un neoepítopo N o C-terminal comprende: poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo aislado, en la que dicho anticuerpo aislado se une específicamente a un neoepítopo N- o C- terminal que se forma por corte de COMP de mamífero en el recambio de cartílago patológico; y detectar la presencia de dicho, al menos, un neoepítopo N- o C- terminal en dicha muestra que se basa en dicho anticuerpo aislado; y b) determinar la presencia de recambio de cartílago patológico que se basa en dicha presencia detectada de dicho, al menos, un neoepítopo N- o C-terminal en dicha muestra; en la que dicho anticuerpo aislado se une específicamente a una secuencia de aminoácidos de neoepítopo N-terminal que se selecciona a partir de un grupo que consiste de: **(Ver tabla**) o en la que dicho anticuerpo aislado se une específicamente a una secuencia de aminoácidos de neoepítopo Cterminal que se selecciona a partir del grupo que consiste de: **(Ver tabla**)
Description
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DESCRIPCION
Determinacion de recambio de cartftago patologico Campo tecnico
Las presentes realizaciones se refieren, de manera general, a la determinacion, deteccion o monitoreo del recambio de cartftago patologico y, en especial, al uso de neoepftopos seleccionados de fragmentacion de protema oligomerica de matriz de cartftago (COMP), capaces de diferenciar entre el recambio de cartftago patologico y el recambio de cartftago normal o benigno.
Antecedentes
Las afecciones patologicas que producen degradacion de tejido tal como la degradacion de cartftago constituyen un problema medico, social y economico principal. De las personas mayores de 65 anos de edad, aproximadamente el 50 % de la poblacion en el mundo occidental sufre de artritis. Los procesos de degradacion de tejido se caracterizan por la destruccion de tejidos mediante la ruptura de sus componentes. Los componentes del tejido pueden degradarse debido a la accion de enzimas, frecuentemente proteasas, o por compuestos toxicos. Por esta razon, la determinacion de los procesos de degradacion de tejido con el fin de diagnostico, monitoreo de enfermedad, tratamiento, etc., puede realizarse por numerosos metodos. Una manera de determinar procesos de degradacion en enfermedades de tejido conectivo, tales como afecciones artnticas, arteriosclerosis, afecciones degenerativas de las articulaciones, etc., consiste en detectar la formacion y la presencia de productos de degradacion de los componentes del tejido conectivo. Esto permite la deteccion directa del proceso de degradacion, en comparacion con metodos indirectos como, por ejemplo, perdida de tejido, inflamacion, hinchazon y presencia de autoanticuerpos autoreactivos, que se han utilizado ampliamente en el diagnostico de enfermedad de las articulaciones, tales como afecciones artnticas.
De manera tradicional, el diagnostico clmico de la artritis se basa en los antecedentes del paciente, exploracion ffsico, radiogrartas y mediciones de los autoanticuerpos inductores de inflamacion. El pronostico, tratamiento y resultado clmico de pacientes con artritis se evaluan por determinaciones en serie. Sin embargo, con el fin de minimizar el dano tisular permanente que se origina por afecciones patologicas que incluyen degeneracion de cartftago, resulta importante tener la capacidad de diagnosticar tales afecciones en una fase temprana. De acuerdo con esto, durante la ultima decada, se han realizado esfuerzos para encontrar marcadores biologicos adecuados que permiten una deteccion temprana de degeneracion de cartftago patologica.
Niveles elevados en suero de COMP se han asociado anteriormente con destruccion de articulaciones continua en artritis reumatoide (Mansson et al, J. Clin. Invest (1995), vol. 95, pp 1077-1077; Wollheim et al., British Journal of Rheumatology (1997), vol. 36, pp 847-849; Petersson et al., British Journal of Rheumatology (1998), vol. 37, pp 4650). Tambien se han encontrado cantidades significativas de fragmentos de COMP en fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y otras formas de artritis inflamatoria (Neidhardt et al., British Journal of Rheumatology (1997), vol. 36, pp 1151-1160).
Se ha sugerido, ademas, el uso de COMP o secuencias de acido nucleico que codifican COMP para preparar una composicion farmaceutica con el fin de impedir y/o tratar afecciones artnticas en un mairftfero (Wo 98/46253). De acuerdo con esto, se puede considerar que COMP es un compuesto esencial con respecto al diagnostico y/o tratamiento de diferentes formas de artritis.
COMP se ha usado anteriormente como un marcador de recambio de cartftago (Saxne et al., British Journal of Rheumatology (1992), vol. 31, pp. 583-591). Lai et al., (Osteoarthritis Cartilage (2012), vol. 20, pp 854-862) desarrollo un ensayo ELISA sandwich donde los fragmentos de COMP en suero se usaron para monitorear la progresion de la artritis. Estos mostraron diferencia en los niveles de COMP en suero entre pacientes con artritis y sujetos sin artritis para control.
Un metodo para determinar un proceso de degradacion de tejido mediante la deteccion de neoepftopos se divulga en WO 2005/116658, donde se usan neoepftopos que aparecen luego del corte de COMP entre la secuencia de aminoacidos 625 y 626 de COMP.
En Soderlin M. (2003), un estudio basado en la poblacion sobre la artritis temprana en el sur de Suecia. Incidencia, infecciones anteriores, marcadores de diagnostico y carga economica. Tesis doctoral, Universidad de Linkoping, Departamento de Medicina Clrnica y Molecula, COMP se usa como un marcador, pero no se pudo mostrar ninguna diferencia estadfstica entre diferentes grupos de diagnostico e, incluso en el grupo de control, el 18 % de los pacientes mostraron niveles de COMP elevados.
Los resultados de los metodos que se usan en la actualidad, para diagnostico y monitoreo de enfermedades tales como, por ejemplo, artritis, muestran un gran solapamiento entre pacientes enfermos y aquellos sanos como resultado del alto fondo del recambio de tejido normal.
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Una limitacion principal en lo que se refiere a los metodos y tecnicas anteriores se refiere a que estos no permiten distinguir entre el recambio de cartftago patologico a partir del recambio normal, debido a niveles de alto fondo del recambio de cartftago normal. Por lo tanto, todavfa existe margen para mejoras con respecto al campo tecnico.
Resumen
Un objetivo general consiste en determinar el recambio de cartftago patologico en una muestra.
Un objeto especial consiste en proporcionar metodos y herramientas que permiten distinguir entre el recambio de cartftago patologico y el recambio de cartftago benigno o normal.
De acuerdo con esto, la presente invencion se refiere a un metodo de inmunoensayo para distinguir entre el recambio de cartftago patologico y el recambio de cartftago benigno o normal, comprendiendo el metodo:
a) detectar, en una muestra, la presencia de, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal de protema oligomerica de matriz de cartftago, COMP, de mamfero, en la que dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal se forma por corte de dicha COMP de mamfero en el recambio de cartftago patologico, en la que dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal no se forma en el recambio de cartftago benigno o normal, y en la que la deteccion de dicho, al menos, un neoepftopo N o C-terminal comprende:
poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo aislado, en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a un neoepftopo N- o C-terminal que se forma por corte de COMP de mamfero en el recambio de cartftago patologico; y
detectar la presencia de dicho, al menos, un neoepftopo N- o C- terminal en dicha muestra que se basa en dicho anticuerpo aislado; y
b) determinar la presencia de recambio de cartftago patologico que se basa en dicha presencia detectada de dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal en dicha muestra;
en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a una secuencia de aminoacidos de neoepftopo N-terminal que se selecciona a partir de un grupo que consiste de:
- VRTGL (SEQ ID NO 33)
- LHCAP (SEQ ID NO 34) CAPGF (SEQ ID NO 35)
- TESGA (SEQ ID NO 36)
- CVPNS (SEQ ID NO 37) SVC IN (SEQ ID NO 38)
- RFCPD (SEQ ID NO 39)
- RAFQT (SEQ ID NO 40) NQGRE (SEQ ID NO 41)
- TAFNG (SEQ ID NO 42)
- NGVDF (SEQ ID NO 43) GDTES (SEQ ID NO 44)
- VGYIR (SEQ ID NO 45)
- WLDT (SEQ ID NO 46) CFSQE (SEQ ID NO 47)
o en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a una secuencia de aminoacido de neoepftopo C-terminal que se selecciona a partir de un grupo que consiste de:
- GMQQS (SEQ ID NO 18)
- SVRPL (SEQ ID NO 19) RPLLH (SEQ ID NO 20)
- VACIQ (SEQ ID NO 21)
- TGQHN (SEQ ID NO 22) NCVPN (SEQ ID NO 23)
- QRRAQ (SEQ ID NO 24)
- TLTDF (SEQ ID NO 25) NWWL (SEQ ID NO 26)
- LAVGY (SEQ ID NO 27)
- GYTAF (SEQ ID NO 28) ALWHT (SEQ ID NO 29)
- QHRPQ (SEQ ID NO 30)
- VADSN (SEQ ID NO 31) RLGVF (SEQ ID NO 32)
Dicho recambio de cartftago patologico puede originarse debido a una enfermedad que se selecciona a partir de un grupo que consiste de osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reactiva, artritis psoriasica, artritis cronica juvenil, una enfermedad cardiovascular, enfermedad de los tendones, osteoporosis, osteomalacia, reparacion de fracturas, arteriosclerosis, esclerodermia, fibrosis de piel y traumatismo, tales como traumatismo articular.
La muestra puede seleccionarse a partir de un grupo que consiste de una muestra de cartftago y una muestra de fluido corporal. La muestra de fluido corporal puede seleccionarse a partir de, al menos, una de una muestra de fluido sinovial, una muestra de suero, una muestra de plasma y una muestra de orina. Las presentes realizaciones permiten
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determinar o detectar la presencia de recambio de cartftago patologico en una muestra de un mamfero, preferiblemente, de un mamftero humano. Con mayor detalle, las realizaciones distinguen las personas sanas, normales, con recambio de cartftago normal con respecto a las personas con un recambio de COMP y cartftago patologico que se origina a partir de una enfermedad.
Breve descripcion de los dibujos
Las realizaciones, en conjunto con objetos adicionales y ventajas de estos, pueden entenderse mejor al hacer referencia a la siguiente descripcion que se toma en conjunto con los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 muestra las titulaciones de los anticuerpos de corte de COMP;
La Fig. 2 muestra los resultados de un ensayo para fragmentos de COMP que se liberaron en fluido sinovial que contiene un neoepftopo de corte;
La Fig. 3 muestra un analisis mediante inmunotransferencia de muestras de fluido sinovial que se precipitan con PEG 6000 usando un anticuerpo de neoepftopo para deteccion; y
La Fig. 4 muestra la deteccion de un neoepftopo usando analisis MRM de fluido sinovial que se precipita con PEG 6000.
Descripcion detallada
Las presentes realizaciones se refieren, de manera general, a la determinacion, deteccion o monitoreo del recambio de cartftago patologico. Las presentes realizaciones se refieren, en especial, al uso de neoepftopos especiales de protema oligomerica de matriz de cartftago (COMP) de mamferos, que resultan espedficos para recambio de cartftago patogenico o patologico.
Por lo tanto, los neoepftopos de las presentes realizaciones permiten distinguir entre un sujeto, preferiblemente, un mamftero y, mas preferiblemente, un humano, que sufre de una enfermedad que origina recambio de cartftago patologico y un sujeto que tiene recambio de cartftago normal.
El recambio de cartftago normal se refiere, ademas, en la presente como un recambio de cartftago de fondo o benigno. Un recambio de cartftago benigno como tal ocurre, de manera general, en todo el tejido cartilaginoso y forma parte de la adaptacion normal de estos tejidos a la carga y el medio ambiente. Por lo tanto, este recambio de tejido cartilaginoso benigno no se debe a una ruptura de tejido perjudicial o a una enfermedad sino que mas bien se trata de un proceso natural que tiene lugar en el sujeto.
Las tecnicas del estado de la tecnica anterior con respecto al uso de COMP y neoepftopos de COMP que se analizan en la seccion de antecedentes presentan limitaciones en cuanto a que no permiten distinguir entre el recambio de cartftago benigno, normal y el recambio de cartftago patologico. Por ejemplo, Saxne et al., British Journal of Rheumatology (1992), vol. 3l, pp 583-591 y Lai et al., Osteoarthritis Cartilage (2012), vol. 20, pp 854-862 detectan senales de fondo incluso en sujetos de control. En clara contraposicion con respecto a estas tecnicas del estado de la tecnica anterior, las presentes realizaciones hacen uso de ciertos neoepftopos que no se presentan en la ruptura de cartftago normal. De acuerdo con esto, estos neoepftopos unicos proporcionan una muy buena herramienta para detectar y monitorear ruptura o recambio de cartftago patologico. Ademas, en el documento WO 2005/116658 se usaron neoepftopos que aparecen luego del corte de COMP entre 625 y 626 de la secuencia de aminoacidos de COMP para determinar un proceso de degradacion de tejido. Sin embargo, los neoepftopos en el documento WO 2005/116658 no pueden usarse para distinguir entre COMP o recambio de cartftago normal y COMP o recambio de cartftago patologico. Por lo tanto, los neoepftopos en el documento WO 2005/116658 se usan para determinar degradacion de tejido de manera general, y no pueden usarse para monitoreo espedfico del recambio de cartftago patologico.
Un problema que presentan los ensayos de COMP actuales en fluidos corporales que apuntan a epftopos generales para diagnostico y monitoreo de enfermedad de las articulaciones y ruptura de tejido se refiere a que existe un recambio de fondo en especialmente todos los tejidos cartilaginosos que forma parte de la adaptacion normal de estos tejidos a la carga y medio ambiente. Como resultado, la ruptura aumentada que se produce en un cartftago de articulacion especial en enfermedad solo se puede ver contra un fondo de recambio normal. De este modo, el aumento ocurre solo por encima de un nivel existente. Resulta conveniente, sin embargo, identificar hechos sobre los fragmentos que distinguen los patologicos de aquellos que se presentan normalmente. Las realizaciones en la presente resuelven este problema al hacer foco en los neoepftopos que no se presentan en el recambio de cartftago normal.
De este modo, los inventores han demostrado sorpresivamente que existen sitios de corte espedficos en el recambio de cartftago patologico que no se presentan en el recambio de cartftago normal. Esto significa que nuevos epftopos que no se exponen normalmente en COMP aparecen luego del corte de la protema en sujetos que sufren de una
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enfermedad que origina recambio de cartftago patologico. Estos nuevos epftopos o neoepftopos no se forman, sin embargo, en sujetos sanos con solamente recambio de cartftago benigno. Estos nuevos neoepftopos de las realizaciones pueden usarse, por lo tanto, en metodos y tecnicas mejoradas para determinar, detectar y monitorear recambio de cartftago patologico en enfermedad.
En la presente, el recambio de cartftago benigno/patologico y COMP benigna/patologica se usan indistintamente y ambos involucran un proceso normal/patologico en el que el cartftago se rompe originando mayores niveles en suero de COMP.
Las presentes realizaciones divulgan un metodo para determinar, medir o monitorear recambio de COMP o de cartftago patologico. Los neoepftopos de fragmentaciones espedficas que se detectan, miden o monitorean no se presentan como resultado del recambio normal, lo que hace que las realizaciones sean unicas y resulta posible, por lo tanto, distinguir recambio normal de recambio en enfermedad. Esto constituye una herramienta valiosa para diagnosticar enfermedades, entre las que se incluyen, pero sin limitacion, osteoartritis (OA), artritis reumatoide (RA), artritis reactiva (ReA), artritis psoriasica, artritis cronica juvenil, enfermedad cardiovascular, enfermedad de los tendones, osteoporosis, osteomalacia, reparacion de fracturas, arteriosclerosis, esclerodermia, fibrosis de piel o traumatismo, tal como traumatismo articular.
Debido a que los neoepftopos de las realizaciones no se presentan practicamente en personas sanas, normales, esto proporcionara diagnosticos tempranos y novedosos de procesos de enfermedad. Las presentes realizaciones se refieren, por lo tanto, a metodos para detectar o monitorear recambio de cartftago patologico y al uso de este metodo para distinguir un paciente con recambio patologico con respecto a personas sanas con recambio de cartftago normal. El metodo comprende la deteccion o monitoreo de la presencia de neoepftopos espedficos de fragmentacion de COMP en una muestra. Esto posibilitara obtener diagnosticos tempranos y novedosos de procesos de enfermedad que podnan usarse para seguimiento de la progresion de enfermedad de manera longitudinal en un paciente. Las realizaciones podnan usarse, ademas, para seguimiento de la eficacia luego de diversos tratamientos potenciales.
Los neoepftopos de las presentes realizaciones se forman asf por cortePARR26 de la secuencia de aminoacidos de COMP (SEQ ID NO: 1) en posiciones espedficas en sujetos que sufren de una enfermedad que origina recambio de cartftago patologico. El neoepftopo se usa en la presente como un epftopo que no se expone normalmente en COMP pero que aparece luego de cambios de la protema, debido a un corte de la protema. El neoepftopo puede, por ejemplo, formarse a partir de una estructura primaria, secundaria y/o terciaria de un fragmento de COMp que aparece luego del corte.
Las secuencias que se presentan a continuacion corresponden a COMP humana, pero las realizaciones incluyen ademas, mairftferos no humanos, tales como, caballo, perro, raton, rata, cobayo y primates. Las secuencias de COMP de estos mairftferos no humanos son tan similares con respecto a COMP humana que los anticuerpos que se dirigen hacia neoepftopos en COMP humana pueden tener una reactividad cruzada con neoepftopos correspondientes en la COMP de marnfferos no humanos y viceversa.
La secuencia de COMP humana se presenta a continuacion y puede encontrarse en la SEQ ID NO: 1.
MVPDTACVLL
LLRQQVREIT
ACIQTESGAR
CEACPPGYSG
RGSFQCGPCQ
RSCVCAVGWA
EDVDRDGIGD
CRSQKNDDQK
DGIGDACDNC
VPNSAQEDSD
LTLAALGASG
FLKNTVMECD
CGPCPAGFTG
PTHQGVGLAF
PGFVGDQASG
GNGILCGRDT
ACDPDADGDG
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EGPELVADSN VVLDTTMRGG RLGVFCFSQE NIIWANLRYR CNDTIPEDYE
THQLRQA
Las presentes realizaciones divulgan un metodo para distinguir recambio patologico de recambio de cartftago normal, comprendiendo la deteccion y monitoreo en una muestra de la presencia de los neoepftopos espedficos de fragmentacion de COMP que se presentan en la presente. Para detectar o monitorear estos neoepftopos, se puede usar cualquier metodo posible, entre los que se incluyen, pero sin limitacion, Monitoreo de Reaccion Multiple (MRM), ELISA o cualquier otra inmunoensayo adecuado segun se conoce en el estado de la tecnica.
Las realizaciones divulgan, ademas, los neoepftopos espedficos que se crean a partir de cortes y anticuerpos contra estos nuevos neoepftopos.
Los inventores divulgan nuevos sitios de corte de COMP (SEQ ID NO: 1) donde los neoepftopos no se presentan o detectan, de manera sorprendente, a niveles significativamente bajos en ruptura de cartftago normal. Esto proporciona una herramienta unica para distinguir realmente una enfermedad con respecto a una no enfermedad.
Los neopftopos de corte espedficos de COMP que se presentan en el recambio de cartftago patologico pero que no se presentan en el recambio de cartftago normal se forman por corte de COMP en, al menos, un sitio de corte que se selecciona a partir de un grupo que consiste de entre la posicion 77 (S77) y 78 (V78); 88 (L88) y 89 (L89); 90 (H90) y 91 (C91); 104 (Q104) y 105 (T105); 190 (N190) y 191 (C191); 194 (N194) y 195 (S195); 226 (Q226) y 227 (R227); 531 (F531) y 532 (R532); 554 (L554) y 555 (N555); 574 (Y574) y 575 (T575); 577 (F577) y 578 (N578); 657 (T657) y 658 (G658); 691 (Q691) y 692 (V692); 710 (N710) y 711 (V711) y 725 (F725) y 726 (C726).
De acuerdo con esto, la invencion se refiere a un metodo de inmunoensayo para distinguir entre recambio de cartftago patologico y recambio de cartftago benigno o normal, comprendiendo el metodo:
a) detectar, en una muestra, la presencia de, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal de protema oligomerica de matriz de cartftago, COMP, de mamfero, en la que dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal se forma por corte de dicha COMP de mairftfero en el recambio de cartftago patologico, en la que dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal no se forma en el recambio de cartftago benigno o normal, y en la que la detectar la presencia de dicho, al menos, un neoepftopo N o C-terminal comprende:
poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo aislado, en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a un neoepftopo N- o C-terminal que se forma por corte de COMP de mamfero en el recambio de cartftago patologico; y
detectar la presencia de dicho, al menos, un neoepftopo N- o C- terminal en dicha muestra que se basa en dicho anticuerpo aislado; y
b) determinar la presencia de recambio de cartftago patologico que se basa en dicha presencia detectada de dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal en dicha muestra;
en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a una secuencia de aminoacidos de neoepftopo N-terminal que se selecciona a partir de un grupo que consiste de:
- VRTGL (SEQ ID NO 33)
- LHCAP (SEQ ID NO 34) CAPGF (SEQ ID NO 35)
- TESGA (SEQ ID NO 36)
- CVPNS (SEQ ID NO 37) SVC IN (SEQ ID NO 38)
- RFCPD (SEQ ID NO 39)
- RAFQT (SEQ ID NO 40) NQGRE (SEQ ID NO 41)
- TAFNG (SEQ ID NO 42)
- NGVDF (SEQ ID NO 43) GDTES (SEQ ID NO 44)
- VGYIR (SEQ ID NO 45)
- WLDT (SEQ ID NO 46) CFSQE (SEQ ID NO 47)
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o en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a una secuencia de aminoacido de neoepftopo C- terminal que se selecciona a partir de un grupo que consiste de:
- GMQQS (SEQ ID NO 18)
- SVRPL (SEQ ID NO 19) RPLLH (SEQ ID NO 20)
- VACIQ (SEQ ID NO 21)
- TGQHN (SEQ ID NO 22) NCVPN (SEQ ID NO 23)
- QRRAQ (SEQ ID NO 24)
- TLTDF (SEQ ID NO 25) NWWL (SEQ ID NO 26)
- LAVGY (SEQ ID NO 27)
- GYTAF (SEQ ID NO 28) ALWHT (SEQ ID NO 29)
- QHRPQ (SEQ ID NO 30)
- VADSN (SEQ ID NO 31) RLGVF (SEQ ID NO 32)
Por lo tanto, la presencia de, al menos, un neoepftopo que se forma por corte de COMP en sitios de corte espedficos segun se define anteriormente es un indicador de recambio de COMP y cartftago patologico en la muestra.
El metodo que se describe anteriormente detecta recambio de cartftago patologico en un mairnfero, preferiblemente un humano.
En una realizacion, la etapa de deteccion se lleva a cabo mediante un inmunoensayo. Este inmunoensayo es preferiblemente monitoreo de reaccion multiple (MRM) y/o ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA).
El metodo comprende la posibilidad de distinguir entre recambio de cartftago patologico y recambio de cartftago benigno basado en, al menos, un neoepftopo segun se detecta en la muestra. Por lo tanto, si el, al menos, un neoepftopo se detecta en la muestra o se detecta en una cantidad o concentracion que excede un valor umbral, cualquier recambio de cartftago se determina entonces como debido a recambio de cartftago patologico. En consecuencia, si no se detecta ningun neoepftopo de las realizaciones en la muestra o se detecta en una cantidad o concentracion significativamente baja, a saber, por debajo del valor umbral, cualquier recambio de cartftago se determina entonces como debido a recambio de cartftago benigno.
Por lo tanto, la posibilidad de distinguir entre recambio de cartftago patologico y recambio de cartftago benigno comprende, en una realizacion, la accion de determinar la presencia de recambio de cartftago patologico si la cantidad del, al menos, un neoepftopo que se detecta en la muestra excede un valor umbral. En consecuencia, la presencia de recambio de cartftago benigno se determina si la cantidad del, al menos, un neoepftopo no excede el valor umbral o si no se detecta ningun neoepftopo como tal en la muestra.
El valor umbral que se usa en la realizacion especial de acuerdo con lo anterior puede determinarse mediante la medicion de la cantidad del, al menos, un neoepftopo en un grupo de pacientes que se diagnostican con una enfermedad que origina recambio de cartftago patologico y, de manera opcional, mediante la medicion, ademas, de la cantidad del, al menos, un neoepftopo en un grupo de control con sujetos sanos.
En una realizacion, el recambio de cartftago patologico se origina mediante una enfermedad que se selecciona de un grupo que consiste de osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reactiva, artritis psoriasica, artritis cronica juvenil, una enfermedad cardiovascular, enfermedad de los tendones, osteoporosis, osteomalacia, reparacion de fracturas, arteriosclerosis, esclerodermia, fibrosis de piel o traumatismo, tal como traumatismo articular.
La muestra que se usa en el metodo se selecciona preferiblemente a partir de un grupo que consiste de una muestra de cartftago y una muestra de fluido corporal, tal como una muestra de fluido sinovial, una muestra de suero, una muestra de plasma y una muestra de orina.
La deteccion de la presencia del, al menos, un neoepftopo comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se describe en la presente. La presencia del, al menos, un neoepftopo se detecta en la muestra que se basa en el anticuerpo. La determinacion de la presencia de recambio de cartftago patologico comprende determinar la presencia de recambio de cartftago patologico que se basa en la presencia detectada del, al menos, un neoepftopo en la muestra.
La presencia de cualquier neoepftopo de la invencion puede determinarse de acuerdo con diversas tecnicas que se conocen en el estado de la tecnica para detectar fragmentos de protemas. Tales tecnicas preferidas pero sin limitacion incluyen la deteccion del, al menos, un neoepftopo en la muestra mediante monitoreo de reaccion multiple (MRM) o ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) usando un anticuerpo que se une espedficamente a un neoepftopo de acuerdo con la invencion.
A continuacion, sigue aqrn un analisis de la identificacion de neoepftopos en COMP de acuerdo con la invencion. Identificacion de neoepftopos en COMP
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La identificacion de neoepftopos en COMP (SEQ ID NO: 1) se ha realizado tanto en muestras de cartftago como en muestras de fluido sinovial como se describe a continuacion. Tambien son posibles otras fuentes de muestras, tales como sangre, suero, etc. Dado que el objetivo de las realizaciones es distinguir la enfermedad de la no enfermedad, se han omitido los neoepftopos que estan presentes en el recambio normal del cartftago.
Muestras de cartftago
En este ejemplo, se ha estudiado el cartftago de tres grupos de pacientes y un grupo se referencia:
Grupo 1: Pacientes con artritis reumatoide (RA) donde el tejido de cartftago articular se obtuvo al momento de la cirugfa para reemplazo de articulaciones (cadera y rodilla), en adelante denominados los pacientes RA.
Grupo 2: Pacientes con osteoartritis (OA), donde el cartftago se obtuvo al momento de la cirugfa para reemplazo de articulaciones (OA en fase tardfa), principalmente, cartftago de cadera, en adelante denominados, pacientes OA.
Grupo 3: Pacientes cftnicamente sanos con respecto a las articulaciones, pero que como resultado de cancer en la parte proximal de la pierna han tenido que someterse a amputacion por encima de la rodilla. La rodilla no resulta afectada por el tumor. Algunos pacientes dentro del rango de edad de entre 55-75 anos tienen un cartftago articular de rodillo normal mediante investigacion macroscopica (algunas veces se verifica mediante microscopfa). Algunas personas dentro del mismo rango de edad tienen areas unicas con fibrilacion. En estudios anteriores del cartftago de estas articulaciones, se ha demostrado que existen cambios muy evidentes en la smtesis de matriz proteica y la composicion general en este cartftago y que estos cambios son del mismo caracter con respecto a aquellos que caracterizan la fase tardfa de OA con amplia destruccion de tejido y que estos representan, por lo tanto, fases tempranas del proceso. Se han usado ahora muestras a partir de sitios en ese cartftago para identificar cambios moleculares haciendo foco en la degradacion de moleculas de matriz extracelular.
Grupo de referencia: El cartftago normal que se obtiene a partir de casos de medicina forense donde las personas han fallecido por otras causas distintas con respecto a la mala salud. Los cartftagos normales fueron de rodilla-tibia, cadera- femur, hombro-humero, menisco, anillo fibroso, nucleo pulposo (edad dentro del rango de 36-51 anos) asf como tambien de traquea y costilla (edad de 24-36 anos), muy por debajo de la edad donde OA resulta comun. La informacion proporciona, por lo tanto, informacion sobre fragmentos que se forman mediante el proceso de recambio de tejido normal y que se retienen en el tejido.
Algunas fragmentaciones, por ejemplo, de agrecano y la primera etapa de ruptura de colageno I y II son las mismas en cuanto a patologfa y recambio normal, pero se pueden esperar diferentes niveles. En este ejemplo, los inventores han comparado tejido patologico y normal, permitiendo deducir que cortes unicos se obtienen como resultado del proceso patologico.
En la busqueda de los datos se hizo foco sobre los peptidos que muestran secuencias de aminoacidos presentes en COMP, y que tienen un corte normal para tripsina en cualquiera de los extremos, mientras que el otro extremo muestra un corte anormal que se logra por una proteinasa activa en el tejido antes de la extraccion y que refleja el proceso destructivo continuo. El sitio que no representa un corte tnptico se denomina como el neoepftopo.
Estos neoepftopos que se encuentran tambien en los cartftagos normales no se tuvieron en cuenta para analisis adicionales debido a que debenan representar recambio de cartftago normal.
Preparacion de muestra de cartftago
Diseccion, pulverizacion y extraccion:
Aproximadamente, piezas de cartftago de 1 x 1 cm de espesor total se diseccionaron a partir de cada tejido. Las muestras macroscopicas de cartftago articular normal fueron tomadas a profundidad total. La misma ubicacion (area cargada) del cartftago articular se disecciono por cada persona. Para controles normales, se extrajeron los siguientes tejidos de cartftago de cada una de cinco personas: cartftago articular (cabeza (F) femoral, cabeza (H) de humero, y condilo (K) de tibia media de rodilla), disco intervertebral (anillo (AF) fibroso y nucleo (NP) pulposo) y finalmente, menisco (M) (36-51 anos). Las muestras (n=6) de cartftago de traquea (T) y costilla (R) se obtuvieron de diferentes personas (24-36 anos) con respecto a aquellas que se describen anteriormente.
Las muestras de cartftago articular de cadera de osteoartritis avanzada se obtuvieron en cirugfa de reemplazo de articulaciones y, del mismo modo, las muestras de artritis reumatoide. Estas muestras sumaron aproximadamente 37 mg.
Las muestras de cartftago congelado, totalmente diseccionadas, se pulverizaron en nitrogeno ftquido en un tubo de metal refrigerado con un molino mezclador tipo 301 (Retsch, Haan, Alemania). Se realizaron inspecciones visuales de partfculas que se formaron en un microscopio liviano para optimizar las configuraciones (3 X 60 s a 25 Hz) con 30 min
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de refrigeracion entre etapas, lo que dio como resultado alrededor de 100 mg de un polvo homogeneo por tejido. Las muestras congeladas se pesaron y se extrajeron usando 15 volumenes (v/p) de regulador de extraccion caotropico (GuHCl 4M, NaAc 50 mM, acido 6-aminocaproico 100 mM, benzamidina 5 mM, N-etilmaleimida 5 mM, pH 5,8) durante 24 h en un agitador orbital a +4 °C. Los extractos se recolectaron luego de centrifugacion a 13200 rpm y +4 °C durante 30 min.
Las muestras de cartflago, definidas por el area de lesion limitada, del condilo femoral de personas con osteoartritis temprana fueron aquellas que mostraron una unica area fibrilada en amputacion quirurgica debido a un osteosarcoma en la parte superior de la extremidad inferior. Para la extraccion, el tejido se secciono en un criostato a -20 °C en secciones de 20 pm que se recolectaron en tubos Sterilin de 5 ml (Bibby Sterilin Ltd, Stone, Staffs, UK) y se extrajeron durante 24 h a 4 °C con 5 ml de guanidina-HCl 4M, acetato de sodio 0,05 M, pH 5,8, que ademas contema EDTA 10 mM, hidrocloruro de benzamidina 5 mM, acido 6-aminohexanoico 0,1 M, y N-etilmaleimida 5 mM. Los extractos se separaron a partir de residuos mediante filtracion en un filtro de fibra de vidrio.
Preparacion de muestra cuantitativa:
Normalmente, un volumen de extracto de 200 pl se transfiere en un tubo de 2 ml que se reduce por DTT 4 mM (a +56 °C durante 30 min de agitacion) y se alquila por IAA 16 mM (a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad). Los extractos se precipitaron con etanol (9:1) durante la noche a +4 °C antes de centrifugacion (13200 rpm a +4°C durante 30 min), a continuacion, se lavaron con etanol durante 4 h a -20 °C para retirar GuHCl residual y otras sales. Las muestras se secaron en un SpeedVac y se suspendieron en 100 pl de bicarbonato de trietilamonio 0,1 M pH 8,5 antes de la digestion con 2 pg de oro de tripsina a +37 °C en un agitador durante aproximadamente 16 h. Una almuota de 50 pl se seco y se uso para el marcaje iTRAQ.
El marcaje isobarico iTRAQ 4-plex se uso para permitir la mezcla de hasta 3 muestras y una muestra de referencia por conjunto de muestras. La muestra de referencia constituyo una muestra de extractos de cartflago provenientes de la cabeza femoral, costilla, menisco y nucleo pulposo con el fin de tener tantas protemas como fuera posible representadas en la cuantificacion relativa. Todas las muestras se compararon con esta muestra de referencia y se calcularon las proporciones entre muestra y referencia. La etapa de marcaje se llevo a cabo de la siguiente manera: las muestras se redisolvieron en 30 pl de bicarbonato de trietilamonio 0,5 M pH 8,5. Los reagentes iTRAQ se llevaron a temperatura ambiente, redisolvieron en 70 pl de etanol, se arremolinaron y centrifugaron de inmediato antes de agregarlos a las muestras. La incubacion se realizo durante 1 h a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo por adicion de 100 pl de agua. Para verificar la eficiencia del marcaje, se inyecto una almuota (0,5 %) de la muestra marcada en la trampa ionica LC-MS. Los datos generados se revisaron para marcaje incompleto usando modificacion de iTRAQ variable en la busqueda en base de datos. Los digeridos marcados se secaron en un SpeedVac y se lavaron dos veces con 500 pl de acetonitrilo al 50 % en acido formico al 0,1 % para retirar sales y luego se secaron de nuevo. Las muestras marcadas se redisolvieron en 100 pl de acido formico al 2 %. Las muestras se mezclaron en conjunto con la muestra de referencia en una proporcion 1:1:1 y se diluyeron hasta 500 pl con regulador de inicio de intercambio cationico antes de la inyeccion en la columna de intercambio ionico. Debido a que todos los analisis usan la misma referencia, todos los datos de muestra podnan compararse por normalizacion con respecto a esta. Se seleccionaron los cartflagos articulares (cabeza femoral, cabeza del humero y condilo de tibia media de rodilla) para analisis como una mezcla (FHK) debido a que se esperaba que sean los mas similares. La otra mezcla (MAN) fue meniscos en conjunto con el anillo fibroso de estructuras de disco y nucleo pulposo mientras que la ultima mezcla fue costilla y traquea en diversas combinaciones. En otro conjunto de muestras, se analizaron las siguientes muestras, representando cada una un paciente (OA temprana cartflago-1, OA temprana cartflago-2, OA temprana cartflago-3, OA temprana cartflago-4, OA temprana cartflago-5, OA temprana cartflago-6, OA tardfa cartflago-7, OA temprana cartflago-8, RA cartflago-1, RA cartflago-2, RA cartflago-3, RA cartflago-4), RA cartflago-5, RA cartflago-6, y cartflago normal. Tres muestras que se marcaron con diferentes marcadores iTRAQ se mezclaron con la muestra de referencia, que se marco con un cuarto marcador iTRAQ. Al usar la misma muestra de referencia en todos los conjuntos de analisis se permitira obtener una comparacion cuantitativa entre todas las muestras.
Cromatograffa de intercambio ionico fuera de lmea
Las separaciones de intercambio ionico iniciales se realizaron en un sistema micro-LC (SMART, Pharmacia, Uppsala, Suecia) usando una columna potente (2,1 mm i.d. x 100 mm, Aspartamida polisulfoetil 5 pm, tamano de poro 300 A, PolyLC, Columbia, MD, USA) de intercambio cationico (SCX). La elucion fue isocratica durante 13 min con 99,5 % de solvente A (fosfato de potasio 10 mM, acetonitrilo al 20%, pH 2,8) y solvente B al 0,5 % (KCl 1 M, fosfato de potasio 10 mM, acetonitrilo al 20%, pH 2,8) seguida de un gradiente lineal durante 60 min de concentracion de sal en aumento a 130 mM. Posteriormente, el gradiente aumento durante 15 min hasta KCl 385 mM y finalmente durante 6 min hasta sal 1 M. Las fracciones de 300-500 pl se recolectaron en tubos Eppendorf de 0,5 ml (Safelock™, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania).
Espectrometna de masas
Las fracciones a partir de la separacion SCX fuera de lmea se secaron, redisolvieron en 60 pl de acido formico al 0,2 % del cual 10 pl se purificaron y concentraron usando concentradores de protemas de fase inversa hechos a mano,
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espesor de discos de 4 (Rappsilber et al., Anal. Chem. (2003), vol. 75, pp 663-670). Los peptidos retenidos se fueron eluidos usando 10 jl de acetonitrilo al 50 % en acido formico al 0,1 % en ampollas de vidrio cargadoras de muestras (Qsert, Waters, Milford, MA, USA). El solvente organico se evaporo usando un SpeedVac y los peptidos se redisolvieron en 10 jl de acido formico al 0,2 % antes de la inyeccion en los diversos sistemas LC-MS. La eficiencia del marcaje se probo mediante la inyeccion de una pequena alfcuota de cada muestra en un sistema LC-MS de trampa ionica antes de mezclar las muestras en los conjuntos de muestras.
Q-TOF LC-MS
El Q-tof MS (Q-TOF micro, Waters) se conecto con un CapLC (Waters) con el mismo tipo de precolumna segun se describe anteriormente y una columna analttica Waters Symmetry, C18, partfculas de 3,5 jm, 150 mm de longitud x 75 jm de i.d. La columna analttica se acoplo a una aguja PicoTip™ (New Objective, Woburn, MA, USA). La separacion de fase inversa en lmea se realizo usando una tasa de flujo de aproximadamente 250 nl/min y un gradiente lineal a partir de B al 5 % (fases moviles en cuanto al LC-MS de trampa ionica) a B al 51% durante 60 min, a continuacion siguio un lavado durante 6 min con B al 95%, y reacondicionando con respecto a las condiciones iniciales durante 12 min. Las corridas en blanco se corrieron antes de minimizar la contaminacion cruzada entre fracciones. El instrumento opero usando adquisicion dependiente de datos mediante seleccion de los cuatro iones con mayor intensidad, siempre que se cargaran de manera multiple, para MSMS durante 2 s.
Busqueda en base de datos
Los datos puros de la espectrometna de masas se procesaron usando Protein Lynx 2.1 (Waters) y calibracion nano- lockspray usando el pico de eritromicina a 716, 45 Da como masa de calibracion. Los archivos procesados se buscaron usando MASCOT con los siguientes parametros de busqueda: iTRAQ (N-termino), iTRAQ (K) y carbamidometilacion (C) como modificaciones fijas. Mientras que la manosilacion (W), iTRAQ (Y), deamidacion (N, Q), oxidacion (M, P) se consideraron como modificaciones variables. Otros parametros de busqueda MASCOT fueron: masas monoisotropicas, tolerancia de masa de peptido ±0,2 Da, tolerancia de masa de fragmento MSMS ±0,2 Da, corte de perdida maxima de 2, punto de interes ionico >20, solo correspondencias de peptidos de mayor ranking y taxonomfa de homo sapiens. Los cortes de estilo medio que solo contienen un sitio en un extremo esperado de la enzima que se usa se aplicaron en los criterios de busqueda para identificacion de peptidos que conteman un corte (biologico) endogeno que ocurre antes del aislamiento.
Analisis de datos
Los parametros de cuantificacion de iTRAQ fueron: umbral significativo p<0,05, proporciones ponderadas, ausencia de normalizacion, numero mmimo de peptidos de 1, cargas precursoras mmimas de 2, homologfa de, al menos, 0,05, se incluyeron factores de correccion de software para cada marcador.
Muestras de fluido sinovial
Columnas por afinidad:
Para enriquecimientos por afinidad se agregaron 1 mg de anticuerpo P2D3 de COMP o 0,75 mg de anticuerpo 12a11 de COMP a alfcuotas de gel MiniLeak (KemEnTec, Dinamarca) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Un anticuerpo no unido se lavo con NaCl 0,15 M. Para bloquear los sitios no reactivos, el gel se incubo durante 3 h a temperatura ambiente con etanolamina 0,2 M. La eficiencia de acoplamiento se determino en 39 % para el anticuerpo P2D3 (correspondiente a 390 jg de anticuerpo unido) y de 76 % para el anticuerpo 12a11 (correspondiente a 570 jg de anticuerpo unido).
Enriquecimiento por afinidad de COMP de fluido sinovial
El fluido sinovial (8 ml) de un paciente que se diagnostico con RA (duracion de enfermedad de 9 meses) y fluido sinovial (5 ml) de un paciente que se diagnostico con OA se incubaron con NEM (N-etilmalemida) 5 mM antes de la centrifugacion durante 20 min 1000 g a temperatura ambiente. El fluido sinovial de un paciente con traumatismo agudo se diluyo en 2 vol con fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, SDS al 0,8 % w/v y se incubo durante 2 h a RT. El exceso de SDS se neutralizo mediante la adicion de 1 vol de Triton-XIOO al 4 % en PBS y se incubo durante la noche a RT. Las muestras se pasaron primero a traves de una columna MiniLeak sin anticuerpo para retirar el material de union no espedfica. La muestra no unida se aplico luego a la columna P2D3 y el flujo a traves de la columna P2D3 se aplico directamente a la columna 12a11. Ambas columnas se lavaron con HBS 15 ml (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4), a continuacion siguio un lavado con 2 ml de regulador de sal elevada (HEPES 10 mM, NaCl 650 mM, pH 7,4) y finalmente con HBS 5 ml. Para elucion se agregaron fracciones de 800 jl de citrato 0,1 M pH 3 a las columnas. Las fracciones efluentes se neutralizaron de inmediato con 200 jl de Tris 1,5 M pH 8,8.
Preparacion de muestra por espectrometna de masas y SDS-PAGE
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Antes del SDS-PAGE las muestras eluidas se precipitaron con etanol (9:1) durante la noche a +4 °C antes de centrifugacion (13200 rpm a +4 °C durante 30 min), a continuacion siguio un lavado con etanol durante 4 h a -20 °C. Los comprimidos precipitados se disolvieron en regulador de muestra de SDS-PAGE (Laemmli, Nature (1970), vol. 227, pp 680- 685) sin agente reductor y se separaron en geles con gradiente de poliacrilamida-SDS al 4-16 %. Cada muestra se corrio por triplicado de manera tal que cada banda podfa digerirse con tres enzimas diferentes. Luego de la tincion durante la noche con tintura Blue silver (Candiano et al., Electrophoresis (2004), vol. 25(9), pp 1327-33), las bandas de interes se extirparon y se redujeron con DTT 10 mM (Sigma) a 56 °C durante 30 min y se alquilaron con yodoacetamida 50 mM (Sigma) durante 30 min a temperatura ambiente. Las bandas fueron digeridas durante la noche a 37 °C con ya sea 20 ng/pl de tripsina (Promega) en NH4HCO3 25 mM, 50 ng/pl de quimotripsina (Roche) en NH4HCO3 25 mM, o 40 ng/pl de Asp-N (Roche) en fosfato 50 mM pH 8. Los peptidos se extrajeron de manera consecutiva con TFA al 1%, dos veces con acetonitrilo al 50 % en TFA al 0,1 % y con acetonitrilo al 100 %. Luego de secar los peptidos extrafdos, estos se disolvieron en 10 pl de TFA al 0,1 % y se purificaron en concentradores de protemas etapa C18 segun se describe anteriormente.
Espectrometna de masas
Las muestras de peptidos purificados se disolvieron en 10 pl de acido formico al 0,2 % y una muestra (8 pl) se inyecto en la trampa ionica Esquire HCT (Bruker Daltonik GmbH). La trampa ionica se equipo con un sistema Ultimate HPLC (LC Packings) con una nano-precolumna Pepmap™ (LC Packings, C18, 300 pm de d.i. y 5 mm de longitud) y una columna analftica Atlantis™ (Waters, C18, partfculas de 3 pm, 150 pm de d.i. x 150 mm de longitud). La columna analftica se acoplo al instrumento MS a traves de un nebulizador de microflujo. La separacion de fase inversa en lrnea se llevo a cabo segun se describe en la seccion anterior. Las configuraciones de busqueda en base de datos son las mismas segun se describe anteriormente pero sin la modificacion de iTRAQ. El peptido y la tolerancia de masa de fragmento se configuraron a ±0,4 Da.
Resultados
Los neopftopos identificados se enumeran en la Tabla 2 a continuacion que muestra los sitios de corte que se identifican en el recambio de COMP patologico. En la Tabla 2, la parte del sitio de corte que se representa en negrita corresponde a la secuencia que se identifica mediante MS e incluye el aminoacido terminal del neoepftopo (representando la posicion del corte).
Tabla 2 - Neoepftopos
- Fragmento de peptido identificado mediante MS
- Muestra (enzima) Neoepftopos y sitio de corte Posicion de corte
- NTVMECDACGMQQS (SEQ ID NO: 2)
- SF (tryp) GMQQS (SEQ ID NO: 18) / VRTGL (SEQ ID NO: 33) S77 / V78
- LHCAPGFCFPGVACIQTESGAR
- cartftago SVRPL (SEQ ID NO: 19) / L88 / L89
- (SEQ ID NO: 3)
- (tryp) LHCAP (SEQ ID NO: 34)
- CAPGFCFPGVACIQTESGAR (SEQ ID NO: 4)
- SF (tryp) RPLLH (SEQ ID NO: 20) / CAPGF (SEQ ID NO: 35) H90 / C91
- TESGARCGPCPAGF (SEQ ID NO: 10)
- SF (CT) VACIQ (SEQ ID NO: 21) / TESGA (SEQ ID NO: 36) Q104/ t105
- CVPNSVCINTR (SEQ ID NO: 5)
- cartftago TGQHN (SEQ ID NO: 22) / N190/
- (tryp) CVPNS (SEQ ID NO: 37) C191
- QVCTDINECETGQHNCVPN (SEQ ID NO: 6) + SVCINTRGSF (SEQ ID NO: 7)
- cartftago (tryp) + SF (CT) NCVPN (SEQ ID NO: 23) / SVCIN (SEQ ID NO: 38) N194 / S195
- QCGPCQPGFVGDQASGCQRRAQ
- SF (CT) QRRAQ (SEQ ID NO: 24) / Q226 /
- (SEQ ID NO: 8)
- RFCPD (SEQ ID NO: 39) R227
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- IDVCPENAEVTLTDF (SEQ ID NO: 9)
- SF (tryp) TLTDF (SEQ ID NO: 25) / F531 / r532
- RAFQT (SEQ ID NO: 40)
(continuacion)
- Fragmento de peptido identificado mediante MS
- Muestra (enzima) Neoepftopos y sitio de corte Posicion de corte
- NQGREIVQTMNS (SEQ ID NO: 11)
- SF(AspN) NWVVL (SEQ ID NO: 26) / NQGRE (SEQ ID NO: 41) L554 / N555
- EIVQTMNSDPGLAVGY (SEQ ID NO: 12)
- cartflago (tryp) + SF (tryp) LAVGY (SEQ ID NO: 27) / TAFNG (SEQ ID NO: 42) Y574 / t575
- EIVQTMNSDPGLAVGYTAF (SEQ ID NO: 13)
- cartflago + SF (tryp) GYTAF (SEQ ID NO: 28) / NGVDF (SEQ ID NO: 43) F577 / N578
- GDTESQVRLLWK (SEQ ID NO: 14)
- SF(AspN) ALWHT (SEQ ID NO: 29) / GDTES (SEQ ID NO: 44) T657 / g658
- WFLQHRPQ (SEQ ID NO: 15)
- cartflago (tryp) QHRPQ (SEQ ID NO: 30) / VGYIR (SEQ ID NO: 45) Q691 / v692
- FYEGPELVADSN (SEQ ID NO: 16)
- cartflago (tryp) VADSN (SEQ ID NO: 31) / VVLDT (SEQ ID NO: 46) N710 / V711
- CFSQENIIWANLR (SEQ ID NO: 17)
- cartflago (tryp) RLGVF (SEQ ID NO: 32) / CFSQE (SEQ ID NO: 47) f725 / C726
Los resultados muestras neoepftopos unicos presentes en el recambio de cartflago patologico.
La deteccion o monitoreo de los neopttopos unicos representa un nuevo metodo para detectar ruptura de cartflago patologica. Este metodo puede usarse para diagnosticar pacientes que sufren de enfermedades entre las que se incluyen, pero sin limitacion, RA, OA, ReA, artritis psoriasica, artritis cronica juvenil, enfermedad cardiovascular, enfermedad de los tendones, osteoporosis, osteomalacia, reparacion de fracturas, arteriosclerosis, esclerodermia, fibrosis de piel y traumatismo, tales como traumatismo articular. Este metodo resulta especialmente util para diagnosticos tempranos de tales enfermedades.
El metodo que se divulga en la presente detectara y monitoreara recambio de COMP y cartflago patologico en enfermedad. Esto resulta posible gracias a la identificacion de neopftopos espedficos unicos para ruptura de cartflago patologica.
Otro aspecto que se divulga en la presente pero que no se reivindica se refiere a un fragmento C-terminalmente truncado de COMP de mairnfero aislado, preferiblemente COMP humana. De acuerdo con este aspecto,
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 77 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 18, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 18 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 18;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 88 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 19, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 19 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 19;
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un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 90 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 20, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 20 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 20;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 104 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 121, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 21 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 21;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 190 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 22, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 22 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 22;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 194 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 23, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 23 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 23;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 226 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 24, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 24 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 24;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 531 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 25, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 25 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 25;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 554 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 26, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 26 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 26;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 574 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 27, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 27 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 27;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 577 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 28, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 28 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 28;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 657 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 29, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 29 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 29;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 691 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 30, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 30 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 30;
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 710 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 31, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 31 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 31; o
un extremo C-terminal del fragmento es el aminoacido 725 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 32, que comienza a partir de un extremo C-terminal de SEQ ID NO: 32 y se extiende hacia el extremo N-terminal de SEQ ID NO: 32.
Segun se usa en la presente, “un fragmento que comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de una secuencia de aminoacidos dada que comienza a partir de un extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos dada y se extiende hacia un extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos dada” implica que el fragmento comprende, al menos, el aminoacido en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos dada; el aminoacido anterior, en la direccion hacia el extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos dada, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos dada y el segundo aminoacido anterior con respecto al extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos dada. Por ejemplo, se supone que la secuencia de aminoacidos dada es SEQ ID NO: 18, a saber, GMQQS. En tal caso, el fragmento comprende, al menos, QQS.
En una realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el fragmento comprende, al menos, cuatro aminoacidos consecutivos de la secuencia de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO: 18-32 que comienza a partir del extremo C-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 18-32 (vease columna 4 de la Tabla 2) y se extiende hacia el extremo N-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 18-32.
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En otra realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el fragmento comprende, al menos, cinco aminoacidos consecutivos de la secuencia de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO: 18-32 que comienza a partir del extremo C-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 18-32 (vease columna 4 de la Tabla 2) y se extiende hacia el extremo N-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 18-42. Por lo tanto, en esta realizacion, el fragmento comprende la secuencia de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO. 18-32. En una realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el fragmento consiste de las secuencias de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO: 18-32.
Otras variantes que se divulgan en la presente pero que no se reivindican podnan ser fragmentos C-terminalmente truncados aislados que comprenden mas de cinco aminoacidos, tales como seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce aminoacidos. En un caso como tal, el fragmento C-terminalmente truncado tiene un extremo C-terminal que es el aminoacido 77, 88, 90, 104, 190, 194, 226, 531, 554, 574, 577, 657, 691, 710 o 725 de la SEQ ID NO: 1 y tiene una secuencia de aminoacidos que corresponde a seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce aminoacidos en la SEQ ID NO: 1, que comienza a partir del aminoacido 77, 88, 90, 104, 190, 194, 226, 531, 554, 574, 577, 657, 691, 710 o 725 de la SEQ ID NO: 1 y se extiende hacia el extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 1.
En una realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el fragmento C-terminalmente truncado aislado tiene una secuencia amino segun se define en cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 6, 8, 9, 12, 13, 15, 16, 18-32, preferiblemente segun se define en cualquiera de la SEQ ID NO: 18-32.
Otro aspecto que se divulga en la presente pero que no se reivindica se refiere a un fragmento N-terminalmente truncado de COMP de mairnfero aislado, preferiblemente COMP humana. De acuerdo con este aspecto,
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 78 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 33, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 32 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 33;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 89 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 34, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 34 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 34;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 91 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 35, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 35 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 35;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 105 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 36, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 36 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 36;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 191 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 37, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 37 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 37;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 195 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 38, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 38 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 38;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 227 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 39, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 39 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 39;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 532 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 40, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 40 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 40;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 555 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 41, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 41 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 41;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 575 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 42, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 42 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 42;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 578 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 43, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 43 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 43;
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un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 658 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 44, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 44 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 44;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 692 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 45, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 45 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 45;
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 711 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 46, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 46 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 46; o
un extremo N-terminal del fragmento es el aminoacido 726 de SEQ ID NO: 1, y el fragmento comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO: 47, que comienza a partir de un extremo N-terminal de SEQ ID NO: 47 y se extiende hacia el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 47.
Segun se usa en la presente, “un fragmento que comprende, al menos, tres aminoacidos consecutivos de una secuencia de aminoacidos dada que comienza a partir de un extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos dada y se extiende hacia un extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos dada” implica que el fragmento comprende, al menos, el aminoacido en el extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos dada; el aminoacido siguiente, en la direccion hacia el extremo C-terminal de la secuencia de aminoacidos dada, el extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos dada y el segundo aminoacido siguiente con respecto al extremo N-terminal de la secuencia de aminoacidos dada. Por ejemplo, se supone que la secuencia de aminoacidos dada es SEQ ID NO: 33, a saber, VRTGL. En tal caso, el fragmento comprende, al menos, VRT.
En una realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el fragmento comprende, al menos, cuatro aminoacidos consecutivos de la secuencia de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47 que comienza a partir del extremo N-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47 (vease columna 4 de la Tabla 2) y se extiende hacia el extremo C-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47.
En otra realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el fragmento comprende, al menos, cinco aminoacidos consecutivos de la secuencia de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47 que comienza a partir del extremo N-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47 (vease columna 4 de la Tabla 2) y se extiende hacia el extremo C-terminal de la cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47. Por lo tanto, en esta realizacion, el fragmento comprende la secuencia de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO. 33-47. En una realizacion especial, el fragmento consiste de las secuencias de aminoacidos en cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47.
Otras variantes que se divulgan en la presente pero que no se reivindican podnan ser fragmentos N-terminalmente truncados aislados que comprenden mas de cinco aminoacidos, tales como seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce aminoacidos. En un caso como tal, el fragmento N-terminalmente truncado tiene un extremo N-terminal que es el aminoacido 78, 89, 91, 105, 191, 195, 227, 532, 555, 575, 578, 658, 692, 711 o 726 de la SEQ ID NO: 1 y tiene una secuencia de aminoacidos que corresponde a seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce aminoacidos en la SEQ ID NO: 1, que comienza a partir del aminoacido 78, 89, 91, 105, 191, 195, 227, 532, 555, 575, 578, 658, 692, 711 o 726 de la SEQ ID NO: 1 y se extiende hacia el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 1.
En una realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el fragmento N-terminalmente truncado aislado tiene una secuencia amino segun se define en cualquiera de la SEQ ID NO: 3-5, 7, 10, 11, 14, 17, 33-47, preferiblemente segun se define en cualquiera de la SEQ ID NO: 33-47.
Fragmentos mas largos pueden usarse tambien, siempre que el aminoacido terminal sea identico con respecto al aminoacido terminal de los peptidos en la Tabla 2 (que se representan por el aminoacido en “posicion” en la Tabla 2).
Algunas veces, los peptidos no son antigenicos por sf mismos. Por lo tanto, los peptidos se acoplan frecuentemente a una protema exogena o transportadora de peptido actuando asf como un hapteno. Normalmente, tales trasportadoras de peptidos se eligen de manera tal que no se producen en ninguna especie a ser investigada para evitar reaccion de los anticuerpos con respecto a esta transportadora de peptido. De esta manera, la reactividad estara restringida al neoepftopo en el peptido corto.
Un aspecto adicional que se divulga en la presente pero que no se reivindica se refiere a un conjugado que se configura para usarse en la produccion de anticuerpos contra de, al menos, un neoepftopo de COMP de mamfero, preferiblemente COMP humana. El, al menos, un neoepftopo se forma por corte de la COMP de mamfero en, al menos, un sitio de corte que se selecciona a partir de un grupo que consiste de entre la posicion 77 (S77) y posicion 78 (V78); posicion 88 (L88) y posicion 89 (L89); posicion 90 (H90) y posicion 91 (C91); posicion 104 (Q104) y posicion 105 (T105); posicion 190 (N190) y posicion 191 (C191); posicion 194 (N194) y posicion 195 (S195); posicion 226 (Q226) y posicion 227 (R227); posicion 531 (F531) y posicion 532 (R532); posicion 554 (L554) y posicion 555 (N555); posicion 574 (Y574) y posicion 575 (T575); posicion 577 (F577) y posicion 578 (N578); posicion 657 (T657) y posicion 658 (G658); posicion 691
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(Q691) y posicion 692 (V692); posicion 710 (N710) y posicion 711 (V711) y posicion 725 (F725) y posicion 726 (C726) de la secuencia de aminoacidos de dicha COMP de mamfero segun se define en SEQ ID NO: 1, o una combinacion de estas. El conjugado comprende, al menos, un fragmento C-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior y/o, al menos, un fragmento N-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior que se acopla o se mezcla con una transportadora de peptido.
En una realizacion que se divulga en la presente pero que no se reivindica, el, al menos, un fragmento C-terminalmente truncado aislado, se acopla a la transportadora de peptido mediante su extremo N-terminal y el, al menos, un fragmento N-terminalmente truncado aislado se acopla a la transportadora de peptido mediante su extremo C-terminal.
En una realizacion especial que se divulga en la presente pero que no se reivindica, la transportadora de peptido se selecciona a partir del grupo que consiste de hemocianina de lapa californiana (KHL) y ovoalbumina.
La transportadora de peptido puede usarse, ademas, sin acoplamiento covalente al peptido o fragmento, a saber, se proporciona mezclada con el fragmento.
La preparacion del fragmento C-terminalmente truncado y/o N-terminalmente truncado aislado in vitro puede realizarse mediante un metodo que permite la expresion del fragmento usando un vector de expresion de ADN recombinante que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica el fragmento para su expresion. Una celula huesped procariota o eucariota compatible se transforma luego con el vector de expresion de manera tal que el fragmento puede expresarse por la celula huesped. La celula huesped transformada se cultiva en un medio de cultivo adecuado para producir el fragmento.
Aspectos adicionales que se divulgan en la presente pero que no se reivindican se refieren a una secuencia de polinucleotidos aislada que codifica un fragmento C-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior y/o un fragmento N-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior, un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia de polinucleotidos aislada como tal y una celula huesped transformada con un vector de expresion recombinante como tal.
Un aspecto adicional que se divulga en la presente pero que no se reivindica se refiere al uso de un fragmento C- terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior, un fragmento N-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior y/o un conjugado de acuerdo con lo anterior para la produccion de anticuerpos que se unen espedficamente a, al menos, un neoepftopo que se forma por corte de COMP de mamftero en, al menos, un sitio de corte que se selecciona a partir de un grupo que consiste de entre la posicion 77 (S77) y posicion 78 (V78); posicion 88 (L88) y posicion 89 (L89); posicion 90 (H90) y posicion 91 (C91); posicion 104 (Q104) y posicion 105 (T105); posicion 190 (n190) y posicion 191 (C191); posicion 194 (N194) y posicion 195 (S195); posicion 226 (Q226) y posicion 227 (R227); posicion 531 (F531) y posicion 532 (R532); posicion 554 (L554) y posicion 555 (N555); posicion 574 (Y574) y posicion 575 (T575); posicion 577 (F577) y posicion 578 (N578); posicion 657 (T657) y posicion 658 (G658); posicion 691 (Q691) y posicion 692 (V692); posicion 710 (N710) y posicion 711 (V711) y posicion 725 (F725) y posicion 726 (C726) de la secuencia de aminoacidos de COMP de mamftero segun se define en SEQ ID NO: 1, o una combinacion de estas.
Un aspecto relacionado que se divulga en la presente pero que no se reivindica define un metodo para producir anticuerpos que se unen espedficamente a, al menos, un neoepftopo que se forma por corte de COMP de mamftero en, el menos, un sitio de corte que se selecciona a partir de un grupo que consiste de entre la posicion 77 (S77) y posicion 78 (V78); posicion 88 (L88) y posicion 89 (L89); posicion 90 (H90) y posicion 91 (C91); posicion 104 (Q104) y posicion 105 (T105); posicion 190 (N190) y posicion 191 (C191); posicion 194 (N194) y posicion 195 (S195); posicion 226 (Q226) y posicion 227 (R227); posicion 531 (F531) y posicion 532 (R532); posicion 554 (L554) y posicion 555 (N555); posicion 574 (Y574) y posicion 575 (T575); posicion 577 (F577) y posicion 578 (n578); posicion 657 (T657) y posicion 658 (G658); posicion 691 (Q691) y posicion 692 (V692); posicion 710 (N710) y posicion 711 (V711) y posicion 725 (F725) y posicion 726 (C726) de la secuencia de aminoacidos de la COMP de mamftero segun se define en SEQ ID NO: 1, o una combinacion de estas. El metodo comprende presentar anticuerpos contra un fragmento C-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior, un fragmento N-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior y/o un conjugado de acuerdo con lo anterior y aislar los anticuerpos.
Otro aspecto relacionado que se divulga en la presente pero que no se reivindica define un anticuerpo aislado contra un fragmento C-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior, un fragmento N-terminalmente truncado aislado de acuerdo con lo anterior y/o un conjugado de acuerdo con lo anterior. El anticuerpo aislado se une espedficamente a, al menos, un neoepftopo que se forma por corte de COMP de mamftero en, el menos, un sitio de corte que se selecciona a partir de un grupo que consiste de entre la posicion 77 (S77) y posicion 78 (V78); posicion 88 (L88) y posicion 89 (L89); posicion 90 (H90) y posicion 91 (C91); posicion 104 (Q104) y posicion 105 (T105); posicion 190 (N190) y posicion 191 (c191); posicion 194 (N194) y posicion 195 (S195); posicion 226 (Q226) y posicion 227 (R227); posicion 531 (F531) y posicion 532 (R532); posicion 554 (L554) y posicion 555 (N555); posicion 574 (Y574) y posicion 575 (T575); posicion 577 (F577) y posicion 578 (N578); posicion 657 (T657) y posicion 658 (g658); posicion 691 (Q691) y posicion 692 (v692); posicion 710 (N710) y posicion 711 (V711) y posicion 725 (F725) y posicion 726 (C726) de la secuencia de aminoacidos de la COMP de mamftero segun se define en SEQ ID NO: 1, o una combinacion de estas.
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Un aspecto relacionado adicional que se divulga en la presente pero que no se reivindica define un anticuerpo aislado de acuerdo con lo anterior para uso en la determinacion de recambio de cartftago patologico.
Los anticuerpos contra fragmentos o conjugado pueden obtenerse mediante la inmunizacion de un animal con uno o mas fragmentos, uno o mas peptidos y/o uno o mas conjugados de acuerdo con las realizaciones. El animal inmunizado puede seleccionarse a partir del grupo que comprende humanos, ratones, ratas, conejos, ovejas, primates no humanos, cabras, caballos y aves de corral.
Los anticuerpos que se divulgan en la presente pero que no se reivindican pueden obtenerse mediante metodos de inmunizacion in vitro usando uno o mas fragmentos, uno o mas peptidos y/o uno o mas conjugados de acuerdo con las realizaciones.
El anticuerpo que se divulga en la presente pero que no se reivindica puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
La produccion de un anticuerpo puede involucrar el enfoque de presentacion en fago. Cuando se genera el anticuerpo mediante el enfoque de presentacion en fago, el anticuerpo puede ser un ligando, uno o mas fragmentos de un anticuerpo, tal como un Fab (fragmento de union a antfgeno) o un fragmento F(ab)'2 (un fragmento que contiene dos Fab), o un anticuerpo intacto.
Los anticuerpos que se divulgan en la presente pero que no se reivindican pueden usarse para detectar neoepftopos de las realizaciones, y, de acuerdo con esto, pueden usarse para detectar tales neoepftopos en una muestra, por ejemplo, con el fin de determinar si un sujeto mairftfero ha sufrido o sufre de recambio de cartftago patologico.
Ejemplo 1
Los peptidos que se representan en la Tabla 2 y que representan los neoepftopos que se generan por corte patologico de COMP (SEQ ID NO: 1), se sintetizan y se usan para inmunizar conejos de acuerdo con un protocolo estandar. Los peptidos se sintetizaron de manera que conteman los 5 aminoacidos terminales segun se indica en la Tabla 2 (columna 3), con el aminoacido muy terminal y no sustituido que se libera por corte que se indica por su numero en la secuencia y con una secuencia de tres residuos de glicina seguidos de una cistema en el extremo opuesto. Los peptidos se unieron a la hemocianina de lapa californiana mediante su cistema terminal y se usaron para inmunizar conejos mediante protocolos estandares. La smtesis de peptidos y la produccion de anticuerpos son servicios personalizados provistos por Genscript Ltd (Hong Kong) usando metodos estandares.
Los tftulos de anticuerpos que se producen se evaluaron por ensayo en fase solida. Los peptidos con el aminoacido terminal correspondiente al corte y que incluyen los 7 aminoacidos vecinos de la secuencia natural de protemas se usaron en placas de microtitulacion de cubierta de poliestireno (Nunc, Maxisorp) a 1 pg/ml en PBS-regulador. Los antisueros se agregaron a los respectivos peptidos recubiertos en diluciones diversas (a partir de 1:200 en etapas de 5 a 1:25000) y los anticuerpos de union se detectaron por un anticuerpo de cerdo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina de acuerdo con los metodos estandares que se conocen en el estado de la tecnica.
Las curvas de titulacion se proporcionan en la Fig. 1.
Ejemplo 2
El fluido sinovial se recolecta mediante aspiracion articular y se centrifuga de inmediato para retirar celulas y cualquier partmula. El fluido sinovial se diluye 1:10 en diluyente de muestra como las muestras de suero.
Los ensayos de ELISA de competicion se desarrollaron para un neoepftopo y se aplicaron para cuantificar el fragmento-COMP respectivo en las muestras de fluido sinovial de pacientes con RA u OA y para muestras de sangre de control de donantes sanos.
Las placas de microtitulacion de 96 pozos (Nunc-Immunoplates, Maxisorp, Nunc Intermedia Ltd, Copenhage, Dinamarca) se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente en una camara humeda con 50 pl del peptido CEVTLTDF531 de COMP de 8 aminoacidos a 25 ng/ml en PBS pH 7. Luego de enjuagar las placas con cloruro de sodio 0,15 M y Tween 20 al 0,05 % (w/v), los sitios de union libres de la superficie del poliestireno se bloquearon con 120 pl de albumina de suero bovino 2 mg/ml (Sigma-Aldrich) en PBS, pH 7,5 durante 1 h a temperatura ambiente.
El peptido CEVTLTDF de COMP se uso como estandar para generar una curva de calibracion. El estandar se diluyo (de 0,244 a 250 ng/ml) en una solucion de BSA al 0,5 %, SDS al 0,8 % (w/v), EDTA 10 mM en cloruro de sodio 0,1 M, fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,5. Las muestras de fluidos sinoviales y sueros se diluyeron 10 veces en SDS al 0,8 % (w/v), EDTA 10 mM, cloruro de sodio 0,1 M, fosfato de sodio 0,05 M pH 7,5. Treinta microlitros del estandar diluido y las muestras se incubaron en una placa sterilin (Bibby Sterilin Ltd., U.K.) durante la noche a temperatura ambiente en una camara humeda. Al dfa siguiente, se agregaron 30 pl de anticuerpos diluidos (1:15000 anti-CEVTLTDF) a la placa sterilin en Triton al 4 % en fosfato (NaH2PO4) 10 mM, pH 7,5. Luego de 1 h de preincubacion a temperatura ambiente,
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50 pl de la mezcla se agregaron a los pozos recubiertos de la placa NUNC. Luego de 1 h de incubacion a temperatura ambiente, las placas se enjuagaron segun lo anterior y los anticuerpos unidos se detectaron al agregar 50 pl de dilucion 1:1000 de anticuerpo de cerdo anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina ((DAKO A/S, Dinamarca) en 2 mg/ml de albumina de suero bovino, cloruro de sodio 0,1 M, fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,5. Luego de 1 h de incubacion a temperatura ambiente, las placas se enjuagaron segun lo anterior y se agregaron 100 pl de sustrato (1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato en dietanolamina 1M pH 9,8 que contema MgCh 0,5 M). La absorbancia de cada muestra y de la estandar se midio a 405 nm por duplicado mediante un lector de microplaca (Expert96, AsysHitech, Austria). El programa de software Mikrowin 200 (AsysHitech, Austria) se uso para trazar la curva de calibracion y para calcular el contenido de neoepftopos de COMP en las muestras analizadas. Los niveles medidos de fragmentos-COMP en fluidos sinoviales a partir de RA y OA respectivamente se muestran en la Fig. 2.
Ejemplo 3
Las muestras de fluido sinovial (50 pl) se diluyeron con un volumen de fosfato de sodio 100 mM pH 7,5, EDTA 20 mM y NaCl 1 M. Al fluido sinovial diluido se agregaron 35 pl de polietilenglicol 6000 al 50 % (w/v) (Merck KGaA, Alemania) en fosfato de sodio 50 mM pH 7,5, EDTA 10 mM y NaCl 0,5 M. La mezcla se incubo durante 60 min a temperatura ambiente y luego se centrifugo a 12000 g durante 15 minutos a 4 °C. Los comprimidos recolectados se resuspendieron en 200 pl de Tris 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 y se transfirieron a un tubo que contema 75 pl de protema A-sefarosa. La mezcla se incubo durante 15 minutos y los tubos se centrifugaron a 300 g durante 2 minutos. El sobrenadante se recolecto y se precipito con 9 volumenes de etanol al 95 %. Las protemas precipitadas se disolvieron en regulador de muestra de electroforesis (SDS al 2 %, Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, azul de bromofenol al 0,002 % y glicerol al 20 %) sin o con 10% de 2-mercaptoetanol para reduccion, se cocio a 100 °C durante 4 min y se separo en base al gradiente de geles de losa de poliacrilamida (4-16 %) con un gel de carga al 4 %. Las protemas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Millipore). Para la inmunotransferencia, las membranas se bloquearon en albumina de suero bovino al 3 % en solucion salina regulada por Tris pH 7,2 que contema Tween 20 al 0,05 % durante la noche a 4 °C y luego se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con los anticuerpos diluidos 1:2000 en albumina de suero bovino al 3% en solucion salina regulada por Tris pH 7,2. Luego de tres lavados con solucion salina regulada por Tris pH 7,2 que contema Tween 20 al 0,05 %, se agrego anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rabano (Jackson Laboratories, USA) diluido 1:25000 en la misma solucion como el anticuerpo primario y se incubo durante 1 h a temperatura ambiente. Luego del lavado, la senal se desarrollo con sistema de deteccion de inmunotransferencia EC (Thermo Scientific) y se detecto usando Agfa Cronex 5 film. Las inmunotransferencias con uno de los anticuerpos de neoepftopo se muestran en la Fig. 3.
Ejemplo 4
Las muestras de fluido sinovial se prepararon segun se describe en el Ejemplo 3 pero, luego de la etapa de la protema A-sefarosa, tuvo lugar una 2da etapa de precipitacion con PEG 6000 al 12,5 % para reducir el volumen de muestra. El comprimido se resuspendio en solucion salina regulada por Tris pH 7,2 al volumen original de fluido sinovial. Una aftcuota de la muestra se redujo (ditiotreitol 10 mM, DTT) y se alquilo (yodoacetamida 50 mM, IAA) antes de la digestion durante la noche a 37 °C con tripsina (Promega). Las muestras tripsinadas se filtraron a traves de un filtro de giro de 30 kDa (Nanosep 30k, PALL life sciences), a continuacion siguio un filtro de giro C-is (SS18V, Nest Group, Inc., USA) para desalinizacion. Un volumen de inyeccion correspondiente a 1,25 pl de muestra de fluido sinovial se inyecto en el espectrometro de masa de triple cuadrupolo (TSQ Vantage, Thermo Scientific, USA) y se realizaron experimentos de monitoreo de reaccion multiple (MRM) para el peptido de neoepftopo (S195YCINTR). Los iones y4, y5 e y6 de fragmento se midieron a partir del precursor peptidico (425,22, 2+). La suma de estas senales de fragmentos (transiciones) se muestran en la Fig. 4 y constituyeron inyecciones dobles (a, b) realizadas para traumatismo agudo y dos muestras de artritis reumatoide, respetivamente. Las muestras de traumatismo agudo conteman niveles mas altos del neoepftopo en comparacion con las muestras de RA pero este se detecto incluso en todas las muestras evaluadas. Debena tenerse en cuenta que las muestras en este ejemplo son diferentes con respecto a la muestra para el descubrimiento del neoepftopo. De manera adicional, el lado complementario del sitio de corte exacto se detecto en muestras de tejido a partir de tejido de OA temprana (grupo 3 segun se describe anteriormente).
Las realizaciones que se describen anteriormente se deberan comprender como unos pocos ejemplos ilustrativos de la presente invencion. Debera comprenderse por aquellos capacitados en el estado de la tecnica que diversas modificaciones, combinaciones y cambios pueden realizarse con respecto a las realizaciones sin abandonar el alcance de la presente invencion. En especial, diferentes soluciones de partes en las diferentes realizaciones pueden combinarse en otras configuraciones, si esto resulta tecnicamente posible. El alcance de la presente invencion se define, sin embargo, por las reivindicaciones adjuntas.
Listado de secuencias
<110> AnaMar AB
<120> Determinacion de recambio de cartftago patologico <130> P1186PC00
<150> US 61/690,525 5 <151> 2012-06-28
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
10
<210> 1 <211> 757 15 <212> PRT
<213> Humano <400> 1
20
- Met
- Val Pro Asp Thr Ala Cys Val Leu Leu Leu Thr Leu Ala Ala Leu
- 1
- 5 10 15
- Gly Ala
- Ser Gly Gin Gly Gin Ser Pro Leu Gly Ser Asp Leu Gly Pro
- 20 25 30
- Gin
- Met Leu Arg Glu Leu Gin Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gin Asp Val
- 35 40 45
- Arg
- Glu Leu Leu Arg Gin Gin Val Arg Glu lie Thr Phe Leu Lys Asn
- 50 55 60
- Thr
- Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Met Gin Gin Ser Val Arg
- Thr
- 65
- 70 75 80
- Gly
- Leu Pro Ser Val Arg Pro Leu Leu His Cys Ala Pro Gly Phe Cys
- 85 90 95
- Phe
- Pro Gly Val Ala Cys He Gin Thr Glu Ser Gly Ala Arg Cys Gly
- 100 105 110
- Pro
- Cys Pro Ala Gly Phe Thr Gly Asn Gly Ser His Cys Thr Asp Val
- 115 120 125
- Asn
- Glu Cys Asn Ala His Pro Cys Phe Pro Arg Val Arg Cys lie
- Asn
- 130 135 140
- Thr
- Ser Pro Gly Phe Arg Cys Glu Ala Cys Pro Pro Gly Tyr Ser Gly
- 145
- 150 155 160
- Pro
- Thr His Gin Gly Val Gly Leu Ala Phe Ala Lys Ala Asn Lys Gin
- 165 170 175
Claims (4)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Un metodo de inmunoensayo para distinguir entre recambio de cartftago patologico y recambio de cartftago benigno o normal, comprendiendo el metodo:a) detectar, en una muestra, la presencia de, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal de protema oligomerica de matriz de cartftago, COMP, de mamfero, en la que dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal se forma por corte de dicha COMP de mamfero en el recambio de cartftago patologico, en la que dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal no se forma en el recambio de cartftago benigno o normal, y en la que la deteccion de dicho, al menos, un neoepftopo N o C-terminal comprende:poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo aislado, en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a un neoepftopo N- o C-terminal que se forma por corte de COMP de mamfero en el recambio de cartftago patologico; ydetectar la presencia de dicho, al menos, un neoepftopo N- o C- terminal en dicha muestra que se basa en dicho anticuerpo aislado; yb) determinar la presencia de recambio de cartftago patologico que se basa en dicha presencia detectada de dicho, al menos, un neoepftopo N- o C-terminal en dicha muestra;en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a una secuencia de aminoacidos de neoepftopo N-terminal que se selecciona a partir de un grupo que consiste de:
imagen1 o en la que dicho anticuerpo aislado se une espedficamente a una secuencia de aminoacidos de neoepftopo C- terminal que se selecciona a partir del grupo que consiste de:- GMQQS (SEQ ID NO 18)
- SVRPL (SEQ ID NO 19) RPLLH (SEQ ID NO 20)
- VACIQ (SEQ ID NO 21)
- TGQHN (SEQ ID NO 22) NCVPN (SEQ ID NO 23)
- QRRAQ (SEQ ID NO 24)
- TLTDF (SEQ ID NO 25) NWWL (SEQ ID NO 26)
- LAVGY (SEQ ID NO 27)
- GYTAF (SEQ ID NO 28) ALWHT (SEQ ID NO 29)
- QHRPQ (SEQ ID NO 30)
- VADSN (SEQ ID NO 31) RLGVF (SEQ ID NO 32)
- 2. El metodo de acuerdo con le reivindicacion 1, en el que dicho recambio de cartftago patologico se origina mediante una enfermedad que se selecciona a partir de un grupo que consiste de osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reactiva, artritis psoriasica, artritis cronica juvenil, una enfermedad cardiovascular, enfermedad de los tendones, osteoporosis, osteomalacia, reparacion de fracturas, arteriosclerosis, esclerodermia, fibrosis de piel y traumatismo, tales como traumatismo articular.
- 3. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra se selecciona a partir de un grupo que consiste de una muestra de cartftago y una muestra de fluido corporal.
- 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la muestra de fluido corporal se selecciona a partir de, al menos, una de una muestra de fluido sinovial, una muestra de suero, una muestra de plasma y una muestra de orina.COGOGYTAF576
imagen2 1,6M ■ 1.2 ■l -0,3 ■ 0,6 ■ 0,4 ■ 0,2 ■ a -577NGVDFimagen3 658GDTDiluciones de anticuerpo de 1/25000 a 1/200Fig, iimagen4 imagen5 MW (kDa)Anticuerpoa-CEVTLTDF531No reaucidoReauciaoOOQ_ IN250250148148Fig. 3COCD*n—■fJQ- o
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