ES2311696T3

ES2311696T3 - Metodo para la monitorizacion de la degradacion del colageno tipo ii en el cartilago.

Info

Publication number: ES2311696T3
Application number: ES03718685T
Authority: ES
Inventors: Jean-Yves Reginster; Michelle Deberg; Yves Henrotin; Stephan Christgau
Original assignee: Universite de Liege
Current assignee: Universite de Liege
Priority date: 2002-03-13
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2023-03-12
Also published as: WO2003076947A2; EP1485718A2; AU2003222759A8; ATE403873T1; DE60322682D1; US7410770B2; US20050170429A1; WO2003076947A3; EP1485718B1; US20090042220A1; AU2003222759A1; US7728112B2

Abstract

Un método de ensayo cualitativo o cuantitativo, del colágeno tipo II ó fragmentos del mismo en una muestra biológica, el cual método comprende la puesta en contacto de dichos fragmentos con un socio de unión inmunológico el cual es inmunoreactivo con un epitopo comprendido en la secuencia de aminoácidos HRGYPGLDG, y detección de la inmunoreacción resultante.

Description

Método para la monitorización de la degradación del colágeno tipo II en el cartílago.

La presente invención se refiere a un método para la evaluación del catabolismo del cartílago mediante la determinación del nivel de productos de degradación del colágeno tipo II en una muestra biológica. En una versión preferida, la invención se refiere a un inmunoensayo que comprende un anticuerpo dirigido contra un epitopo específico del colágeno tipo II.

La matriz del cartílago es sintetizada, organizada, mantenida y degradada mediante una población dispersa de condrocitos. Las propiedades del cartílago son críticamente dependientes de la estructura e integridad de la matriz extracelular (ECM). En un cartílago normal los procesos anabólicos y catabólicos de formación y degradación de la ECM están bien equilibrados.

En enfermedades de las articulaciones, tales como la artritis reumatoide (RA) y la osteoartritis (OA), la velocidad de degradación de la ECM excede a menudo la velocidad de síntesis. A causa de ello, la integridad estructural y la fuerza mecánica de los tejidos resulta perjudicada, por lo que se produce la destrucción irreversible de las estructuras de la articulación.

Hasta el momento, había sido difícil dictaminar directamente la continuada destrucción del cartílago en los pacientes de artritis, debido a que los marcadores específicos para este proceso no habían sido puestos a disposición en la práctica clínica. Otros marcadores empleados para dictaminar los pacientes de RA, tales como la proteína Creativa y los factores reumatoides están asociados con el proceso inflamatorio implicado en la enfermedad, pero no están directamente relacionados con el nivel de destrucción del cartílago y no son específicos para la RA. En la OA estos parámetros tienen incluso menos importancia para la monitorización de la degradación del cartílago.

El principal componente estructural del cartílago es el colágeno tipo II, el cual está covalentemente reticulado y reunido en fibras. Intercaladas entre la red de colágeno figuran cadenas largas de ácidos hialurónicos polisacáridos cargados negativamente, a los cuales están unidos varios proteoglicanos de tamaño grande. Las fibras de colágeno tipo II son responsables de la fuerza de tracción mientras que los proteoglicanos proporcionan la tenacidad de compresión necesaria para la normal articulación y funcionamiento. El colágeno maduro tipo II consiste en una estructura helicoidal triple con telopéptidos cortos en ambos extremos. Los telopéptidos reticulan covalentemente con otras moléculas de colágeno con lo que las moléculas de colágeno se empaquetan individualmente dentro de una red fibrilar
rígida.

La degradación del colágeno tipo II implica la presencia de colagenasas (MMP1, MMP8 y MMP13) (Billinghurst et al., 1997). Un sitio de escisión característico de la colagenasa se encuentra en la región helicoidal triple del colágeno tipo II entre los radicales 775 y 776, lo cual genera dos fragmentos que contienen 3/4 y 1/4 de la molécula de colágeno intacta. Se han desarrollado anticuerpos que reconocen la parte C-terminal del fragmento COL2-3/4 y la parte N-terminal de los fragmentos COL2-1/4 (Hollander et al., 1994). Se ha demostrado que el epitopo COL2-3/4 pero no los epitopos COL2-1/4 pueden encontrarse en circulación, probablemente debido a una mayor resistencia a la proteolisis del fragmento COL2-3/4 (Croucher y Hollander 1999). Se han desarrollado inmunoensayos específicos para la detección del neoepitopo COL2-3/4 en los fluidos corporales (patente US 6132976). Se ha informado que los pacientes de RA y OA dictaminados en un estudio cruzado seccional han elevado niveles del marcador derivado de este colágeno tipo II, pero no se han publicado más datos clínicos obtenidos con este marcador.

Los fragmentos COL2-3/4 y COL2-1/4 tienen aproximadamente 75 kDa y 25 kDa respectivamente (Billinghurst et al., 1997). Fragmentos más pequeños de colágeno tipo II, generados mediante un proceso proteolítico adicional, pueden filtrar más fácilmente dentro de los fluidos corporales, especialmente la filtración renal y la subsidiaria detección en la orina requiere fragmentos muy pequeños. Fragmentos más pequeños podrían proporcionar una concentración más alta y facilitar su detección. La patente US 6132976 describe la detección de fragmentos de colágeno tipo II en el fluido sinovial y el suero, utilizando un epitopo localizado dentro del fragmento COL2-3/4, sin embargo no se ha determinado si el fragmento es el COL2-3/4 intacto o fragmentos escindidos por la proteinasa.

Los fragmentos generados por la región telopeptídica (patente US 5641837, patente US 5919634, US 6342361) filtran por lo tanto más fácilmente en los fluidos corporales, sin embargo, estos fragmentos no se generan como resultado de la actividad de la colagenasa, lo cual se cree que es responsable de la degradación inicial del colágeno observada en las enfermedades de las articulaciones (Billinghurst et al., 1997).

Se ha informado también de la detección de otros metabolitos derivados del cartílago, tales como la piridinolina urinaria libre, proteína de la matriz oligomérica del cartílago (COMP), hialuronatos, "aggrecan" y fragmentos de colágeno tipo III, producidos a partir de la destrucción de los tejidos de la articulación afectada por una enfermedad inflamatoria (Furumitsu et al., 2000, Moller 1998, Wollheim 1996), y solicitud PCT de patente WO 01/38872). La utilidad clínica de estos marcadores, sin embargo, permanece sin probar.

Un creciente conocimiento de los cambios tempranos bioquímicos y estructurales en enfermedades relacionadas con el cartílago, en combinación con la introducción de nuevos agentes supresores de la enfermedad, ha creado la necesidad de desarrollar mejores métodos de diagnóstico para dictaminar la gravedad y prognosis de la enfermedad. Por lo tanto, es evidente la necesidad de marcadores sensibles, simples y fidedignos para la degradación del cartílago, que satisfagan el importante propósito clínico de gestionar las enfermedades artríticas.

Un objeto de la presente invención es el de mejorar los métodos de diagnóstico para los procesos degenerativos del cartílago, y proporcionar los medios para monitorizar los efectos de las medidas terapéuticas tomadas frente a tales enfermedades.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para la detección y/o la monitorización de la degradación del cartílago. El método permite dicha detección mediante la medición en una muestra biológica de un fragmento de colágeno tipo II, en donde está contenida toda o una parte importante de la secuencia de aminoácidos HRGYPGLDG.

El método de la presente invención permitirá la monitorización de un proceso catabólico de un tejido de una articulación así como también en placas de crecimiento y discos intervertebrales, detectando la degradación del cartílago. Esto proporcionará medios para el diagnóstico, monitorizando la actividad de la enfermedad, la progresión de la enfermedad, y la eficacia del tratamiento.

De esta forma, la presente invención proporciona un método para el ensayo cualitativo o cuantitativo del colágeno tipo II ó fragmentos del mismo en una muestra biológica que comprende la puesta en contacto de dichos fragmentos con un socio de unión inmunológica el cual es inmunoreactivo con un epitopo comprendido en la secuencia de aminoácidos HRGYPGLDG y la detección de la inmunoreacción resultante.

La detección efectuada por el método de la presente invención puede efectuarse mediante un inmunoensayo utilizando un anticuerpo, el cual reconoce un epitopo dentro de la secuencia HRGYPGLDG derivada del colágeno tipo II, ó que consiste en dicha secuencia completa. Para asegurar la monitorización de la degradación del colágeno tipo II, una versión preferida proporciona un anticuerpo del cual reconoce solamente la forma no enrollada del epitopo, y no la forma enrollada.

La invención incluye también una línea celular para la producción de anticuerpos monoclonales que reconocen un epitopo comprendido en la secuencia HRGYPGLDG derivada del colágeno tipo II.

Para emplear la presente invención, se proporciona un kit que utiliza un anticuerpo, el cual reconoce un epitopo comprendido en la secuencia HRGYPGLDG derivada del colágeno tipo II, juntamente con un sistema de detección adecuado. Suplementos a dicho kit, son un segundo anticuerpo y un péptido sintético parecidos al epitopo. Para la detección, estos suplementos pueden marcarse. El kit de la presente invención puede aplicarse a muestras como los fluidos corporales de mamíferos, extractos de células o tejidos o sobrenadantes de células o tejidos cultivados in vitro.

La presente invención se refiere a métodos y técnicas para la determinación o cuantificación del catabolismo del cartílago, basados en la detección o cuantificación de los metabolitos característicos del colágeno tipo II, especialmente los fluidos corporales como la orina o el suero.

Como se emplea en la presente, "socio de unión inmunológica" incluye los anticuerpos policlonales, monoclonales o humanizados, que incluyen fragmentos Fc, fragmentos Fab, anticuerpos quiméricos u otros fragmentos de anticuerpos específicos para los antígenos.

Como se emplea en la presente, la expresión "cadena de colágeno del tipo II", significa un polipéptido individual de colágeno del tipo II codificado por el gen Col-II-A1.

Como se emplea en la presente, la expresión "colágeno del tipo II/colágeno maduro del tipo II", incluye tres cadenas de colágeno del tipo II organizadas en una molécula de colágeno del tipo II. En la molécula de colágeno del tipo II, las cadenas están enrolladas en una estructura helicoidal triple, y se eliminan los propéptidos en cualquiera de los dos extremos dejando cortas secuencias de telopéptidos en los extremos terminales N y C de la triple hélice.

Como se emplea en la presente, la expresión "fibrillas de colágeno del tipo II" significa colágeno maduro del tipo II, organizado en un conjunto escalonado de fibras, en donde las moléculas individuales de colágeno del tipo II han sido reticuladas covalentemente implicando radicales característicos de lisina e histidina dentro del helicoide triple así como también regiones de telopéptidos y empaquetadas juntamente lado con lado.

Como se emplea en la presente, la expresión "fibras de colágeno del tipo II" significa una agregación de fibrillas en haces organizados dentro de la matriz extracelular del cartílago.

Como se emplea en la presente, la expresión "fragmentos de colágeno del tipo II", incluye un polipéptido, la estructura de un dominio, un péptido, o de otra forma un fragmento de proteína procesado proteolíticamente a partir de una molécula madura de colágeno del tipo II de mamífero. El fragmento de colágeno del tipo II preferido es un polipéptido o un péptido sin enrollar.

Como se emplea en la presente, la expresión "colágeno del tipo II enrollado", significa colágeno del tipo II maduro, en donde las tres cadenas del colágeno tipo II están organizadas en la auténtica estructura de triple hélice.

Como se emplea en la presente, la expresión "colágeno del tipo II sin enrollar", significa colágeno maduro del tipo II, en donde las tres cadenas de colágeno del tipo II no son más largas en la auténtica estructura de triple hélice, pero están desmontadas o parcialmente desmontadas en cadenas individuales de polipéptido.

En una versión de la presente invención, los fragmentos de colágeno del tipo II que contienen toda o una parte importante de la siguiente secuencia HRGYPGLDG, se detectan en una muestra biológica para permitir la detección y monitorización de la degradación del cartílago. La detección de dichos fragmentos de colágeno del tipo II puede efectuarse por ejemplo, empleando la HPLC, espectroscopia de masas, secuenciado, o inmunoensayos. La secuencia HRGYPGLDG es única para la cadena de colágeno del tipo II y está localizada en la parte helicoidal del colágeno tipo II (posición 289-227 de la isoforma 1 del registro nº NP_001835 del banco de genes, y la posición 220-228 de la isoforma 2 del registro nº NP_149162 del banco de genes).

Los fragmentos de colágeno del tipo II que contienen el epitopo de la secuencia HRGYPGLDG varían en tamaño por debajo de los 80 kDa. Fragmentos más pequeños que pueden ser excretados en la orina, se detectan en una versión de la presente invención. Estos fragmentos pueden ser más pequeños de 30 kDa ó incluso con más preferencia, más pequeños de 10 kDa.

Un método preferido de detección es el empleo de un inmunoensayo, utilizando un anticuerpo, el cual se une a un epitopo sobre el colágeno tipo II ó fragmentos del mismo conteniendo un epitopo dentro de la siguiente secuencia HRGYPGLDG. Las formadas de ensayo en el cual puede aplicarse dicho anticuerpo incluyen, pero no están limitadas a, ELISA, "microarray", RIA, FACS, Western blotting, cromatografía, e histoquímica.

En una versión de la presente invención, la muestra biológica medida es un fluido biológico corporal, como por ejemplo, sin estar limitado a, muestras de sangre, suero, fluido sinovial u orina. El fluido biológico puede emplearse tal cual es, o puede purificarse previamente al paso de puesta en contacto. Este paso de purificación puede efectuarse empleando varios procedimientos estándar, incluyendo, sin limitar a, adsorción y elución con cartuchos, cromatografía de tamices moleculares, diálisis, intercambio iónico, cromatografía de alúmina, cromatografía de hidroxiapatita y combinaciones de los mismos.

En otra versión, la invención proporciona un método para la detección de la cantidad de fragmentos derivados del colágeno tipo II que contiene el epitopo HRGYPGLDG en la orina o suero. Una muestra de orina se pone en contacto con un anticuerpo específico contra un epitopo dentro de la secuencia de aminoácidos HRGYPGLDG, esencialmente todos los fragmentos de colágeno del tipo II en la orina, que contienen este epitopo se unirán a dicho anticuerpo. La cantidad de fragmentos unidos mediante el anticuerpo será detectado mediante métodos ya bien conocidos en la técnica.

Típicamente, el epitopo unido por los anticuerpos, reactivo con HRGYPGLDG, puede comprender cinco o más aminoácidos, por ejemplo los primeros cinco aminoácidos de la secuencia.

En una versión preferida para la medición de la degradación del cartílago, el anticuerpo utilizado para la detección reconoce solamente la forma no enrollada del colágeno tipo II ó fragmentos del mismo, y no la forma enrollada. Será posible por ejemplo, en tejidos o muestras de fluido sinovial, acceder a un ratio entre el colágeno tipo II ó fragmentos del mismo sin enrollar y enrollado, lo cual puede relacionarse con la actividad de la colagenasa en la articulación de la cual se ha extraído la muestra. Dominios de colágeno helicoidal desnaturalizados pueden ser retenidos en el tejido por un empaquetado reticular y fibrilar. Esto puede complicar la detección de acuerdo con la presente invención en las muestras de tejido de cartílago. Para solucionar este problema, la muestra biológica debe ser puesta en contacto en primer lugar con una enzima que tenga la capacidad de escindir selectivamente el colágeno sin enrollar, sin escindir el epitopo HRGYPGLDG. Estas enzimas pueden ser, sin estar limitadas a, tripsina o quimotripsina, las cuales son incapaces de escindir el colágeno enrollado. Los fragmentos de colágeno sin enrollar se extraen a continuación de la muestra biológica para producir un extracto de fragmentos de colágeno sin enrollar. Este extracto puede a continuación ensayarse como se ha mencionado más arriba.

El método de la presente invención se emplea de preferencia para detectar o monitorizar procesos catabólicos en el tejido de la articulación, placas de crecimiento o discos intervertebrales. Los trastornos asociados con estos procesos catabólicos del tejido del cartílago son, por ejemplo, diferentes formas de artritis, tales como la artritis reumatoide (RA), artritis de la psoriasis, osteoartritis (OA), artritis yersinia, artritis de pirofosfato, gota (artritis úrica), artritis séptica o disco vertebral, trastornos relacionados, pero no limitados a, enfermedades degenerativas de los discos o espondilitis anquilosante. Trastornos de la placa de crecimiento son el Kashin-Bech, la acromegalia y el enanismo.

Los anticuerpos con propiedades como las anteriormente descritas, están dirigidos contra un péptido sintético que constituye la secuencia HRGYPGLDG u otro fragmento de proteína o péptido adecuado que contiene esta secuencia o por lo menos una secuencia epitópica de la misma. Dicho anti-cuerpo posee una reactividad contra la proteína del colágeno de tipo II ó fragmentos de la misma a partir de cualquier especie que contenga este epitopo, como por ejemplo la vaca, el perro, el ratón, el ser humano, el caballo y la rata. El péptido se emplea como un antígeno para la inmunización. El péptido se emulsiona en un medio coadyuvante, de preferencia el coadyuvante de Freund incompleto, y se inyecta subcutáneamente o en la cavidad peritoneal de un anfitrión mamífero, de preferencia un roedor, con más preferencia conejos, con todavía más preferencia, ratones. Para potenciar las propiedades inmunogénicas del péptido antigénico, éste puede copularse a una proteína de soporte antes de ser emulsionado en un medio coadyuvante. Los soportes útiles son proteínas como la hemocianina del molusco limpet keyhole (KLH), edestina, albúmina es como por ejemplo la albúmina de suero bovino o humano (BSA o HSA), toxoide del tétanos, y toxoide del cólera, poliaminoácidos tales como por ejemplo el ácido poli-(D-lisina-D-glutámico). Pueden darse inyecciones de refuerzo a intervalos regulares hasta que se obtiene una respuesta inmunológica, la última inyección puede darse por vía intravenosa para asegurar el máximo de estimulación de la célula B.

Los antisueros se someten a screening para seleccionar su capacidad de unión al epitopo dentro de la secuencia HRGYPGLDG. Se dictamina su especificidad entre el colágeno tipo II sin enrollar y enrollado, o fragmentos del mismo, así como también su reactividad cruzada con otros colágenos. Los antisueros de los anfitriones seleccionados con mayores probabilidades pueden ser empleados en su forma cruda o purificada.

Los anticuerpos monoclonales puede generarse a partir de ratones inmunizados con los títulos de anticuerpos con más probabilidades, fusionando los linfocitos aislados del bazo de estos ratones con una línea celular de mieloma. Los clones del hibridoma generado se someten a screening para seleccionar los anticuerpos con reactividad contra el epitopo dentro de la secuencia HRGYPGLDG, y pueden establecerse líneas celulares para la producción y purificación de los anticuerpos monoclonales.

Los métodos para la producción y screening de anticuerpos policlonales y monoclonales son ya bien conocidos en la técnica, y pueden también emplearse otros métodos distintos a los descritos.

Una versión de la presente invención constituye el desarrollo de un kit de diagnóstico para emplear en la detección y/o monitorización de la degradación del cartílago. Esto incluye un anticuerpo que reconoce un epitopo comprendido en la siguiente secuencia HRGYPGLDG, localizada en el colágeno de tipo II ó fragmentos del mismo, de preferencia el anticuerpo reconoce el colágeno tipo II sin enrollar y no reconoce la forma enrollada. Los más preferidos son los anticuerpos de la presente invención, bien sea solos, o bien con un segundo anticuerpo con especificidad hacia el primer anticuerpo u otra parte del epitopo que contiene el fragmento. El kit puede ser aplicado en fluidos corporales de mamíferos o extractos de células o tejidos, de preferencia derivados de seres humanos. Para las detecciones de competición un péptido entre 6 y 20 aminoácidos, en el cual una sucesión de aminoácidos es equivalente al epitopo de unión para uno de dichos anticuerpos, podría ser suministrado bien en una forma marcada o bien en una forma sin marcar. Los anticuerpos pueden marcarse uniéndolos bien sea covalentemente o bien no covalentemente, con una molécula informadora. Moléculas informadoras o marcas adecuadas, que pueden emplearse para facilitar la detección, incluyen los radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, y quimioluminiscentes o cromogénicos, así como también, substratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares. Uno de los anticuerpos no marcados o un péptido del kit podría ser inmovilizado, de preferencia sobre una superficie sólida como por ejemplo una placa de microtitulación, posiblemente mediante conjugación a un soporte de proteína adecuado como la BSA.

La invención puede describirse e ilustrarse además, con referencia a los dibujos anexos, en los cuales:

La figura 1 muestra una curva estándar para el inmunoensayo del colágeno tipo II en una gráfica semilogarítmica. La concentración de antígeno libre está expresada en nM. B/Bo representa el ratio entre el anticuerpo unido al antígeno recubierto en presencia de antígeno libre (B), y en ausencia de antígeno libre (Bo), y se expresa en tantos por ciento;

La figura 2 muestra la inhibición competitiva del antisuero coll2-1 D3 unido con las placas de HRGYPGLDG recubiertas, empleando el HRGYPGLDG (\bullet), colágeno nativo tipo II (\blacksquare), colágeno del tipo I (\ding{115}), y BSA (\blacklozenge) como competidores. B/Bo representa el ratio entre el anticuerpo unido al antígeno recubierto en presencia del antígeno competidor (B) ó en ausencia del antígeno competidor (Bo) y está expresado en tantos por ciento;

La figura 3 muestra la capacidad del antisuero Coll 2-1 D3 de unir el colágeno tipo II dentro del cartílago (3 g/10 ml) en relación con la duración del tratamiento de la colagenaza A (0,5 mg/ml);

La figura 4 muestra los resultados del ejemplo 5 e ilustra la variación fisiológica de los niveles de Coll2-1 en la orina de acuerdo con el margen de edad y sexo (hombres, puntos negros, mujeres, puntos blancos);

la figura 5 muestra los resultados obtenidos en el ejemplo 6 y demuestra que los pacientes OA tienen niveles más elevados de Coll2-1 que los pacientes RA e individuos de control;

la figura 6 muestra los resultados obtenidos en el ejemplo 7 demostrando que los explantes de cartílago articular humano producen Coll2-1 in vitro; y

la figura 7, muestra los resultados obtenidos en el ejemplo 8 que proporciona una determinación de la reactividad cruzada del anticuerpo anti-coll2-1.

Ejemplos Ejemplo 1 Inmunoensayo del colágeno tipo II Antisueros

Una secuencia de nueve aminoácidos (His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly) derivada de la región helicoidal triple del tipo colágeno II [(\alpha1)II], se sintetizó empleando la síntesis de péptidos en fase sólida de Fmoc estándar (protocolo HBTU/HOBt) (Chan & White, 2000).

La secuencia de aminoácidos se conjugó con la tiroglobulina mediante un procedimiento con carbodiimida (Soinila et al., 1992).

Se inyectaron conejos intraperitonealmente con 1 ml del conjugado emulsionado en coadyuvante de Freund completo. El conjugado y el coadyuvante se mezclaron en volúmenes iguales. Se repitieron las inyecciones cuatro veces cada mes con una cantidad similar de conjugado en coadyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la última inyección, los conejos fueron sacrificados para el sangrado final. La sangre se recogió y se centrifugó durante 10 minutos a 1500 x g a 4ºC. Los sobrenadantes se guardaron a -20ºC.

Se obtuvieron cinco antisueros, identificados como Coll2-1 D1, D2, D3, D4 y D5, y se ensayó su especificidad con los inhibidores competitivos HRGYPGLDG, colágeno del tipo II, colágeno del tipo I, y BSA.

ELISA competitivo

Se efectuó un inmunoensayo competitivo para cuantificar los productos de rotura del colágeno tipo II que contienen la siguiente secuencia HRGYPGLDG. Los péptidos HRGYPGLDG sintéticos fueron conjugados con BSA mediante BS^{3} [suberato de bis(sulfosuccininimidilo), Pierce, Rockford, USA]. Los péptidos conjugados se recubrieron en placas de microtitulación (NUNC, Dinamarca) a 50 ng/ml en 0,08 M de NaHCO_{3}, pH 9,6 durante por lo menos 48 horas a 4ºC. Las placas de microtitulación recubiertas fueron saturadas con 400 \mul/pocillo de tampón de saturación (1,5 mM de KH_{2}PO_{4}, 8 mM de Na_{2}HPO_{4}, 2 mM de KCl, 138 mM de NaCl, 0,5% de BSA, 5,3% de monohidrato de lactosa, pH 7,2) durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se pipetearon cincuenta \mul de, o bien controles calibradores (para generar una curva estándar), o bien, muestras desconocidas, diluidas en Ultroser G (Gibco), en pocillos apropiados en la placa de microtitulación, seguido por 100 \mul de antisuero (ver más arriba) diluido 1/40000. Se mezclaron las muestras mediante rotación de la placa y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados sucesivos con tampón de lavado (25 mM de Tris, 50 mM de NaCl, pH 7,3), se añadieron 100 \mul de peroxidasa de rábano silvestre conjugados con anticuerpos de cabra, a IgG de conejo (Biosource, Bélgica) en cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de otro paso de lavado se añadieron 100 \mul de substrato de enzima recién preparado (TMB, Biosource, Bélgica), a cada pocillo. Después de 15 minutos de incubación, la reacción se interrumpió con 100 \mul de H_{3}PO_{4} 4M. Se efectuó la lectura de la absorbancia con un lector de microplacas (Labsystem iEMS Reader MF, Finlandia), a 450 nm, y se corrigió con la absorbancia a 620 nm. Se construyó una curva estándar en una gráfica log-lineal señalizando en la gráfica el B/Bo de 6 calibradores (2000 a 10 nM) (figura 1). La concentración de péptidos que contenían HRGYPGLDG en las muestras y controles desconocidos, se determinó mediante la interpolación de la curva de calibración.

Ejemplo 2 Caracterización de los antisueros Col12-1 D1-5 Especificidad

Los antisueros producidos, se ensayaron para determinar su especificidad para HRGYPGLDG, empleando el inmunoensayo descrito en el ejemplo 1. Para ensayar la especificidad del péptido HRGYPGLDG, se añadió colágeno tipo II, colágeno tipo I, ó BSA, en concentraciones crecientes.

El colágeno tipo II nativo, el colágeno tipo I, y la BSA, no fueron capaces de competir con el péptido recubierto HRGYPGLDG en las concentraciones aplicadas, mostrado para Coll2-1 D3 en la figura 2.

Los siguientes experimentos se efectuaron utilizando el antisuero Coll2-1 D3.

Límite de detección

El límite de detección del ensayo descrito en el ejemplo 1, se calcula como el valor Bo medio (M) de 21 determinaciones del estándar A menos 3 veces la derivación estándar (SD) de Bo (M_{A}-3*SD_{A}). Para Coll2-1 D3 el límite de detección fue de 17 nM.

Coeficientes de variación

Se ensayó el suero de tres pacientes con OA, los cuales eran candidatos para una prótesis de cadera o rodilla, para determinar el colágeno tipo II conteniendo HRGYPGLDG ó fragmentos del mismo. Los ensayos fueron repetidos 10 veces para dictaminar el coeficiente de variación del intra-ensayo. Los cálculos de la CV se efectuaron como sigue:

(SD/concentración media) * 100%.

1 Intraensayo

2 Concentración

3 Paciente

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Ensayo de dilución

Se diluyeron muestras de suero humano para asegurar que sus curvas de dilución fueran paralelas a la curva estándar.

1 dilución del suero

2 concentración medida

3 concentración esperada

4 recuperación

5 sin diluir

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Recuperación analítica

Una muestra de suero se trató con concentraciones conocidas del péptido HRGYPGLDG sintético, para asegurar que su presencia no afectaría la recuperación del colágeno tipo II ó fragmentos del mismo presentes en la muestra de suero.

1 Concentración del péptido añadido

2 Concentración medida

3 Concentración esperada

4 Recuperación

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Ejemplo 3 El antisuero Coll2-1 D3 reconoce el colágeno tipo II sin enrollar pero no el tipo enrollado

Como ya se ha mostrado en el ensayo de especificidad del ejemplo 2, el Coll2-1 D3 no se une al colágeno tipo II nativo (enrollado), dado que éste no es capaz de competir con la unión antisuero con el péptido HRGYPGLDG recubierto. En el siguiente ejemplo, la digestión del cartílago con la colagenasa A del Clostridium histolyticum, se empleó para dictaminar la capacidad del Coll2-1 D3 para unirse con el colágeno tipo II sin enrollar, comparado con el colágeno tipo II enrollado (figura 3).

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Digestión de la colagenasa

Se cultiva cartílago obtenido de la cirugía de individuos sanos, en cápsulas de Petri, a 3 g / 10 ml de medio (DMEM GIBCO exento de suero) a 37ºC y 5% de CO_{2}. La degradación del cartílago se inicia en el momento 0 mediante la adición de 0,5 mg/ml de colagenasa A de Clostridium histolyticum. En los momentos 1, 2, 3, 4, 6, 30 y 80 horas, se retiraron 100 \mul de medio, se centrifugó a 5000 x g y se sometió al inmunoensayo descrito en el ejemplo 1.

Se observa en la figura 3, que el colágeno se vuelve detectable en el ensayo con el curso del tiempo, lo cual indica que la forma no enrollada, pero no la forma enrollada, es reactiva con el anticuerpo.

Ejemplo 4 Detección de la degradación del colágeno tipo II en pacientes con OA, que eran candidatos a prótesis de cadera o rodilla, frente a individuos jóvenes sanos

Se recogieron sueros de voluntarios sanos y de pacientes, y se sometieron al ensayo descrito en el ejemplo 1, utilizando antisuero Coll2-1 D3. La concentración en nM de HRGYPGLDG conteniendo colágeno tipo II ó fragmentos del mismo fue como sigue:

1 sanos

2 pacientes de OA

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Ejemplo 5 Niveles fisiológicos de Coll 2-1 en hombres y mujeres sanos

Para establecer valores de referencia para Coll 2-1, se recogieron sueros de 242 sujetos ambulantes sanos atendidos en un centro de donación de sangre en Liège, Bélgica. Ninguno de los sujetos de estudio tenía ninguna evidencia de artritis u otra enfermedad inflamatoria. Ninguno tomaba corrientemente ninguna medicación conocida para modificar la enfermedad artrítica o influenciar el metabolismo de la articulación. Este grupo estaba compuesto de 170 hombres y 72 mujeres, de edades comprendidas entre 20 y 65 años (media: 42,8 \pm 1,4 años), la edad media de las mujeres era de 42,7 \pm 1,0 años, y la edad media de los hombres, de 42,8 \pm 1,4 años.

Cuando la población se estratificó por la edad en estratos de 5 años, los niveles de suero Coll 2-1 fueron más bajos en los individuos más jóvenes que en los más viejos (figura 4). La comparación de los niveles de péptidos por sexos, mostró que después de los 45 años de edad, la concentración de Coll 2-1 era más alta en las mujeres que en los hombres, pero que la diferencia no representaba ninguna importancia estadística. Sin embargo, cuando se eliminaron los sujetos entre 46 y 55 años correspondientes a las mujeres post menopáusicas tempranas, los niveles de Coll 2-1 fueron mayores en las mujeres pre menopáusicas que en las mujeres post menopáusicas.

El nivel de los fragmentos de Coll2-1, cae para ambos sexos a la edad de 20-26 y a continuación asciende de nuevo gradualmente desde la edad de 26 hasta después de la menopausia para el grupo femenino, mientras que los varones mostraron un nivel de Coll2-1 más estable a lo largo de toda su vida (figura 4).

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Ejemplo 6 Los pacientes de OA tienen niveles de Coll2-1 más altos que los pacientes de RA, ó que los individuos normales

Un importante dato clínico es si los niveles del marcador Col2-1 son altos en la artritis. Para efectuar el estudio, se obtuvieron muestras de suero de un panel de sección cruzada de pacientes de artritis que comprendía 10 pacientes de OA (4 mujeres y 6 hombres de edad superior a los 45 años), los cuales eran candidatos a la artroscopia. La artroscopia se efectuó para el diagnóstico y/o afeitado del menisco y lesiones del cartílago. Los sueros fueron recogidos 24 horas antes de la cirugía. Estos individuos no tenían signos radiológicos de OA, pero todos tenían lesiones del cartílago identificadas mediante la artroscopia. Todos los individuos tenían una leucocitosis normal y un nivel inferior a 5 mg/litro de proteína C-reactiva (CRP). Además, estos pacientes no habían tomado ningún fármaco no esteroidal anti-inflamatorio durante el año anterior a la intervención.

Se midió también la concentración de Coll 2-1 en las muestras de suero de 14 pacientes con RA temprana. En el momento del muestreo, estos pacientes no habían recibido ninguna medicación y todos tenían un nivel de proteína C-reactiva por encima de los 5 mg/litro.

Un grupo de control representando los individuos normales mostró un nivel más bajo de fragmento Coll2-1, comparado con pacientes RA y pacientes OA (figura Y+1). Los niveles más altos de Coll2-1 se encontraron en los pacientes de OA comparados con los pacientes de RA ó los controles. Estos resultados permiten con este ensayo distinguir entre individuos normales, pacientes de OA y pacientes de RA como se muestra en la figura 5.

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Ejemplo 7 Explantes de cartílago articular humano producen Coll2-1 in vitro

Los explantes de cartílago articular permiten también el estudio de la liberación de Coll2-1 en el medio condicionado y mediante la progresión de la degradación del cartílago de acuerdo con los factores ambientales tales como por ejemplo la concentración de citocinas. El cartílago articular se obtiene de pacientes humanos adultos sometidos a cirugía de substitución de la articulación, y el cartílago se extirpó, o bien como tacos cilíndricos (5-30 mg), o como lonjas (20-30 mg). Los explantes fueron cultivados en placas de 96 pocillos en 200 ml de medio DMEM exento de suero, (figura 6, barra a mano izquierda) o en presencia de IL-1\alpha 5 ng/ml humana recombinante (Sigma, St. Louis, USA), Oncostatin M 50 ng/ml (Sigma, St. Louis, USA) y plasminógeno humano 10 \mug/ml (Sigma, St. Louis, USA) (figura 6, barra central). El plasminógeno es un activador MMP fisiológico que induce la degradación del colágeno tipo II. Además, se añadió el activador MMP, APMA (aminofenil acetato mercúrico, SIGMA, St. Louis, USA) con los resultados indicados en la figura 6, barra a mano derecha. El medio condicionado se retiró en diferentes momentos para efectuar la medición del Coll2-1. Este ejemplo muestra cómo las citocinas IL1 y la oncostatina (OSM) influencian la liberación del Coll2-1 en el medio condicionado de los explantes de cartílago. La adición de las citocinas catabólicas IL1 y oncostatina (OSM) influencian la liberación de Coll2-1 en el medio condicionado de los explantes de cartílago. El IL1 sólo, la oncostatina y el plasminógeno no tuvieron ninguna influencia sobre la degradación del cartílago. Sin embargo, pudo detectarse un nivel importante de Coll2-1 en el medio condicionado de los explantes de cartílago cuando el activador plasminógeno APMA fue también añadido al medio. Esto relaciona el marcador Col2-1 directamente con los procesos catabólicos del cartílago articular y demuestra que el marcador es liberado juntamente con la actividad colagenolítica.

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Ejemplo 8 Desarrollo de un ensayo específico para un epitopo de colágeno tipo II derivado de la región \alpha-helicoidal (Coll2-1 ELISA) Reactivos y tampones para los inmunoensayos

El tampón de recubrimiento fue el NaHCO_{3} 0,08 M, pH 9,6. El tampón de saturación estaba compuesto de 1,5 mM de KH_{2}PO_{4}, 8mM de Na_{2}HPO_{4}, 2mM de KCl, 138 mM de NaCl, 5 g/litro de albúmina de suero bovino (BSA), 53 g/litro de lactosa monohidrato, pH 7,2. El tampón de lavado fue una solución de 25 mM de Tris, 50 mM de NaCl, pH 7,3. La curva estándar y la dilución de muestras, cuando fueron necesarias, fueron realizadas en 10 mM de tampón salino de fosfato, 138 mM de NaCl, 7 g/litro de BSA, 1 ml/litro de Tween 20, pH 7,0. Las diluciones de los antisueros y del segundo anticuerpo se hicieron en 10 mM de tampón salino de fosfato, 138 mM de NaCl, 2 g/litro de BSA, 1 ml/litro de Tween 20, pH 7,0.

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Inmunización

Se inyectaron conejos intraperitonealmente con 1 ml de los péptidos conjugados (0,5 mg/ml) emulsionados en coadyuvante de Freund completo. El conjugado y el coadyuvante se mezclaron en volúmenes iguales. Las inyecciones se repitieron cuatro veces cada mes empleando la misma concentración de péptido que en la primera inyección, en coadyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la última inyección, se sacrificaron los conejos. Se recogió la sangre y se centrifugó durante 10 minutos a 2500 rpm a 4ºC. El sobrenadante se guardó y se almacenó a -20ºC. En cada sangrado, los antisueros se sometieron a screening mediante un experimento de titulación para determinar la presencia del anticuerpo anti-HRGYPGLDG. Los antisueros con los títulos más altos fueron seleccionados para los siguientes experimentos.

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Especificidad del antisuero

Se investigó la especificidad de los dos antisueros seleccionados (D3) mediante un procedimiento de inhibiciones competitivas. Se emplearon como competidores el Coll 2-1, Coll 2-1 NO_{2}, colágeno nativo tipo II, colágeno tipo II nitrado, colágeno tipo II desnaturalizado por calor (obtenido calentando una solución de colágeno nativo humano tipo II a 100ºC durante 30 minutos), colágeno nativo tipo I, colágeno tipo I nitrado, BSA, BSA nitrado, y el radical L-3-nitro-tirosina. Dicho brevemente, las inmunoplacas se recubrieron durante la noche a 4ºC con 100 \mul del antígeno (Coll 2-1) conjugado a la BSA mediante BS^{3} (40 ng/100 \mul). Después del lavado, las placas fueron bloqueadas con 400 \mul de tampón de saturación a temperatura ambiente. Cincuenta \mul de tampón con o sin los diferentes competidores a concentraciones crecientes (de 10^{-4} a 10^{-11} moles/litro) y 100 \mul de antisuero diluido para obtener 1,5 de D.O., se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las microplacas, se añadieron 100 \mul de un anticuerpo de cabra conjugado a la peroxidasa de rábano silvestre (Biosource, Bélgica), diluido a 1/5.000, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron 100 \mul de substrato de enzima recién preparado (TMB, Biosource, Bélgica), a cada pocillo. La reacción se interrumpió con 100 \mul de H_{3}PO_{4} 4M. La coloración se leyó a 450 nm, y se corrigió con la absorbancia a 650 nm.

Como se observa en la figura 7, el D3 no reconoce el colágeno nativo tipo II, ni el colágeno tipo II desnaturalizado, ni el colágeno tipo I, ni la BSA. Estos resultados sugieren que el D3 es altamente específico para la forma lineal de Coll2-1. Además, su no afinidad para el colágeno tipo II nativo y calentado, sugiere también que el reconocimiento de la secuencia depende en gran manera del hecho de que los fragmentos del colágeno tipo II están liberados. El epitopo podría esconderse en el colágeno enrollado, incluso después de calentar.

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Referencias

1 Escisión potenciada del colágeno tipo II, por la colagenasa en el cartílago articular osteoartrítico

2 Síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc: un método práctico, departamento de prensa de la Universidad de Oxford

3 Detección diferencial del colágeno tipo II, N-terminal y C-terminal, epitopos de desnaturalización en el cartílago de degradación

4 Niveles de suero y reticulaciones de piridinio del fluido sinovial en pacientes con artritis reumatoide

5 Aumento de las lesiones del colágeno tipo II en el cartílago articular osteoartrítico, detectado por un nuevo inmunoensayo

6 Marcadores del tejido conjuntivo de la artritis reumatoide.

7 Ensayo de proteínas y fragmentos de proteína isomerizados y/o ópticamente invertidos

8 Inmunohistoquímica de las encefalinas: estudios modelo sobre conjugados de un soporte de hapteno, y métodos de fijación

9 Método de detección de la degradación del colágeno in vivo

10 Métodos de detección de la degradación del colágeno tipo II in vivo

11 Inmunoensayo para la medición de la desnaturalización del colágeno y escisión en el cartílago

12 Método de ensayo de fragmentos de colágeno en los fluidos corporales. Un kit de ensayo y medios para llevarlo a cabo

13 Pronosticador de una lesión articular en la artritis reumatoide.

Claims

1. Un método de ensayo cualitativo o cuantitativo, del colágeno tipo II ó fragmentos del mismo en una muestra biológica, el cual método comprende la puesta en contacto de dichos fragmentos con un socio de unión inmunológico el cual es inmunoreactivo con un epitopo comprendido en la secuencia de aminoácidos HRGYPGLDG, y detección de la inmunoreacción resultante.

2. Un método como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde dicho epitopo consta de cinco o más aminoácidos en dicha secuencia.

3. Un método como se ha reivindicado en la reivindicación 1 ó en la reivindicación 2, en donde dicho socio de unión inmunológica es reactivo con dicho epitopo en el contexto del colágeno tipo II sin enrollar o fragmentos del mismo, pero no en el contexto de la forma enrollada del colágeno tipo II.

4. Un método como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la inmunoreacción detectada está entre dicho socio de unión inmunológica y los fragmentos de colágeno tipo II, de menos de 80 kDa.

5. Un método como se ha reivindicado en la reivindicación 4, en donde dichos fragmentos tienen menos de 30 kDa.

6. Un método como se ha reivindicado en la reivindicación 4, en donde dichos fragmentos tienen menos de 10 kDa.

7. Un método como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha muestra es un fluido biológico.

8. Un método como se ha reivindicado en la reivindicación 7, en donde dicho fluido biológico es el suero, orina, fluido lacrimal, fluido sinovial, fluido subcutáneo intersticial, un fluido sobrenadante de un cultivo celular o un extracto de células.

9. Un método como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha inmunoreacción detectada es indicativa de la degradación del cartílago.

10. Un socio de unión inmunológica, la cual reconoce un epitopo derivado del colágeno tipo II, el cual está comprendido en la secuencia de aminoácidos HRGYPGLDG.

11. Un socio de unión como se ha reivindicado en la reivindicación 10, el cual es reactivo con dicho epitopo en el contexto del colágeno tipo II sin enrollar, o fragmentos del mismo, pero no en el contexto de la forma enrollada del colágeno tipo II.

12. Una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal, el cual es un socio de unión inmunológica como se ha reivindicado en la reivindicación 10 ó la reivindicación 11.

13. Un kit para efectuar un ensayo como se ha reivindicado en la reivindicación 1, el cual comprende: un socio de unión inmunológica el cual es inmunoreactivo con un epitopo comprendido en la secuencia de aminoácidos HRGYPGLDG; y medios para la detección de la inmunoreacción entre dicho socio de unión inmunológica y una muestra.

14. Un kit como se ha reivindicado en la reivindicación 13, en donde dicho socio de unión inmunológica lleva una marca detectable o está inmovilizado en un material sólido.

15. Un kit como se ha reivindicado en la reivindicación 13 ó la reivindicación 14, en donde dicho kit comprende un péptido que comprende dicho epitopo y compite con el colágeno tipo II, ó fragmentos del mismo, para la unión a dicho socio de unión inmunológica.

16. Un kit como se ha reivindicado en la reivindicación 15, en donde dicho péptido lleva una marca detectable o está inmovilizado en una superficie sólida.