JP5683816B2 - Ix型コラーゲン破壊の診断 - Google Patents
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Description
ウシのアミノ酸配列
この研究における質量分析に適合したウシ(IX型)コラーゲンα1のアミノ酸配列は、「国立生物工学情報センター」(www.ncbi.nlm.nih.gov)の非冗長(nr)データベースにおいて、gi|119901059(22−Dec−06)という名前で見ることができる。ヒト(IX型)α1配列(SwissProt P20849(http://www.expasy.ch/sprot/)との、NCBIから得たこの配列のアラインメントにより、N末端及びC末端の主な相違が明らかになる(付録1)。ウシ配列のN末端部分はヒト配列よりも332アミノ酸長い。この研究において、全ての質量分析データはこの「付加的な」配列のいずれの部分にも適合しなかった。ウシの配列は、ヒトの対応物の最初の642個のアミノ酸に対して90%の類似性を示すが、C末端における279個のアミノ酸は存在しない。このウシ配列は、置換されるべきアーチファクトであると考えられる。したがって、本発明者らは、本明細書においてはヒトの配列を参照して数字の注釈を付けることを選択した。データベース検索の結果は、それらのウシ配列での数字を維持している。
IL−1で刺激した軟骨移植片から得た培地に放出されたタンパク質(3、6、9、12、及び16日)を、2D SDS PAGEを用いて分離し、ペプチドマスフィンガープリンティングを介して同定した。3日目及び6日目に得たゲルは、とりわけ最上部で不規則な分離を示し、これは、ゲル内に入るには大きすぎる、インタクトな断片化されたアグリカンを大量に含む試料に典型的である。このプロジェクトにおいて、アグリカンが放出された後、しかし主要なコラーゲン放出の前に生じる、その後の分解が焦点であった(42)。(IX型)コラーゲンα1は、12日目及び16日目から得た培地の2Dゲル上では、異なる位置で同定された(典型的なゲルを図1に示す)。IL−1の不在下でインキュベートした対照試料においては、同じスポットは存在していなかった(データは図示していない)。速く移動したタンパク質スポットの組は28kDaの見かけの質量を有しており、ペプチドマスフィンガープリンティングにより見られる配列包括度(13個のピークがペプチドに適合、図11a)により、それらが(IX型)コラーゲンα1のNC4ドメインの主要な部分に相当することが示された。約50kDaの見かけの質量で移動する(IX型)コラーゲンα1断片のペプチドマスフィガープリンティングにより、ペプチドに適合した23個のピークが明らかになり(図11b)、そのうちの10個はCOL3ドメインに由来するものであり、残りはNC4に由来するものであった。(IX型)コラーゲンα1と同定された、最も遅く移動するスポット(100kDaの見かけの質量)のペプチド包括度は、NC4及びCOL3に加えて、COL2ドメインの一部を含んでいた(25個のピークがペプチドに適合、図11c)。これは架橋部分又は全サイズの(IX型)コラーゲンα1に相当するものであり得、さらなる研究は行わなかった(未知のウシC末端配列)。
同定された(IX型)コラーゲンα1断片の研究を裏付けるため、またその研究をさらに可能にするために、(IX型)α1のNC4ドメインのN末端部分から得たペプチド(NH2−CGQDDLPGFDLISQFQ64−CONH2)(配列番号14)を、添加した、キーリンペットヘモシアニンに結合したシステインを用いて合成し、ウサギを免疫化するために用いた。このNC4抗血清は、固相ELISAにおいてNC4ペプチドへの結合を示した(力価1:50000)。結合はNC4ペプチドを添加することにより阻害された。0.3ng/mlのペプチド濃度は、結合の効率的な阻害を示した。
ポリクローナルNC4抗血清を用いたウェスタンブロットにより、SDS PAGEで分離された、IL−1で刺激した軟骨培養物から得た培地において、28kDa及び50kDaで(IX型)コラーゲンα1断片の存在が裏付けられた。40kDaに対応する位置にさらなるバンドがあることにより、他の2つよりも多少早く最初に放出された別の(IX型)コラーゲンα1要素の存在が示された(図2)。これらの3つの断片は、それぞれ28kDa、40kDa、及び50kDaの断片であるとみなされる。
IL−1で刺激したウシ鼻軟骨から得た培地内に放出された(IX型)コラーゲンα1断片の存在を受けて、本発明者らは切断部位を探求した。28kDaの断片を含む2Dゲルの切片をトリプシン又はAspNで処理し、その後、LC MSMS(Qtof)を行った。NCBI非冗長(nr)、カルバミドメチル(C)、変動的な酸化(M)、及び変動的なヒドロキシル化(P、K)を用いたMascotデータベース検索(Matrix Science Inc.Boston MA、USA)では、NC4ドメインからのペプチドが同定されただけであった。トリプシン消化した試料及びAspN消化した試料の両方において見られた最もC末端のペプチドはETCNELPAR258(配列番号1)であった(図3)。これは、トリプシンにより両端で正確に切断されたペプチド、及びAspNによりN末端は正確に切断されているがC末端の切断はプロセシングの前に別の酵素により媒介されなくてはならないペプチドに相当する。図2a及び2bにおいて、AspN消化された試料から得たMSMSデータに適合するペプチドを表にする。トリプシンの特異性を用いた、AspN消化物におけるペプチドについてのMascot MSMS Ion searchは、「切断」ETCNELPAR258(配列番号1)ペプチドのみを示し、このことは、同定された断片に対してトリプシンの攻撃がなかったことを示していた。28kDaのスポットのトリプシン消化物は、他のNC4ペプチドに加えて、アミノ酸Phe31−Lys46、Val33−Lys46、及びSer35−Lys46をそれぞれカバーする3つのN末端ペプチドを含んでいた(図12c及び図7)。後者の2つは共にN末端に非トリプシン切断を有しており、このことは、2つの新たなN末端が存在していることを示している。異なるN末端の存在は、コラゲナーゼ消化後に単離されたNC4においてこれまでに報告されているが(43、44)、本発明者らは自らの一連のデータにおいてこれらの切断を全く観察しなかった。
MMP−13を用いてウシ鼻軟骨を24時間消化すると、IL−1でのインキュベーションと同様、軟骨に視覚的影響があり、組織が透明になり始めた。NC4抗血清を用いた培地のウェスタンブロットにより、NC4ドメインを含む2つの(IX型)コラーゲンα1断片が存在することが示された。SDS−PAGEでは、抗NC4ペプチド抗血清を用いたウェスタンブロットにより示されるように、それらは一様に28kDa及び50kDaの断片に移動した(図4a)。長時間曝露すると、IL−1処理した軟骨から得た培地において見られるものに類似した、弱い40kDaのバンドも出現した(図4a、挿入図)。クマシー染色したゲルから得た28kDa及び50kDaの2つのバンドを有するゲル切片を、それぞれAspN及びトリプシンで消化した。逆相LC ESI−IonTrap MSによる分析により、(IX型)コラーゲンα1のN末端断片を同定した。28kDaの断片において見られた最もC末端のペプチドはETCNELPAR258(配列番号1)であり、これは、12日目及び16日目の、IL−1で刺激したウシ軟骨培地試料におけるものと同じペプチドである(図3)。MMP−13により生じた50kDaの(IX型)コラーゲンα1断片について(逆相LC IonTrap MSにより)同定されたペプチドを図13にリストする。最もC末端のペプチドは、トリプシンによっては生じないC末端切断を有しており(図4b)、このことは、新たに同定された切断部位を示している。同一のペプチドが、別のCOL3ドメインペプチドに加え、IL−1処理した軟骨の試料において検出された(データは図示していない)(同一のm/z、荷電状態、及び保持時間がMMP−13試料において見られたが、MSMSは実施しなかった)。
軟骨の分解がIL−1の刺激により誘発される、関節疾患における組織破壊のこのモデルは、組織高分子の断片化及び放出の研究において頻繁に使用されている。アグリカン断片が最初に放出され、その後にCOMP、フィブロモジュリン、そして最後にコラーゲンが放出されることが示されている(45〜47)。IL−1の存在下において培養した軟骨から得た培地において、本発明者らは、2Dゲル電気泳動を用い、その後MALDI MSを行うことによって、(IX型)コラーゲンα1断片の放出を見出した。28kDaの見かけのMWを有する、2Dゲル上で検出された最も豊富な断片は、球形のNC4ドメインの大部分に相当するものであった。等電点の大きなインターバルにわたる2Dゲル上の28kDaの断片のスポットの移動は、アスパラギン残基の脱アミド化による可能性がある(48)。実際、配列決定されたペプチドの1つは脱アミド化を示すと考えられた(図7)。この現象についてのさらなる調査は行わなかった。大きい方の50kDaの断片は、NC4、及びCOL3ドメインの大部分を含むことが示された。
MMP−13でのヒト関節軟骨の消化及び新規な切断部位の決定
ヒト関節軟骨は、ウシ鼻軟骨とは対照的に、MMP−13消化では消化の視認可能な兆候は示さなかった。それでも、消化培地を(NC4抗血清を用いて)ウェスタンブロットで分析したところ、反応性を示した(図5a)。バンドは30kDの見かけの質量を有しており、それにより、そのバンドは先に記載されたウシ断片から区別された。ウェスタンブロットにおいて染色されたバンドに対応するバンドを、クマシー染色したゲルから切り出し、Asp−N又はGlu−Cで消化し、逆相LC ESI−IonTrap MSで分析した。両方の消化物において、IX型コラーゲンα1のNC4が同定され(図11におけるAsp−Nの結果)、また、潜在的に新規な切断部位CHELPARITPSQ263−COOH(配列番号6)NH2−TTDERGPP−(配列番号7)に相当するペプチドが同定された。新規な切断部位は、28kDの断片において見られる、−ETCNELPAR258−COOH(配列番号1)NH2−ITPGARSP−(配列番号2)であるウシ切断部位の、5個のアミノ酸からなるC末端である。ウシ切断部位で切断された断片に適合する質量は、ヒト試料においては見られなかった。
MMP−13で消化したヒト軟骨の培地のウェスタンブロットを、16%SDS PAGEでの消化物の分離及びネオエピトープペプチド抗血清を用いた同定により実施した。NC4に対する抗体を用いて観察されたバンドと同じ位置にあるバンドを同定した(図6)。変形性関節炎の患者から得た滑液は(関節リウマチの患者と対照的に)、アフィニティー精製したCPA抗血清を用いた阻害ELISAにおいて強い阻害を示した(図8)。この実験はまた、SDSの添加が、CPA抗血清が滑液エピトープを認識するために必須であることを示した。
ウシ(IX型)コラーゲンα1のNC4ペプチドの抗血清
免疫原としての可能性を示し、BLAST検索において見られた他の配列に対する相同性を示さない、IX型コラーゲンα1のNC4ドメインのN末端部分の15merのペプチド配列を、免疫化のために選択した。配列は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、イヌ、チンパンジー、及びアカゲザルにおいて同一であり、IL−1で刺激した軟骨の培地において存在した。N末端のシステインを結合のために付加し、免疫化のための配列であるNH2−CGQDDLPGFDLISQFQ64−CONH2(配列番号14)を得た。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合したペプチドを用いてウサギを免疫化した。ペプチド合成及び抗体の産生は、Innovagen AB(Lund、Sweden)により提供されるカスタムサービスであった。ペプチド及び抗血清は、それぞれNC4ペプチド及びNC4抗血清と呼ばれる。
ネオエピトープペプチド抗血清(ヒト)
放出された(IX型)α1断片のC末端部分に相当するペプチド(C)−PARITPSQ263−COOH(配列番号13)を合成し、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合させ、ウサギを免疫化するために用いた。アガロースに結合したペプチドを有するカラムを用いて、抗血清をアフィニティー精製した。ペプチド合成、ペプチドカラムの作製、及び抗体の産生は、Innovagen AB(Lund、Sweden)により提供されるカスタムサービスであった。
ウェスタンブロット(ウシ)−図2、4、及び5a
MMP−13で消化したウシ軟骨の培地の試料を16%ポリアクリルアミド−SDSゲル電気泳動により分離し、次に、ニトロセルロース膜(Hybond−C、Amersham Biosciences)に移した(38)。ブロッキングは、トリス緩衝生理食塩水(TBS)(pH7.4)における3%(w/v)低脂肪粉乳及び0.2%(v/v)TWEEN20(商標)を用いて、4℃で一晩実施した。乳を除去したブロッキング溶液(上述)で膜をすすぎ、2%(w/v)乳、TBS、及び0.2%Tween20内に1:1000で希釈したNC4抗血清と共に、室温で1時間インキュベートした。すすいだ後、ニトロセルロース膜を、2%乳/TBS/Tween20内に1:30000で希釈したペルオキシダーゼ結合二次抗体(AffiniPureロバ抗ウサギIgG Jackson ImmunoResearch)と共に室温で1時間インキュベートした。自作のECL試薬(0.1MのTris−HCl(pH8.5)を20ml、DMSO内の250mMのルミノールを48μl、DMSO内の40mMのp−クマル酸を48μl、及び14μlのH2O2)を用いて、ブロットを1分間活性化した。Agfa CRONEX5医療用X線フィルムを適当な時間にわたり膜に曝露し、Agfa Curix60で自動的に現像した。
ウェスタンブロット(ヒト)
MMP−13で消化したヒト軟骨の培地のウェスタンブロッティングにおいて用いる、アフィニティー精製したネオエピトープ抗血清を、1:100に希釈し、一方で、全ての他の条件は実施例4に記載したものである。
阻害ELISA
Nunc Maxisorp(no446612)を、PBS内の0.1μg/mlのGGGPARITPSQ263−COOH(配列番号15)ペプチドで、多湿の箱の中で一晩、室温で被覆した。PBS内の2mg/mlのオボアルブミンを用いてさらなる結合を遮断した。ペプチド標準(0〜10μg/ml)又は変形性関節炎の滑液(1:10、1:40、及び1:160)を、0.8%SDS、0.5%オボアルブミン、及び0.1%ブタ血清に溶解し、多湿の箱の中で一晩、室温でsterilinプレート上でプレインキュベートした。各ペプチドの濃縮及び滑液の希釈を3回繰り返した。アフィニティー精製したネオエピトープ抗血清を、4%トリトン、1%ブタ血清内に1:1000で希釈し、プレインキュベートしたペプチド標準及び滑液と混合し、その後、Nuncプレートに移した。二次抗体は、1%ブタ血清内において1:1000の、アルカリホスファターゼ(Dako−306)に結合したブタ抗ウサギ免疫グロブリンであった。1mg/mlのパラジニトロフェニルリン酸を基質として用いた(9.7%のジエタノールアミン、0.01%MgCl2×6H2O、0.02%NaN3)。405nmでの吸光度の読み取りを、基質を添加した直後に行い、次に1時間のインキュベーションの後に行った。最初の読み取り(ゼロ読み取り)を2回目の読み取りから差し引き、同様に処理したこれらのウェルから得た結果を平均化し、ペプチドの濃縮又は試料の希釈に対してプロットした。
骨ミネラル密度を用いたNC4の存在/不在を比較する研究
橈骨遠位端骨折を有する5人の閉経後の女性を研究する。患者をギプス副子で4週間治療する。前腕骨の骨ミネラル密度(BMD)を、骨折の2、4、6、及び8週間後に二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)で測定する。同じ時に血清試料を採取する。BMDの結果を、血清試料におけるNC4の存在又は不在と比較する。NC4の検出を実施例5に従って行う。
Claims (12)
- 結合組織を冒すヒトの障害を検出又はモニターするために、人体から採取した血液及び滑液におけるIX型コラーゲンのα−1鎖のNC4ドメインで又はCOL3ドメインで切断されたタンパク質断片のレベルを決定する方法であって、
前記断片が、NC−4ドメインにおける、ヒトIX型コラーゲンα1鎖のCHELPARITPSQ263TTDERGPP271(配列番号5)におけるグルタミン−263とスレオニン−264との間の新規な部位での切断により生じる群から選択される、
上記方法。 - 結合組織を冒すヒトの障害を検出又はモニターするために、人体から採取した血液及び滑液におけるIX型コラーゲンのα−1鎖のNC4ドメインで又はCOL3ドメインで切断されたタンパク質断片のレベルを決定する方法であって、
前記断片が、COL3ドメインにおける、ヒトIX型コラーゲンα1鎖のRGPPGPPGPPGPRG400TIGFHDGD408(配列番号8)におけるグリシン−400とスレオニン−401との間の新規な部位での切断により生じる群から選択される、
上記方法。 - タンパク質分解活性を伴う、軟骨における病理学的プロセスによるIX型コラーゲンの切断により生じる、NC4ドメインのC末端部分又はCOL3ドメインにおける切断ネオエピトープであって、
Q残基(グルタミン)が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、PARITPSQ(配列番号13)を含む、上記切断ネオエピトープ。 - タンパク質分解活性を伴う、軟骨における病理学的プロセスによるIX型コラーゲンの切断により生じる、NC4ドメインのC末端部分又はCOL3ドメインにおける切断ネオエピトープであって、
末端のT残基(スレオニン)が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、TTDERGPP(配列番号7)を含む、上記切断ネオエピトープ。 - タンパク質分解活性を伴う、軟骨における病理学的プロセスによるIX型コラーゲンの切断により生じる、NC4ドメインのC末端部分又はCOL3ドメインにおける切断ネオエピトープであって、
G残基(グリシン)が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、RGPPGPPGPPGPRG(配列番号9)を含む、上記切断ネオエピトープ。 - タンパク質分解活性を伴う、軟骨における病理学的プロセスによるIX型コラーゲンの切断により生じる、NC4ドメインのC末端部分又はCOL3ドメインにおける切断ネオエピトープであって、
T残基(スレオニン)が遊離していなければならず、且つ完全な必要条件である、TIGFHDGD(配列番号10)を含む、上記切断ネオエピトープ。 - PARITPSQ(配列番号13)、TTDERGPP(配列番号7)、RGPPGPPGPPGPRG(配列番号9)、及びTIGFHDGD(配列番号10)からなる群から選択される切断ネオエピトープとの特異的な反応性を有する抗体。
- 請求項7に記載の抗体を含む、結合組織を冒すヒトの障害の検出又はモニタリングにおいて有用な診断キット。
- Q263が末端アミノ酸であるネオエピトープPARITPSQ263(配列番号13)の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
- T264が末端アミノ酸であるネオエピトープT264TDERGPP(配列番号7)の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
- G400が末端アミノ酸であるネオエピトープRGPPGPPGPPGPRG400(配列番号9)の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
- T401が末端アミノ酸であるネオエピトープT401IGFHDGD(配列番号10)の検出を含む、組織におけるコラーゲン切断の位置を決定する方法。
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