KR20200032704A

KR20200032704A - 콜라겐 타입 x 알파-1 검정

Info

Publication number: KR20200032704A
Application number: KR1020207003623A
Authority: KR
Inventors: 이 허; 앤-세실리에 베이 젠슨; 모르텐 칼스달
Original assignee: 노르딕 바이오사이언스 에이/에스
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-03-26
Also published as: GB201712071D0; EP3658917A1; JP7165718B2; CN111742221A; JP2020528901A; US20200173991A1; WO2019020797A1

Abstract

아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 N-말단 네오-에피토프와 특이적으로 반응하는 항체, 및 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환, 예컨대, 골관절염을 평가하기 위한 면역검정에서의 상기 항체의 용도.

Description

콜라겐 타입 X 알파-1 검정

본 발명은 콜라겐 타입 X 알파 1(collagen type X alpha 1)의 N-말단 네오-에피토프(N-terminus neo-epitope)와 특이적으로 반응하는 항체, 및 콜라겐 타입 X 알파 1을 검출하고 정량화하는 면역검정 방법에서의 상기 항체의 용도에 관한 것이다.

골관절염(osteoarthritis: OA)은 연골 손상 및 관절 기능의 손실을 특징으로 하는 흔한 관절 질환이다. OA의 병인론은 노화, 비만, 외상 및 유전을 포함하는 다수의 인자를 포함한다[1]. OA의 발병은 이 질환의 이질성(heterogeneity) 및 복잡성으로 인해 불완전하게 이해되고 있다.

현저하게는, OA의 몇몇 특징은 연골내 골화에 의해 골격 발달 동안 연골세포 분화 과정과 유사하다. 건강한 관절 연골에서, 연골세포는 증식 및 말단 분화를 저지한다. 대조적으로, 병든 연골에서의 연골세포는 비대를 점진적으로 증식시키고 전개시킨다. 게다가, 관절 연골의 혈관형성 및 병소 석회화가 개시된다[2 내지 5]. 연골세포 분화를 조절하는 분자 사례는 여전히 알려져 있지 않지만, OA에서의 연골세포 비대-유사 변화는 연구를 위하여 더욱 관심을 끌고 있다[6 내지 8].

타입 X 콜라겐 알파-1

콜라겐 타입 X 알파-1은 비-원섬유성(non-fibrillar)이지만, 연골 콜라겐과 관련하여 미세한 세포주변 필라멘트를 형성한다. 연골세포 배양액으로부터 또는 연골로부터 단리된 분자는 59 kDa 콜라겐 타입 X 알파-1 사슬의 동형 삼량체(homotrimer)이고, 대략 75 kDa의 콜라겐 타입 X의 재조합 분자의 보고가 있었다[9]. 콜라겐 타입 X 알파-1은 타입 VIII 콜라겐을 가진 유사한 도메인 구조를 공유한다: 50 kDa의 중심 삼중-나선(central triple-helical)(COL1) 도메인에는 N-말단(NC2) 및 C-말단(NC1) 비-삼중-나선 도메인이 측접되어 있다[10]. 또한, 두 콜라겐 타입은 육방정계 격자 구조의 주 성분을 나타내는데, 여기서 콜라겐 분자는 비-삼중-나선 단부 영역을 포함하는 상호작용에 의해 함께 연결된다.

콜라겐 타입 X 알파-1 분포는 긴 뼈, 추골 및 늑골의 성장 영역에서 그리고 성인(21세 초과) 갑상선 연골에서 정상 태아 비대성 연골로 제한되며, 여기서 연골 기질이 연골내 골화 동안 제거되므로 국소 붕괴를 방지하는 골격을 제공할 수 있다[11]. 또한, 이것은 골 골절 캘러스(bone fracture callus)에서, 골관절염성 연골에서 그리고 콘드로겐성 신생물에서 발견되고, 연골 무기질화에 연루될 수 있다.

골관절염

OA는 일반적으로 활막 관절, 주로 무릎 및 둔부의 비염증성 병태인 것으로 여겨진다. 연골세포 비대 및 연골석회화는 OA에서 주된 병리학적 사건이다. 망-형성 타입 X 콜라겐의 상승된 발현은 연골세포 비대에 대한 특이적 신호인 것으로 여겨지고[12 내지 15], 따라서 타입 X 콜라겐은 상기 질환에 대한 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있다.

비대 연골세포와 연관된 수종의 단백질, 예컨대, 콜라겐 타입 X, MMP13, 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin)[16], 인도 고슴도치(Indian Hedgehog)[17], Runx2[18], VEGF[19], HtrA1[20] 및 트랜스글루타미나제-2(TG-2)[21]가 있다. 콜라겐 타입 X 및 MMP13은 비대 연골세포의 마커로서 가장 광범위하게 사용되는 것이다. 그러나, MMP13의 합성은 염증 및 기계적 응력에 의해 연골세포에서 유도될 수 있다[22 내지 23]. 따라서, 비대 연골세포 특이적 마커로서의 콜라겐 타입 X는 연골세포의 표현형 변화를 나타낼 수 있다.

따라서, 생물학적 샘플에서 콜라겐 타입 X 또는 이의 단편의 양을 정확하게 정량하는 방법은 OA와 같은 콜라겐 타입 X 턴오버(turnover)에 영향을 미치는 콜라겐 타입 X 병리 또는 생리학적 절차의 더 나은 이해를 허용할 수 있다. 분명히, 이러한 방법에 대한 요구가 있다.

본 발명자들은 이제 카텝신 K가 ⁴⁷⁸A-G⁴⁷⁹ 사이의 펩타이드 연결에서 콜라겐 타입 X 알파 1을 절단하여, N-말단 네오-에피토프 바이오마커 H₂N-⁴⁷⁹GIATKGLNGP(서열번호 1)의 형성을 초래하는 것으로 확인하였다. 콜라겐 타입 X 알파 1의 이 네오-에피토프 바이오마커는 골관절염과 잘 상관된 것으로 제시되었다.

따라서, 제1 양상에서, 본 발명은 항체에 관한 것으로, 상기 항체는 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)에 포함되는 콜라겐 타입 X 알파 1의 N-말단 네오-에피토프에 특이적으로 결합한다.

바람직하게는, 항체는 N-말단 아미노산 서열 H₂N-GIATKG(서열번호 2)에 특이적으로 결합한다.

바람직하게는, 항체는 상기 N-말단 아미노산 서열의 N-연장된 신장 버전(N-extended elongated version)을 특이적으로 인식 또는 결합하지 않는다. 이와 관련하여, "상기 N-말단 아미노산 서열의 N-연장된 신장 버전"은 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)의 N-말단을 넘어 연장되는 1개 이상의 아미노산을 의미한다. 예를 들어, N-말단 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)가 알라닌 잔기에 의해 신장된다면, 대응하는 "N-연장된 신장 버전"은 H₂N-AGIATKGLNGP…(서열번호 3)일 것이다. 마찬가지로, 항체는 상기 N-말단 아미노산 서열의 N-절단된 단축 버전(N-truncated shortened version)을 특이적으로 인식 또는 결합하지 않는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, "상기 N-말단 아미노산 서열의 N-절단된 단축 버전"은 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)의 N-말단으로부터 제거된 1개 이상의 아미노산을 의미한다. 예를 들어, N-말단 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)가 1개의 아미노산 잔기에 의해 단축된다면, 대응하는 "N-절단된 단축 버전"은 H₂N-IATKGLNGP…(서열번호 4)일 것이다.

항체는 바람직하게는 단클론성 항체 또는 이의 단편이다. 본 발명은 이러한 단클론성 항체 또는 이의 단편을 생산하는 세포주를 포함한다.

제2 양상에서, 본 발명은 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 생물학적 샘플 단편을 검출하기 위한 면역검정 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 상기 생물학적 샘플을 위에서 기재된 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 항체의 결합량을 결정하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 방법은 정량적(quantitative)이다.

바람직하게는, 상기 방법은 체액에서 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양을 검출 및/또는 정량화시키는데 사용된다.

체액은 환자 유래 체액일 수 있다. 체액은, 혈액, 소변, 관절낭액, 혈청, 혈장 또는 양수일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

면역검정 방법은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 면역검정 방법은 방사선면역검정법 또는 효소-결합 면역흡착제 검정법일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

방법은 상기 방법에 의해 결정된 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양을 기지의 질환 중증도의 표준 질환 샘플과 상관시켜, 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환의 중증도를 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

대안적으로 또는 부가적으로, 방법은 상기 방법에 의해 결정된 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 상기 단편의 양을 건강한 대상체와 연관된 표준값과 비교하여 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환의 존재 및/또는 중증도를 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이와 관련하여, 상기 방법은 상기 방법에 의해 결정된 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 상기 단편의 양을 기지의 중증도의 표준 골관절염 샘플과 상관시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

마찬가지로, 상기 방법은 상기 방법에 의해 결정된 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양을 건강한 대상체와 연관된 기지의 연령 및 성별 및/또는 표준값의 대상체에서 기지의 중증도의 표준 골관절염 샘플과 상관시켜, 골관절염의 존재 및/또는 중증도를 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 샘플의 비교는 바람직하게는 환자 유래 샘플 간에 행해지며, 여기서 환자(샘플이 유래되는 자)는 표준 샘플과 동일한 성별 및 유사한 연령이다.

방법은 제1 시점에서 그리고 적어도 하나의 후속 시점에서 대상체로부터 얻어진 적어도 2개의 샘플에서 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양을 정량화시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 제1 시점에서부터 적어도 하나의 후속 시점까지의 상기 단편의 양의 변화는 제1 시점에서부터 적어도 하나의 후속 시점까지의 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환의 상태의 변화를 나타낸다.

예를 들어, 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환이 골관절염인 경우, 제1 시점에서부터 적어도 하나의 후속 시점까지의 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양의 증가는 제1 시점에서부터 적어도 하나의 후속 시점까지의 대상체에서의 골관절염의 열화를 나타낸다. 마찬가지로, 제1 시점에서부터 적어도 하나의 후속 시점까지의 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양의 감소는 제1 시점에서부터 적어도 하나의 후속 시점까지의 대상체에서의 골관절염의 개선을 나타낸다.

최종 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편을 검출하기 위한 검정 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 위에서 기재된 바와 같은 항체 및 하기 중 적어도 하나를 포함한다:

- 스트렙타비딘 코팅된 96 웰 플레이트

- 바이오틴일화 펩타이드 H₂N-GIATKGLNGP-L-바이오틴(서열번호 5)(여기서 L은 선택적 링커임)

- 샌드위치 면역검정에서 사용하기 위한 2차 항체

- 서열 H₂N-GIATKGLNGP를 포함하는 캘리브레이터 펩타이드(calibrator peptide)

- 항체 바이오틴일화 키트

- 항체 HRP 표지화 키트(antibody HRP labeling kit)

- 항체 방사성표지화 키트(antibody radiolabeling kit)

- 검정 시각화 키트(assay visualization kit)

정의

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "N-말단"은, 즉, 폴리펩타이드의 N-말단 단부에서의 폴리펩타이드의 극단을 지칭하며, 이의 일반적인 방향에서의 의미로서 이해되어서는 안 된다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "N-말단 네오-에피토프"는 단백질분해효소에 의해 단백질의 절단에 의해 형성된 N-말단 에피토프를 지칭한다. 본 발명을 위하여, 이것은 카텝신 K에 의해 콜라겐 타입 X 알파-1의 절단에 의해 형성된 N-말단 에피토프를 의미한다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편"은 콜라겐 타입 X 알파 1의 펩타이드 단편을 의미하며, 여기서 펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP…(서열번호 1)이다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "경쟁적 ELISA"는 경쟁적 효소-결합 면역흡착제 검정법을 지칭하고, 당업자에게 공지된 수법이다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "샌드위치 면역검정"은 샘플에서의 항원의 검출을 위하여 적어도 2개의 항체의 사용을 지칭하며, 당업자에게 공지된 기술이다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "Col10neo"는 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파-1의 단편을 검출하고 정량화하기 위해서 본 명세서에 개시된 특이적 검정을 기술하기 위하여 약칭하여 사용된다.

도 1: mAb의 펩타이드-결합 특이성. 바이오틴일화 합성 펩타이드인 GIATKGLNGP-k(바이오틴)(서열번호 5)를 향한 2F4의 반응성은 1000ng/㎖ 선택 펩타이드를 첨가함으로써 완전히 대체되었다. 이와 대조적으로, 동일한 농도에서 선택 펩타이드의 신장 또는 선택 펩타이드의 절단으로 약간의 또는 전혀 대체가 관찰되지 않았다.
도 2: 효소에 의한 연골의 시험관내 절단. 2 A: MMP는 인간 연골을 절단시켰다. 2B: ADAMTS는 인간 연골을 절단시켰다. 2C: 카텝신 K는 인간 연골을 절단시켰다. 데이터는 평균±SD로서 나타내었다. 소화 완충제에 단백질분해효소를 첨가하지 않은 것에 비해서 시험된 MMP 또는 ADAMTS 용액 중 어느 것에서도 Col10/C의 증가된 수준은 없었다. 역으로, 카텝신 K는 최대량을 수득하였으며, 이는 479GIATKGLNGP의 네오-에피토프를 보유하는 단편을 방출하는 이의 능력을 나타낸다.
도 3: 연골에서의 479GIATKG의 면역조직화. 3 A: 정상 마우스 IgG. 3B: 11G8, 타입 X 콜라겐의 항-C 말단. 3C: 2F4, 항-479GIATKG. 11G8에 의해 검출된 타입 X 콜라겐은 심부 영역 내 연골세포의 세포외 기질에 존재하였지만, 석회화된 연골의 영역으로부터 존재하지 않았다. C. 놀랍게도, 479GIATKG의 강력한 염색은 연골에서의 모든 영역으로부터 연골세포의 세포외 기질에서 보였다. 스케일바(Scale bar) = 500㎛
도 4: C4Pain 연구에서 대상체의 혈장에서의 KL 등급과 Col10neo 수준 간의 연관성. 데이터는 평균±95CI%로서 나타내었다. 4A: 상이한 K/L군에서의 혈장 Col10neo 수준. 보다 큰 K/L 등급을 가진 증가된 Col10neo 수준을 향하는 경향이 있었지만, 통계학적 유의성에는 도달하지 않았다. 4B: 삼분위에 의한 혈장 Col10neo 수준에서의 K/L 3-4를 가진 대상체의 분포. 사후 터키-크래머 검정(post-hoc Tukey-Kramer test)을 이용하는 일원분산분석(one-way ANOVA)이 사용되었다. 혈장 Col10neo 데이터는 모든 분석에서 대수 전환되었다. p값<0.05가 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다.
도 5: NYUHJD 진행 연구에서의 혈장 Col10neo 수준. 데이터는 평균±95CI%로서 나타내었다. 혈장 Col10neo는 건강한 대조군(p=0.0002) 또는 RA(p<0.0001)보다 OA에서 통계학적으로 더 높았다. 건강한 대조군 및 RA에서의 유의차는 확인되지 않았다. 사후 터키-크래머 검정을 이용하는 일원분산분석이 사용되었다. 혈장 Col10/Cat 데이터는 모든 분석에서 대수 전환되었다. p값<0.05가 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다. p<0.05인 경우 1개의 별표(*); p<0.01인 경우 2개(**); p<0.001인 경우 3개(***), 그리고 p<0.0001인 경우 4개(****).

실시예

본 명세서에 개시된 실시형태는, 본 개시내용의 이해를 돕기 위하여 기술된 이하의 실시예에 기재되고, 후술하는 청구범위에 정의된 바와 같은 본 개시내용의 범위를 여하튼 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이하의 실시예는 개시된 실시형태를 어떻게 만들고 사용하는지의 완전한 개시내용 및 설명을 당업자에게 제공하기 위하여 제시되고, 본 개시내용의 범위를 제한하도록 의도되지도 않으며, 이하의 실험은 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예컨대, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오류 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.

이하의 실시예에서, 이하의 물질 및 방법이 이용되었다.

물질

달리 기술되지 않는 한, 실험에 사용된 모든 물질은 고품질이었고 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)(덴마크 코펜하겐 소재) 또는 VWR(덴마크 뢰도우레시 소재)로부터 얻었다. 단클론성 항체 생산 및 검정 전개에 사용된 합성 펩타이드는 진스크립트사(GenScript)(미국 소재)로부터 구입하였다. MMP-2 촉매 도메인(cat# G04MP02C), MMP-9 촉매 도메인(cat#G04MP09C) 및 MMP-13 촉매 도메인(cat#G04MP13C)은 기오토 바이오테크사(Giotto Biotech)(이탈리아 플로렌스 소재)로부터 구매하였다. 카텝신 K(cat#219461), 카텝신 B(cat#219362) 및 카텝신 S(cat#219343) 및 ADAMTS-4(cat#CC1028)는 머크 밀리포아사(Merck Millipore)(독일 다름슈타트 소재)로부터 구입하였다. ADAMTS-5(cat# 2198-AD-20)는 알앤디 시스템즈사(R&D system)(미국 미네소타 소재)로부터 구입하였다.

면역화를 위한 서열 선택

OA 환자로부터의 인간 소변에서 천연형 펩타이드에 대한 분석은 LC-MS/MS에 의해 수행되었다. 상당량의 펩타이드 단편은 인간 OA 소변에서 동정되었다. 17개의 펩타이드 서열이 인간 타입 X 콜라겐에 고유한 것으로 확인되었다. 아미노산(aa) 위치 478'(수탁 번호: Q03692; 데이터베이스: UniProt)에 위치된 동일 유리 c-말단을 보유하는 17개 중 2개의 서열이 병에 걸린 소변에서 존재되었고, 이것은 A⁴⁷⁸-⁴⁷⁹G의 결합 사이에서 일어나는 절단을 나타낸다. 이 절단에 의해 생성된 유리 N-말단 단부의 첫 번째 10개의 aa인 ⁴⁷⁹GIATKGLNGP⁴⁸⁸(서열번호 1)이 면역화를 위하여 선택되었다. 상이한 종으로부터의 서열 정렬은 또한 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST, 표 1 참조)을 이용해서 분석되었다.

단클론성 항체(mAb) 생산

6 내지 7주령의 6마리의 암컷 Balb/C 마우스는 Sigma Adjuvant System®(cat#S6322, 시그마-알드리치사)을 이용해서 에멀션화된 GIATKGLNGP-GGC-KLH(서열번호 6)로 피하 면역화되었다. 애주번트를 구비한 100㎍의 에멀션화된 KLH-접합체는 안정적인 적정 수준이 얻어질 때까지 매 3주마다 마우스에게 반복해서 주사하였다. 각 출혈 시, 혈청 항체 역가는 스트렙타비딘 코팅된 마이크로플레이트(로슈 다이아그노스틱스사(Roche Diagnostics), 독일 소재) 상에 코팅된 바이오틴일화 펩타이드인 GIATKGLNGP-k(바이오틴)(서열번호 5)에 대해서 측정되었다. 선택 펩타이드인 GIATKGLNGP(서열번호 1)를 향한 최고 항체 역가 및 최상의 반응성을 가진 마우스는 융합을 위하여 선택되었다(데이터 미제시). 선택된 마우스는 융합을 위하여 희생시키기 전에 3일 동안 100㎕의 0.9% 염화나트륨 용액 중에 100 ㎍ KLH-접합체로 복강내(i.p.) 부스팅되었다. 융합 및 항체 선별 공정은 표준 수법을 이용해서 수행되었다. 간략히 하면, 쥣과 골수종 세포인 SP2/0-Ag14(ATCC®CRL-1581™)와 융합된 비장세포의 단리를 위하여 비장을 수술적으로 제거하였다. 하이브리도마 세포는 HAT(하이포잔틴 아미노프테린 티미딘(hypoxanthine Aminopterin Thymidine)) 배지를 사용함으로써 선택되었다. 상청액은 간접적 ELISA에 의해 선별되었으며, 여기서 바이오틴일화 펩타이드인 GIATKGLNGP-k(바이오틴)(서열번호 5)는 스트렙타비딘-사전 코팅된 마이크로플레이트 상에 코팅되었다. 표준 제한 희석 공정은 단일 세포를 선택하기 위하여 수행되었다. 상청액 중 항체의 아이소타입은 아이소타입 판별 키트인 SBA Clonotyping System-HRP(5300-05, 서던 바이오테크사(Southern Biotech))를 이용해서 시험되었다. 단일-세포 유래 하이브리도마는 24-웰 플레이트로 옮겨서 추가의 성장을 가능하게 하였고, 궁극적으로 T25 플라스크에서 T175 플라스크까지 확대되었다. 항체 정제를 위하여 1㎖의 HiTrap 단백질 G HP 칼럼(cat#17-0404-01, GE 헬스케어사(GE Healthcare))에 적용하기 전에 상청액을 수집하여 0.2㎛ 필터를 이용해서 여과시켰다.

⁴⁷⁹ GIATKG 특이적 면역-검정(Col10neo)

정제된 단클론성 항체는 우선 3개의 합성 펩타이드에 의한 펩타이드-결합 특이성, 선택 펩타이드(GIATKGLNGP; 서열번호 1), 선택 펩타이드(AGIATKGLNGP; 서열번호 3)의 신장 및 선택 펩타이드(IATKGLNGP; 서열번호 4)의 절단에 대해서 시험되었고, 이어서 경쟁적 면역검정에서 사용되었다. 완충제, 온도, 주된 시약을 위한 인큐베이션 시간 및 농도에 대한 최적화 후에, ⁴⁷⁹GIATKG(서열번호 2) 검정의 검출을 위한 최종 프로토콜은 다음과 같이 전개되었다: 96-웰 스트렙타비딘 사전 코팅된 마이크로 플레이트를 50mM PBS-BTB 완충제(소혈청 알부민 및 Tween-20과 함께 포스페이트-완충된 식염수, pH7.4)에 용해된 1ng/㎖의 바이오틴일화 펩타이드인 GIATKGLNGP-k(바이오틴)(서열번호 5)로 20℃에서 30분 동안 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 표준 세척 완충제(20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.2)로 5회 세척하였다. 20㎕의 펩타이드 표준품, 키트 대조군 또는 샘플을 적절한 웰에 첨가하고 나서, 5% 오스테오칼신 EIA Puf-Liq(로슈 다이아그노스틱스사, 독일 소재)를 함유하는 50mM PBS-BTB 완충제에 23ng/㎖ 단클론성 항체 100㎕를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤(20±1 hr) 인큐베이션하였다. 5회 세척 후에, 100㎕의 염소 항-마우스 2차 항체(115-035-003, 잭슨 이뮤노리서치사(Jackson ImmunoResearch))를 첨가하고, 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 단계 후에, 플레이트를 세척 완충제로 5회 세척하였다. 최종적으로, 100㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 각 웰에 첨가하고, 암소에서 20℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100㎕의 정지 용액(1% H₂SO₄)을 첨가함으로써 비색 반응을 정지시키고, 450㎚에서 측정하였으며, 참조로서 650㎚에서 측정하였다.

플레이트간 및 플레이트내 변동은 품질 제어 패널(3개의 인간 혈청 및 2개의 펩타이드 표준품)의 10개의 독립된 시행으로 두 벌로 결정하였다. 검출 하한(LLOD)은 21개의 제로 표준품의 평균치의 3SD로서 계산되었다. 다수의 인간 혈청 또는 혈장 샘플을 인큐베이션 완충제에 순수, 2, 4, 6, 8, 16-배에서 검정하였다. 회복률 퍼센트는 측정된 농도를 희석을 위하여 보정된 예상 농도로 나눈 것으로 계산되었다.

인간 연골의 시험관내 절단

무릎관절 치환수술을 받은 골관절염(OA) 환자로부터의 관절 연골생검은 겐토프테 병원(Gentofte Hospital)(덴마크 겐토프테 소재)으로부터 얻었다. 시료의 회수(retrieval)는 인간 샘플 및 환자 정보를 다루기 위한 국제 윤리 지침(international ethical guideline)을 준수하였다. 모든 참가자는 사전 동의서에 서명하였고, 연구는 덴마크 당국에 의해 승인받았다. A⁴⁷⁸-⁴⁷⁹G 결합의 절단을 담당하는 효소를 확인하기 위하여, 연골은 기질 금속단백질분해효소(MMP2, MMP9 및 MMP13), 카텝신(CatK, CatB 및 CatS), 및 트롬보스폰딘 모티프를 가진 A 디스인테그린 및 금속단백질분해효소 도메인(A disintegrin and metalloproteinase)(ADAMTS-4 및 ADAMTS-5)을 포함하는 단백질분해효소에 의해 절단되었다. 1㎍의 각 효소를 가진 30㎎의 스냅-동결되고(snap-frozen) 분쇄된 연골을 250㎕의 소화 완충제(MMP용의 소화 완충제: 100mM Tris, 100mM NaCl, 10mM CaCl₂ 및 2mM 아세트산아연, pH 8.0; ADAMTS용의 소화 완충제: 50mM Tris, 100mM NaCl 및 10mM CaCL₂, pH 7,5; 카텝신용의 소화 완충제: 25mM NA₂HPO₄, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 2mM DTT, pH 6.5)가 들어간 0.5㎖ 에펜도르프(Eppendorf)에 넣었다. 소화를 2개의 복제로 1일에 수행하였다. 5mM EDTA(MMP 및 ADAMTS용의 광범위 저해제) 및 5mM E64(카텝신용의 광범위 저해제)를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 모든 상청액은 사용 전에 -80℃에서 저장하였다.

면역조직화학(IHC)

IHC용의 골 시료를 가진 연골은 덴마크 당국(N-20110031)에 의해 승인된 프레데릭수하운 병원(Frederikshavn Hospital)(덴마크)과 협업하여 연구로부터 얻었다. 모든 참가자는 사전 동의서에 서명하였다. 무릎관절 치환수술을 받은 OA 환자로부터의 시료를 고정하고 석회질 제거하였으며, 이어서 파라핀에 포매하였다. 5㎛-두께의 연골 박편을 60℃에서 1시간 동안 용융시키고 탈파라핀화하고 수화시키고 나서, Pronase E(cat#10165921001, 로슈사)를 사용해서 37℃에서 10분 동안 항원 회수를 행하였다. 박편을 실온에서 30분 동안 Tris 완충 식염수(TBS) 중 0.5% 카제인으로 처리하여 비특이적 결합을 차단하였다. 면역염색은 이 연구에서 개발된 항체 NB117-2F4 및 앞서 개발된 항체 NB509-11G8에 의해 수행하였다. 면역반응성은 퍼옥시다제 표지된 항-마우스 및 다이아미노벤지딘(DAB, 덴마크 다코 소재)으로 시각화하였다. 대조염색은 마이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 행하였다. 사진은 올림푸스(Olympus) C5050 디지털 카메라가 장비된 올림푸스 현미경 BX60을 이용해서 촬영하였다.

연구 참가자

혈장 샘플은 두 연구, 즉, 지역 윤리 위원회(N-20100094)에 의해 승인된 C4Pain 연구[24] 및 지역 윤리 위원회에 의해 승인된 NYUHJD 진행 연구[25, 26]로부터 회수하였다. 모든 참가자는 등록 전에 사전 동의서에 서명하였다.

간략히 요약하면, C4Pain은 단면 연구이다. 이것은 켈그렌/로렌스(Kellgren/Lawrance: K/L) 등급 척도(K/L 0-4)를 이용해서 관절 퇴행 없음 내지 중증 관절 퇴행을 가진 281명의 개체를 포함하였다. 253명의 등록자로부터의 혈장 샘플은 다른 28개의 샘플의 불충분한 용적으로 인해 본 연구에서 측정하였다.

NYUHJD 진행 연구는 기준선에서 21명의 비-OA 건강한 대조군(K/L≤1, 그리고 어느 쪽 무릎에도 통증 없음), 146명의 OA 환자(K/L≥2) 및 36명의 류마티스 관절염(RA) 환자를 포함하였다. 146명의 OA 환자는 24개월 동안 더욱 추적하였다. 방사선 평가는 기준선에서 그리고 24개월에 촬영하였고, 혈장은 기준선에서 수집되었다. 기준선에서의 20명의 비-OA 건강한 대조군, 142명의 OA 대상체 및 34명의 RA 대상체로부터의 혈장 샘플은 본 연구에서 측정을 위하여 이용 가능하였다. 그러나, 본 연구에서, 본 발명자들은 단지 기준선에서 상이한 군에서의 Col10neo의 수준을 조사하였다. 추가의 연구는 OA에서 방사선 진행의 잠재적 예후 바이오마커로서 Col10neo의 더욱 완전한 사진을 위하여 계속 지향할 것이다.

통계학

데이터는 GraphPad Prism 6 또는 MedCalc 16.8을 이용해서 분석되었다. 정상상태 점검을 위하여, 관심대상 모든 변수에 대한 샤피로-윌크 검정(Shaprio-Wilk test)이 수행되었다. 연령, BMI 및 VAS 점수에 대한 군 비교 간에는, 사후 터키-크래머 검정을 이용하는 일원분산분석이 사용되었다. 혈장 Col10neo 데이터는 모든 분석에서 대수 전환되었다. p값<0.05가 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다. p<0.05인 경우 1개의 별표(*); p<0.01인 경우 2개(**); p<0.001인 경우 3개(***), 그리고 p<0.0001인 경우 4개(****).

결과

펩타이드 선택

종에 걸친 선택된 펩타이드의 서열 정렬

⁴⁶³PGSKGDPGSPGPPGPA⁴⁷⁸(서열번호 7) 및 ⁴⁶⁵SKGDPGSPGPPGPA⁴⁷⁸(서열번호 8)인 동일한 유리 C-말단 단부를 공유하는 2개의 단편은 OA 환자의 소변에서 질량 분광분석법에 의해 식별되었고, 이것은 A⁴⁷⁸-⁴⁷⁹G 사이에 존재하는 절단 부위의 존재를 나타낸다. 절단에 의해 생성된 유리 N-말단으로부터의 10aa 펩타이드인 ⁴⁷⁹GIATKGLNGP(서열번호 1)가 면역화를 위하여 선택되었다. 블라스트(blast)는, 인간 단백질 중에서 서열이 타입 X 콜라겐 알파-1에 고유한 것을 나타낸다. 종에 걸친 서열 유사성은 인간과 마우스 간의 100% 동일성을 나타내는 한편, 미스매치된 aa는 인간 서열에 비해서 래트 또는 소에 함유된다.

Col10neo 검정의 기술적 성능

⁴⁷⁹GIATKG(서열번호 2)를 표적화하는 단클론성 항체 2F4(아이소타입: IgG2b, κ)는 하이브리도마로부터 생산되었고 HiTrap 단백질 G 친화도 칼럼(Cat#17-0404-01, GE 헬스케어사)에 의해 정제되었다. 펩타이드-결합 특이성에 대한 시험에서, 바이오틴일화 합성 펩타이드인 GIATKGLNGP-k(바이오틴)(서열번호 5)를 향한 2F4의 반응성은, 1000ng/㎖ 선택 펩타이드를 첨가함으로써 완전히 대체되었다. 이와 대조적으로, 동일한 농도에서 선택 펩타이드의 신장 또는 선택 펩타이드의 절단에서 약간의 대체가 관찰되거나 또는 전혀 관찰되지 않았다(도 1). 이것은 전개된 항체 2F4가 선택 펩타이드에 대해서 특이적인 것을 나타내었다.

따라서, 커다란 특이성을 나타내는 항체 2F4가 경쟁적 ELISA 검정, Col10neo에 적용되었다. 이 검정의 기술적 성능은 표 2에 요약되어 나열되어 있다. IC50은 41.9ng/㎖였다. 내부-검정(intra-assay) 계수 변동(CV%)은 3%였고 내부-검정 CV%는 11.8였다. 측정치 범위는 8 내지 250ng/㎖였다. 선형성은 혈청의 4- 내지 32-배 희석 및 EDTA-항응고화 혈장의 8- 내지 64-배 희석의 넓은 범위에 걸쳐서 양호하였다.

카텝신 K-유래 ⁴⁷⁹ GIATKG

A⁴⁷⁸-⁴⁷⁹G 결합을 절단하기 위한 담당 효소를 연구하기 위하여, 수개의 단백질분해효소가 인간 연골로 개별적으로 인큐베이션되었다. 모든 단백질분해효소는 동일한 효소 농도에 있고 모든 인큐베이션은 동일한 인큐베이션 시간에 대해서 수행되었다. ⁴⁷⁹GIATKGLNGP(서열번호 1)의 네오-에피토프를 생성하기 위하여 각 단백질분해효소에 대한 상대 효율은 Col10neo 검정에 적용함으로써 평가되었다. 소화 완충액에 단백질분해효소를 첨가하하지 않은 것에 비해서 시험된 MMP 또는 ADAMTS 용액 중 어느 것에서도 Col10neo의 수준은 증가되지 않았다(도 2A 및 도 2B). 역으로, 카텝신 K는 ⁴⁷⁹GIATKGLNGP(서열번호 1)의 네오-에피토프를 보유하는 단편을 방출하는 이의 능력을 나타내는 최대량을 산출하였다(도 2C).

연골에서의 ⁴⁷⁹ GIATKG의 면역조직화

⁴⁷⁹GIATKG(서열번호 2)의 생성 및 분포를 더욱 정의하기 위하여, TKR(무릎관절 전치환술(total knee replacement)) 환자로부터의 관절 연골의 연속적 박편을 항-⁴⁷⁹GIATKG(서열번호 2)(2F4), 정상 마우스 IgG(음성 대조군) 및 타입 X 콜라겐의 항-C 말단(11G8 - WO 2014/180992에 개시됨)으로 염색하였다. 본 발명자들은 정상 마우스 IgG에 의한 어떠한 염색도 관찰되지 않았다(도 3A). 이전의 연구와 함께, 11G8에 의해 검출된 타입 X 콜라겐은 심부 영역에서 연골세포의 세포외 기질에 존재하였지만, 석회화된 연골의 영역으로부터는 존재하지 않았던 것이 확인되었다(도 3B). 놀랍게도, ⁴⁷⁹GIATKG(서열번호 2)의 강력한 염색은 연골의 모든 영역으로부터 연골세포의 세포외 기질에서 보였다(도 3C). 네오-에피토프의 염색은 세포외 기질로 방출된 타입 X 콜라겐이 추가의 단백질 가수분해 처리를 받는 것을 입증하였다.

C4Pain 연구에서의 K/L 등급과 혈장 Col10neo 수준 간의 연관성

C4Pain 연구로부터의 253명의 참가자는 K/L 등급에 기초하여 4개의 군으로 분류되었다. 이들 4개의 군의 인구통계학적 특징은 표 3에 요약되어 있다.

참가자의 평균 연령이 60세 초과였으므로, K/L 0 또는 1의 K/L을 가진 소수의 참가자가 동일한 군으로 분류되었다. 이 연구에 내포된 대상체의 57%는 2의 K/L을 지녔고, 군 2에 할당되었다. 각 군 내에서 성별 분포에 유의차가 없었다. K/L4의 평균 연령은 K/L 0-1군보다 유의하게 더 높았다(p<0.005). K/L 등급의 증가를 갖는 증가된 BMI의 명백하지만 유의한 경향은 없었다. 마지막 24시간 동안 최대 통증 강도로서 정의된 VAS 점수의 평균값은, 각 군으로부터 유의하게 차이가 없었다.

KL 0-4로부터의 4군에서의 참가자에 대한 Col10neo의 평균 ± 95CI% 농도는 각각 2.6[2.316-2.884] ㎍/㎖, 3.288[2.885-3.691] ㎍/㎖, 3.435[2.729-4.141] ㎍/㎖ 및 3.517[2.599-4.435] ㎍/㎖였다. 더 큰 K/L 등급을 가진 증가된 Col10neo 수준을 향한 경향이 있었지만, 통계학적 유의성에 도달하지 않았다(도 4A). 대상체는 Col10neo 수준에 기초한 삼분위로 나누었고 K/L 등급의 분포는 비교되었다(도 4B). K/L 3-4를 가진 대상체의 수는 Col10neo의 최고 삼분위에서의 것에서 가장 컸다.

NYUHJD 진행 연구에서의 혈장 Col10neo 수준

C4Pain 연구로부터의 결과는 본 발명자들로 하여금 비-OA 건강한 대조군, OA 및 RA로 이루어진 NYUHJD 진행 연구에서 진단 바이오마커로서 Col10neo를 이용하는 잠재성을 연구하게 하였다. 여성 참가자의 백분율은 건강한 대조군에서보다 OA군 및 RA군에서 더 높았다. 평균 연령은 대조군 및 OA군에서 유의하게 상이하였다. 그러나, RA가 임의의 연령에서 일어날 수 있지만 연령 30 내지 55세 사이에 이의 피크를 가지므로, 대상체는 OA군에서보다 RA군에서 유의하게 더 젊었다. 건강한 대조군과 OA 간에 BMI의 약간의 차이가 있었다.

대조군, OA 및 RA의 혈장 Col10neo(평균 ± 95CI%)는 각각 2.953[2.711-3.194]㎍/㎖, 4.04[3.835-4.246]㎍/㎖ 및 2.548[2.285-2.81]㎍/㎖였다(도 5). 혈장 Col10neo는 건강한 대조군(p=0.0002) 또는 RA(p<0.0001)보다 OA에서 통계학적으로 더 높았다. 건강한 대조군과 RA 간에 유의차가 발견되지 않았다. 데이터가 연령 및 성별에 대해서 조절된 경우, Col10neo의 수준은 대조군(p=0.003) 또는 RA(p<0.0001)에 관하여 OA에서 유의하게 증가된 채로 유지되었다(표 5).

놀랍게도, 연령 및 성별에 대해서 조절된 경우, 대조군과 Col10neo 간의 차이는 RA에 대해서 유의하게 되었다(p=0.0084; 표 5).

결론적 언급

본 명세서에서 개시된 col10neo 검정이 OA의 평가에 유용한 것으로 입증되었다.

본 명세서에서는, 강직성 척추염과 같은 콜라겐 타입 X 알파-1과 연관된 기타 질환을 평가하기 위하여 유용성이 확대될 수 있음이 제안된다.

본 명세서에서, 달리 명확하게 표시되지 않는 한, 단어 '또는'은, 단지 하나의 조건이 충족되는 것을 요구하는 연산자 '배타적인 또는'과는 반대로, 기술된 병태 중 어느 하나 또는 둘 다가 충족되는 경우 참값을 되돌리는 연산자의 의미로 이용된다. 단어 '포함하는'은 '로 이루어진'을 의미하는 것보다 오히려 '포함하는'의 의미로 사용된다. 위에서 알려진 모든 종래의 교시는 본 명세서에 참고로 편입된다. 본 명세서에서의 임의의 종래의 간행된 문서의 인정은, 이의 교시가 이 문서의 일자에 오스트리아에서 또는 그 밖의 지역에서의 통상의 일반적인 지식이라는 허가 또는 묘사인 것으로 취해져서는 안 된다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Nordic Bioscience A/S <120> COLLAGEN TYPE X ALPHA-1 ASSAY <130> IPA191640-US <140> PCT/EP2018/070430 <141> 2018-07-27 <150> GB 1712071.8 <151> 2017-07-27 <160> 12 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> N-terminus neo-epitope biomarker of collagen type X alpha 1 <400> 1 Gly Ile Ala Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> N-terminus neo-epitope biomarker of collagen type X alpha 1 <400> 2 Gly Ile Ala Thr Lys Gly 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Elongated peptide <400> 3 Ala Gly Ile Ala Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated peptide <400> 4 Ile Ala Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotinylated peptide <220> <221> SITE <222> 11 <223> Biotin residue with optional linker between biotin residue and peptide <400> 5 Gly Ile Ala Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro Xaa 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic peptide <220> <221> SITE <222> 14 <223> Keyhole limpet hemocyanin residue <400> 6 Gly Ile Ala Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro Gly Gly Cys Xaa 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mass spec fragment <400> 7 Pro Gly Ser Lys Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala 1 5 10 15 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mass spec fragment <400> 8 Ser Lys Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus <220> <223> Rat sequence <400> 9 Gly Ile Val Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Murinae <220> <223> Mouse sequence <400> 10 Gly Ile Ala Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Bovidae <220> <223> Bovine sequence <400> 11 Gly Ile Ala Val Lys Gly Leu Asn Gly Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Canidae <220> <223> Dog sequence <400> 12 Gly Val Ala Thr Lys Gly Leu Asn Gly Pro 1 5 10

Claims

항체로서, 상기 항체는 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1(collagen type X alpha 1)의 N-말단 네오-에피토프(N-terminus neo-epitope)와 특이적으로 반응하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 N-말단 아미노산 서열 H₂N-GIATKG(서열번호 2)에 특이적으로 결합되는, 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 상기 N-말단 아미노산 서열의 N-연장된 신장 버전(N-extended elongated version) 또는 상기 N-말단 아미노산 서열의 N-절단된 단축 버전(N-truncated shortened version)을 특이적으로 인식 또는 결합하지 않는, 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체 또는 이의 단편인, 항체.
제4항에 청구된 바와 같은 단클론성 항체를 생산하는, 세포주.
N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 생물학적 샘플 단편에서 검출하기 위한 면역검정 방법으로서, 상기 방법은 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 상기 샘플학적 샘플을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 항체의 결합량을 결정하는 단계를 포함하는, 면역검정 방법.
제6항에 있어서, 상기 검출은 정량적(quantitative)인, 면역검정 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 방법은 체액에서 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양을 검출 및/또는 정량화하는데 사용되는, 면역검정 방법.
제8항에 있어서, 상기 체액은 환자 유래 체액인, 면역검정 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 체액은 혈액, 소변, 관절낭액, 혈청 또는 혈장인, 면역검정 방법.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정인, 면역검정 방법.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 방사선면역검정법 또는 효소-결합 면역흡착제 검정법인, 면역검정 방법.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 방법에 의해 결정된 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양을 기지의 질환 중증도의 표준 질환 샘플과 상관시켜, 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환의 중증도를 평가하는 단계를 더 포함하는, 면역검정 방법.
제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 방법에 의해 결정된 상기 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 상기 단편의 양을 건강한 대상체와 연관된 표준값과 비교하여, 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환의 존재 및/또는 중증도를 평가하는 단계를 더 포함하는, 면역검정 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 콜라겐 타입 X 알파 1과 연관된 질환은 골관절염인, 면역검정 방법.
생물학적 샘플에서 N-말단 네오-에피토프 아미노산 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 콜라겐 타입 X 알파 1의 단편의 양을 결정하기 위한 검정 키트로서, 상기 키트는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 항체 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 검정 키트:
- 스트렙타비딘 코팅된 96 웰 플레이트
- 바이오틴일화 펩타이드 H₂N-GIATKGLNGP-L-바이오틴(서열번호 5)(L은 선택적 링커임)
- 샌드위치 면역검정에서 사용하기 위한 2차 항체
- 서열 H₂N-GIATKGLNGP(서열번호 1)를 포함하는 캘리브레이터 펩타이드드(calibrator peptide)
- 항체 바이오틴일화 키트
- 항체 HRP 표지화 키트(antibody HRP labeling kit)
- 항체 방사성표지화 키트(antibody radiolabeling kit)
- 검정 시각화 키트(assay visualization kit).