JPH09500209A

JPH09500209A - 哺乳類の結合組織マトリックスの分解の指標としてのｙｋｌ−４０の検定方法

Info

Publication number: JPH09500209A
Application number: JP7504194A
Authority: JP
Inventors: ポールエイ．プライス; ジュリアエス．ジョハンセン
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1997-01-07
Anticipated expiration: 2014-04-05
Also published as: CA2164498A1; US6794150B2; JP2878455B2; US5935798A; EP0710251A4; DE69434230D1; US6579684B2; CA2166292C; WO1995001995A1; EP0710251B1; US20050065325A1; DE69434230T2; CA2164498C; EP0710251A1; CA2166292A1; US20020090658A1; US20020031793A1; US7230086B2

Abstract

(57)【要約】この発明は、哺乳類の結合組織の分解に関する哺乳類の疾患状態の存在を確認し、かっ該状態を監視する方法である。この方法によって、診断または予後を行うのに有為な濃度のＹＫＬ−４０タンパク質および／またはＹＫＬ−４０ペプチドが生体試料中に存在しているか否か検出され、測定される。この方法は、例えば、炎症性若しくは退行性の関節疾患の存在または臓器の結合組織の退行を確認するのに利用できる。また、この発明の方法で検出され定量されるＹＫＬ−４０の血清中濃度は、癌が再発および／または転移した後続いて乳癌患者が生存する期間の予後も示唆している。図は、実質的に純粋な血清ＹＫＬ−４０のゲル濾過カラムにおける溶離位置を示す。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳類の結合組織マトリックスの分解の指標としてのＹＫＬ−４０の検定方法関連米国特許願この件は、１９９３年７月９日に出願され現在は放棄されている米国特許願第０８／０８９，９８９号の一部継続出願である。政府の権利の説明この発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成番号ＡＲ−２７０２９の下に政府援助を部分的に受けてなされた。米国政府がこの発明についてある種の権利を有している可能性がある。発明の背景１．発明の分野この発明は、啼乳類の結合組織の細胞外繊維マトリックスの代謝に関連する循環タンパク質の同定に関する。さらに詳しくは、この発明は、哺乳類の結合組織代謝に関連するタンパク質であるＹＫＬ−４０の分子およびフラグメントを検出および定量する検定方法に関する。また、この発明には、哺乳類のＹＫＬ−４０の血清中濃度と、関節疾患や或る種の腫瘍の転移など、マトリックス代謝が役割を演じる疾患の存在および状態との相関関係を示すことも含まれる。２．関連技術の説明哺乳類の結合組織（例えば、関節の軟骨、血管系とリンパ系の脈完璧組織など）の細胞外マトリックスは、細胞の結合組織からの移動に対して、強度および（程度を変えて）バリヤーを付与する。しかし、ある種の疾患の過程で、該マトリックスは、加水分解酵素によって分解される。該マトリックスが分解されるにつれて、結合組織の統合性が損われて、組織の細胞、副生物およびマトリックス代謝の他の残留物が体液および／またはリンパ管または血管の循環系中に漏出する。これらの分子および細胞を検出すれば、或る特定の場合には、細胞外マトリックスがどのようにして合成され、そしてどのようにして失われるのかを含めて、細胞外マトリックスの生化学的特性に関する情報が得られる。また、マトリックスの異常代謝が行われている間に産生および／または分泌される特定の分子が疾患の過程に密接に関連している場合、患者の体液および／または組織中の該分子を定量することは、臨床医がその疾患の経過を監視するのに役立つ。ヒトの関節の軟骨は、いくつもの異なる種類のタンパク質とプロテオグリカンを含有し、そのうちのいくつかは関節軟骨中にしか存在していないことが知られている。マトリックスのこれら成分は、マトリックスが或る種の関節疾患の過程で分解すると、軟骨の組織から放出される。特定の体液または組織中に存在する放出されたマトリックス成分（そのフラグメントと類縁巨大分子を含む）の量は、その疾患の強さと相関関係がある。逆に、関節軟骨の損傷が可逆的である場合（例えば、関節組織の感染症で起こる二次反応性関節炎（secondary reactive a rthritis）の場合）は、予め測定された放出マトリックス成分の濃度の減少は、その疾患の寛解の程度と相関関係がある。しかし、実際は、軟骨および他の結合組織の代謝に関する信頼できる指標の同定、並びにこれら指標を検出する検定法の開発は、難しい課題であることが分かってきた。ある種の放出されたフラグメントと分子は、リンパ節、肝臓および食作用によって循環系から迅速に除去される（例えば、Frazer他の論文、Hyaluronan、Sources Turnover and Metabolism、Clinical Impact of Bone and Connective Markers、３１〜４９頁、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年）、Smedsrodの論文、「Catabolism in Liver Sinusoids」、上記文献中５１〜７３頁、およびHeinegardの論文、Br it.J.Rheumatol.、３０（Ｓｕｐｐｌ．１）、２１〜２４頁、１９９１年を参照）。さらに、ある種の分子がいくつもの異なる結合組織中に存在し、確かめられていないその分子の循環濃度に基づいて特定の組織の代謝に関与している。特定分子の濃度によって問題の組織の代謝を追跡できる場合でも、これらの分子は、疾患の段階で、その大量がまたは結合組織が失われたときに、検出できない濃度まで減少するかまたは構造が生化学的に変化する。したがって、当然のことであるが、検定法特に血清を利用する検定法（特定のタンパク質の濃度を関節疾患の活性と関連づける検定法）を開発する試みが成功不成功を交えて行われている。Ｒｏｈｄｅと同僚は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）の患者のアミノ末端のＩＩＩ型プロコラーゲンペプチドとその分解生成物の血清中濃度の放射線免疫検定法（ＲＩＡ）を報告している（Ｒｈｏｄｅ他の論文、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９巻、４５１〜４５９頁、１９７９年）。このプロペプチド（Ｐ−ＩＩＩ−ＮＰ）は、いくつもの体液中に検出することができる。その後の報告で、Ｒｈｏｄｅらの放射線免疫検定法を用いてＰ−ＩＩＩ−ＮＰの血清中濃度を疾患の活性に関連づける試みがなされている（Ｈφｒｓｌｅｖ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ他の論文、Ａｒｔｈ．ａｎｄＲｈｅｕｍ．、第５巻、５９２〜５９９頁、１９８６年）。Ｐ−ＩＩＩ−ＮＰの血清中濃度は、活性ＲＡの患者の場合、著しく上昇するが、この濃度は不活性ＲＡの患者でも同様の程度まで上昇するので、これら二つの状態をＰ−ＩＩＩ− ＮＰの濃度だけに基づいて識別することは困難である。ＲＡの患者の他の結合組織の代謝物と成分の血清中濃度の検定が、治療のプロトコルに関連して試みられ、そのプロトコルの成功が評価されたが、やはり成功と不成功が混じった状態であった。例えば、Ｈφｒｓｌｅｖ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ他の論文（上記文献）は、Ｐ−ＩＩＩ−ＮＰ、免疫反応性プロピルヂヒドロキシラーゼタンパク質（１ＲＰＨ）、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓ領域（ＣｏｌＩＶ、７Ｓ）およびラミニンのフラグメントＰＩ（Ｓ−Ｌａｍ）（これらは、細胞外介在コラーゲン類と基底膜類の代謝に関連している）の血清中濃度を測定した。Ｐ −ＩＩＩ−ＮＰ、１ＲＰＨおよびＣｏｌＩＶ、７Ｓの血清中濃度は、ＲＡ患者の場合（健康な成人と比べて）上昇したが、その疾患が明らかに寛解していて、正常状態まで減少しなかった。また、Ｓ−Ｌａｍの濃度は、活性ＲＡ患者と不活性ＲＡ患者の両者ともに正常のままであった。したがって、これらのタンパク質的血清中の存在と量は、ＲＡの経過または寛解と明確な相関関係がないようである。また、同様の難しさによって、他の結合組織の疾患の経過に対する信頼できる指標の同定が妨げられている。したがって、結合組織代謝に対する信頼できる指標として役立つ候補的分子とフラグメントの同定は、臨床化学の研究の重要な目標である。この目的のため、マトリックス生成細胞による特定のタンパク質の発現が、抗原の免度検定法および候補的指標タンパク質をコードするｍＲＮＡのハイブリッド形成検定法によって評価された。しかし、細胞外マトリックスからのタンパク質の単離は、そのマトリックスの多数の成分になる分泌タンパク質の同定に限定される。そのため、候補的タンパク質の同定は制限された。１９９２年に、この発明の発明者らは、マトリックス形成細胞が分泌する全てのタンパク質の同定法を報告した（Ｊｏｈａｎｓｅｎ他の論文、Ｊ．ＢｏｎｅａｎｄＭｉｎ．Ｒｅｓ．、第７巻、５０１〜５１２頁、１９９２年）。この方法を用いて、４０ｋＤのタンパク質をヒト骨細胞の分泌タンパク質として同定した。この発明の発明者らは、上記のタンパク質（そのＮ末端の最初の３個のアミノ酸と分子量にちなんでＹＫＬ−４０と命名した）が骨におけるビタミンＤの作用に役割を果しているという仮設を立てた。ＹＫＬ−４０は、その乳腺が退行しつつある非泌乳雌牛の乳房の分泌物中に存在しているとＲｅｊｍａｎらが同定したのと同じタンパク質のようである（Ｒｅｊｍａｎ他の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１５０巻、３２９〜３３４頁、１９８８年）。以下に詳細に述べるように、その後、ＹＫＬ−４０は、リウマチ様関節炎、骨関節症などの異種の病状を有する疾患を含む関節疾患の信頼できる指標として役立つことが発見されたのである。予想外のことであったが、ＹＫＬ−４０の血清中濃度は、乳癌細胞が転移している患者の場合著しく上昇し、特にその癌が再発し転移してから比較的短期間生存する患者の場合に著しく上昇することが発見されたのである。さらに、この発明の発明者らは、肝臓、前立腺などの臓器の結合組織が分解しているヒトの血清中に、著しく高い濃度のＹＫＬ−４０が出現することを測定した。したがって、この明細書で述べている生体試科中のＹＫＬ−４０の濃度を検出し定量する方法は、関節疾患のみならず癌細胞の転移の経過を示す手段を提供する。さらに、ＹＫＬ−４０の血清中濃度と結合組織の代謝との明らかな関係に基づいて、上記の方法は、結合組織の代謝が役割を演じる、例えば骨粗しょう症のような他の疾患の診断と監視を行うのに有用であろうと予測することができる。発明の概要疾患の活性を結合組織マトリックスの損失および／または合成に関連づけることができる疾患の指標を検出し定量することは、疾患とその改善の両方の経過を診断し監視するのに有益である。その指標の一つが約４０ｋＤの分子量を有するタンパク質のＹＫＬ−４０であり、このタンパク質は、関節疾患のヒト患者の血液と滑液中ならびに乳癌または肝臓などの臓器の障害がみられるヒト患者の血液中の濃度が高いことが発見されたのである。これらの症状の共通点は、それらの結合組織の損失に対する関係である。具体的に述べると、関節疾患での結合組織の損失は、その疾患の過程で放出される酵素によって分解されることが原因である。癌細胞の転移の場合は、血管壁およびおそらく身体臓器の結合組織が分解して原発癌組織から細胞が移動できるようになると考えられる。同様に、硬変症のような臓器の退行変性疾患における臓器組織の損失の場合は、その臓器内の結合組織も分解されていると考えられる。したがって、この発明の目的は、ＹＫＬ−４０に対して特異的な抗体、および適切な場合には検出可能に標識をつけた抗原（ＹＫＬ−４０）、を用いて生体試科中のＹＫＬ−４０を検出し定量する方法を提供するものである。この発明の他の目的は、生体試科中に検出されるＹＫＬ−４０の濃度によって示されているような結合組織の損失および／または合成に関連する疾患の診断方法を提供することである。この点について、この発明は、関節疾患（例えばＲＡ）、癌細胞の転移（例えば、乳癌の場合における）、骨の結合組織の損失に関連する疾患（例えば、骨粗しょう症および骨関節症）、ならびに臓器の結合組織および／または他の組織の損失に関連する疾患（例えば肝硬変）を診断するのに、特に有用であると考えられる。この発明の他の目的は、ＹＫＬ−４０の濃度を定量して、ＹＫＬ−４０の存在に関連する結合組織の代謝に関係がある疾患の経過および／または改善を監視する方法を提供することである。やはり、この発明は、関節疾患（例えばＲＡ）、癌細胞の転移（例えば、乳癌の場合）、骨粗しょう症、骨関節症などの骨の結合組織の損失に関連する疾患、および臓器の結合組織の損失をもたらす例えば肝硬変のような疾患の経過および／または改善を追跡するのに、特に有用であると考えられる。図面の簡単な説明図１は、実質的に純粋な血清ＹＫＬ−４０の、ゲル濾過カラムの溶出位置を示す。図２は、炎症性リウマチ関節疾患がみられるヒト患者から採集した生体試科（血清と滑液）中のＹＫＬ−４０を放射線免疫検定法で測定した結果を示す。精製されたＹＫＬ−４０を●印で示す。健康人のＹＫＬ−４０の血清中濃度を○で示し、リウマチ様関節炎の患者由来の血清中のＹＫＬ−４０の濃度を△印で示し、そしてリウマチ様関節炎の患者の滑液中のＹＫＬ−４０の濃度を□印で示す。図３は、関節疾患にかかっていると診断されたヒト患者から採集した血清中のＹＫＬ−４０および関節疾患の他の生化学的指標の検定結果を示す。図４（ａ）〜（ｂ）は、ＲＡに対するメチルプレドニソロン（ＭＰ）による治療の効果についての１年間の研究結果における５７名の活性ＲＡの患者の血清中ＹＫＬ−４０と血清中ヒアルロナンの濃度の変化を示す。ＭＰによる治療を受けた患者は図中に●印で示し、一方、対照群の患者はプラシーボ（偽薬）を投与された（○印で示す）。全ての患者がペニシラミンまたはアザチオプリンを投与されていた。図５（ａ）〜（ｂ）は、ＲＡに対するメチルプレドニソロン（ＭＰ）による治療の効果についての１年間の研究期間における５７名の活性ＲＡの患者の血清中ＹＫＬ−４０と血清中ヒアルロナンの濃度の変化を示す。ＭＰによる治療を受けた患者は図中●印で示し、一方、対照群の患者はプラシーボ投与された（○印で示す）。全ての患者がペニシラミンまたはアザチオプリンを投与されていた。各被検者について、最初の濃度を１００％とし、その後の値は全て各々の最初の値の百分率で表した。図６は、その癌が再発し転移した後の乳癌患者６０名（年齢２９〜７８歳）について測定したＹＫＬ−４０血清中濃度を、各患者がその後に生存した期間の長さとの関係を示す。カプラン・メイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存曲線を示す。図７は、年齢が２０〜２９歳の１３７名の疾患なしの女性由来の血清と滑液中に検出されたＹＫＬ−４０の濃度を示す。図８は、乳癌患者のＹＫＬ−４０の血清中濃度（図６について述べたのと同様にして測定）を同定し、そして各患者がその後その疾患が原因で死亡した時を示すグラフである。これらのデータは、患者が満たした、この試験に入れるための選択基準（実施例ＶＩＩＩに記載されている）に従って確認されている。●または○印＝選択基準＃１を満たしている患者、□または■＝乳癌が再発していない患者、×＝選択基準＃２を満たしている患者、および／または△＝選択基準＃３を満たしている患者。白抜きと×の記号は、記録した時点でなお生存している患者を示し、黒ぬりの記号は、記録した時点で死亡していた患者を示す。図９は、乳癌の転移の主要部位（転移が起こっている場合）に関連する再発性転移乳癌に関する試験で、患者の血清中に検出されたＹＫＬ−４０の濃度を示す。これらのデータは、患者が満たした、この試験に入れるための選択基準（実施例ＶＩＩＩに記載されている）にしたがって確認されている。●＝選択基準＃１を満たしている患者、□＝乳ガンが再発していない患者、×＝選択基準＃２を満たしている患者、および＝選択基準＃３を満たしている患者。図１０は、骨への転移はあるが内臓は癌におかされていない再発性乳癌に関する試験で、患者の血清中に検出されたＹＫＬ−４０の濃度を示す。これらのデータは、患者が満たした、この試験に入れるための選択基準（実施例ＶＩＩＩに記載されている）にしたがって確認されている。●＝選択基準＃１を満たしている患者、□＝乳癌が再発していない患者、×＝選択基準＃２を満たしている患者、および＝選択基準＃３を満たしている患者。発明の詳細な説明Ａ．定義以下の定義は、この発明の考案を簡単にするため提供するものである。したがって、これらの定義がこの発明を限定しているとみなすべきではなく、この発明は、後述の特許請求の範囲によって範囲が定義される。１．「抗体」としては、ＹＫＬ−４０タンパク質のエピトープ決定因子を捕捉することができるＦａｂおよびＦ（ａｂ′）₂などの無傷の分子とそのフラグメントが含まれる。２．「抗原」（この発明の検定法に関連して使用される場合）は、ＹＫＬ−４０タンパク質および／またはその免疫原性ペプチドフラグメントを意味する。ＹＫＬ−４０の遺伝子の全コーディング領域は、配列番号：４として記載してある。この発明には、ＹＫＬ−４０タンパク質とその免疫原性ペプチドフラグメントが含まれると解される。３．「哺乳類」という用語には、この明細書で用いる場合、ヒトおよび非ヒトの両者が含まれる。４．「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体を意味する。５．「実質的に純粋の」という用語は、ＹＫＬ−４０を説明するのに用いる場合、ＹＫＬ−４０とともに天然に見出される他の分子を特に含有していない実質的に無傷の分子を意味する。６．「疾患状態」は、哺乳類の疾病または損傷を意味する。７．哺乳類の疾患状態でのＹＫＬ−４０の役割に関する「関連する」という用語は、哺乳類の組織または体液中へのＹＫＬ−４０の放出を意味し、その放出は疾患状態中またはその開始時に、疾患状態が開始すなわち発生した結果起こる。９．「改善する」という用語は、疾患状態の寛解または治癒を含めて疾患状態の重症度または悪化が軽減することを意味する。１０．ＹＫＬ−４０を「含有する」結合組織は、分泌されたＹＫＬ−４０が作用しているかまたはＹＫＬ−４０が分泌されている結合組織を意味する。Ｂ．ＹＫＬ−４０の単離と精製この発明の方法によるすべての検定法に用いる抗体およびこの発明の方法による競合検定法に用いる抗原を生成させるために、ＹＫＬ−４０は、好ましくは実質的に純粋の形態で生体試料から得るかまたは合成しなければならない。天然のＹＫＬ−４０は、ＹＫＬ−４０が存在していることが知られている任意の哺乳類の体液または組織から得ることができる。ＹＫＬ−４０の哺乳類中への自然の分布はまだ完全に分かっていないが、ＹＫＬ−４０は、血清、滑液、および軟骨細胞と骨肉腫細胞（ＭＧ６３細胞系、米国、メリーランド州、ロックビル所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［「ＡＴＣＣ」］）のならし培地の中に発見されている。ノーザンブロット分析法によって、ＹＫＬ−４０のｍＲＮＡが、肝臓では高レベルで、脳、腎臓および胎盤では弱く、ならびに心臓、肺および骨格筋では検出不能のレベルで発現されていることが分かっている（Ｈａｋａｌａ他の論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２６８巻、２５８０３〜２５８１０頁、１９９３年）。ならし培地は、好ましくはＲＰＭＩ１６４０血清なし培地（米国、カリフォルニア州、アービン所在のＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、当該技術分野で公知の方法にしたがってＹＫＬ−４０産生細胞を培養することによって調製することができる。ＹＫＬ−４０は、当該技術分野で公知の方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィまたはゲル濾過法（例えば、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ所在のＰｈａｒｍａｃｉａ社から入手できるＳＥＰＨＡＣＲＹＬＳ−２００−ＨＲ樹脂を使用）などによって精製される。ＹＫＬ−４０は、分子量が約４０ｋＤである。そのＮ末端のアミノ酸配列は、配列番号：１として挙げた配列に示してある。ＹＫＬ−４０の遺伝子の全コーディング領域は、配列番号：４に入っている。そのＮ末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列（内部アミノ酸配列は、配列番号：２（「ＹＫＬ−４０ペプチドＡ」）と配列番号：３（「ＹＫＬ−４０ペプチドＢ」）に示してある）が、細菌の多糖ヒドロラーゼ（キチナーゼ）と実質的に相同であることは、ＹＫＬ−４０が結合組織の多糖成分を分解するという結論を裏付けている。具体的に述べると、配列番号：２は、キチナーゼの内部アミノ酸配列の１４／１９残基と相関関係があり、一方ＹＫＬ−４０のＮ末端の配列の残基の約５０％がキチナーゼのＮ末端配列（配列番号：３）と相関関係がある。また、ＹＫＬ−４０は、活性化されたマウスマクロファージ（ＰＩＲ受託番号第Ｓ２７８７９号）が分泌するタンパク質と実質的に同じ配列を有している。配列の整列状態にいくらか差があるが、ＹＫＬ−４０の完全な３８３個の残基の配列（受託番号第Ｍ８０９２７号、配列番号：４を参照）の２６〜３５９位の残基と、５０５個の残基のマクロファージ分泌タンパク質の２７〜３６９位の残基との間に、１４２個の同一性がある。ＹＫＬ−４０が所定の疾患状態で機能する機構についての特定の理論によってこの発明は限定されないが、上記の配列の同一性は、ＹＫＬ−４０が、細胞の細胞外環境中のまだ同定されていない巨大分子のグリコシド結合を加水分解する酵素であることを強く示唆している。キチン自体は、脊椎動物中に発見されておらず、かつＹＫＬ−４０は、明らかにキチナーゼ活性をもっていないので、恐らく、先祖のキチナーゼが分岐進化して脊椎動物の酵素の特異性が変化し、その結果現在はキチナーゼが標的としているのとは異なるグリコシド結合を開裂するのであろう。健康な結合組織中で、ＹＫＬ−４０は、組織を正常に改造する役割を果たしている。結合組織の分解性疾患に冒されているヒトの血清と滑液の中に以下に述べるように検出されるＹＫＬ−４０が著しく増大しかつ健康な細胞中にはＹＫＬ− ４０は明らかに存在しないことから、ＹＫＬ−４０に関連する疾患でのＹＫＬ− ４０の産生および／または分泌は、未知の疾患の過程によって異常なレベルまで上昇すると考えられる。したがって、ＹＫＬ−４０は、単に分解された結合組織の構造成分ではなくて、疾患の過程で活発な役割を演じる細胞産物のようである。したがって、分泌されたＹＫＬ−４０が作用するかまたはＹＫＬ−４０が分泌される結合組織は、便宜上、この明細書ではＹＫＬ−４０「含有」結合組織と呼ぶ。この発明の検定法に用いるＹＫＬ−４０とその免疫原性フラグメントは、当該技術分野で公知の方法によって合成することもできる。従来の技術を利用し、全長の遺伝子を当該技術分野で公知の適切な発現ベクターを使用して発現させることができるし、または該ペプチドを、ＹＫＬ−４０に対する導出アミノ酸配列に相当するアミノ酸を用いて化学的に構築することができる。例えば、ＹＫＬ−４０は、過度の実験を行うことなく、α−アミノ基をｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣなどで保護する通常使用されている方法で合成することができる。両方の方法では、単一のアミノ酸がペプチドのＣ末端から出発して各ステップで付加され段階的に合成が行われる（Ｃｏｌｉｇａｎ他の論文、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、９９１、Ｕｎｉｔ９参照）。この発明のペプチド類は、０．１〜１．０ｍＭｏｌのアミン類／ｇポリマーを含有するスチレン− ジビニルベンゼン共重合体を用いて、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第８５巻、２１４９頁、１９６２年、およびＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇの論文、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅｓＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコ、２７〜６２頁、１９６９年）などに記載されている各種の公知の固相ペプチド合成法によっても合成できる。この後著の方法では、化学合成が完了したとき、ペプチドは脱保護し、次いで液体ＨＦ−１０％アニソールで約１５分間〜１時間０℃で処理してポリマーから間裂させることができる。試薬類を蒸発させた後、１％酢酸溶液を用いてペプチドをポリマーから抽出し、次いで凍結乾燥して粗製物を得る。この粗製物は、通常、例えば、溶媒として５％の酢酸を用いるＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５のゲル濾過法のような方法で精製することができる。カラムの適当な画分を凍結乾燥して均質のペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、次にこれらは、アミノ酸分析法、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、溶解度などの標準の方法によって特性を決定し、次いで固相エドマン分解法によって定量することができる。また、ＹＫＬ−４０およびＹＫＬ−４０ペプチド類を製造するのに用いるＤＮＡ配列は、いくつもの方法で得ることができる。例えば、そのＤＮＡは、該技術分野で公知のハイブリッド形成法を用いて単離することができる。これらの方法としては、限定されないが、次の方法がある。すなわち、１）プローブを、ゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーとハイブリッドを形成させて共有されているヌクレオチド配列を検出する方法、２）発現ライブラリーを抗体で選別して共有されている構造の特徴を検出する方法、および３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で合成する方法である。ハイブリッド形成法は、各プローブが潜在的に、変性二本鎖ＤＮＡの不均質混合物を含有しているハイブリッド形成試料中の特定のＤＮＡ配列の完全な相補体である場合、標識をつけた混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、組換えクローンを選別するのに有用である。このような選別の場合、ハイブリッド形成は、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡについて行うことが好ましい。ハイブリッド形成法は、問題のポリペプチドに関連するｍＲＮＡ配列の量が極端に少ない起源から誘導されたｃＤＮＡクトーンを検出するのに特に有用である。換言すれば、非特異的結合を避けるために誘導したストリンジエントハイブリッド形成条件（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、１９８４年）を用いることによって、例えば、標的ＤＮＡに混合物中の単一のプローブとハイブリッドを形成させることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィで視覚化することができる。ＹＫＬ−４０含有ｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡから誘導された各種のｍＲＮＡを卵母細胞中に注射し、充分な時間をかけてそのｃＤＮＡ遺伝子産物を発現させ、次いで、例えば、ＹＫＬ−４０に対して特異的な抗体を用いるか、または繰り返しモチーフのプローブとＹＫＬ−４０に特徴的な組織発現パターンとを用いることによって、所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を試験することによって選別することができる。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いて、少なくとも一つのエピトープを有するＹＫＬ−４０について間接的に選別することができる。下記のＣ章で述べるように、このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体として誘導することが可能であり、ＹＫＬ−４０ｃＤＮＡ（配列番号：４参照）の存在を示す発現産物を検出するのに用いることができる。適当なプローブが入手できるならば、核酸ハイブリッド形成法による選別法によって任意の生物から任意の遺伝子配列を単離することができる。問題のタンパク質をコードする配列の一部分に相当するオリゴヌクレオチドのプローブは、化学合成することができる。これを行うには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが分かっていなければならないということが要求される。そのタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列は、その遺伝コードから導出できるが、そのコードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重している場合、混合付加反応を行うことができる。これには、変性二本鎖ＤＮＡの不均一混合物が含まれている。このような選別の場合、ハイブリッド形成は、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡについて実施することが好ましい。また、ＹＫＬ−４０またはそのフラグメントをエンコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ配列を単離し、次いで２）目的とするペプチドに対して必要なコドンを提供するＤＮＡ配列を化学的に製造する、ことによって得ることができる。ＹＫＬ−４０をエンコードする遺伝子は、組換え発現ベクター中に挿入することができる。用語「組換え発現ベクター」は、適当な遺伝配列の挿入もしくは組み込みによって操作された、当該技術分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の伝達体を意味する。この発現ベクターは、宿主の挿入された遺伝配列を有効に転写できるようにするプロモータ配列を含有している。宿主細胞の組換えＤＮＡによる形質転換も、当該技術分野の当業者に公知の通常の方法で実施できる。宿主がイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核生物の場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞は、指数的成長相で培養したのち収穫し、次に当該技術分野で公知の手順によってＣａＣｌ₂法で処理した細胞から製造することができる。あるいは、ＭｇＣｌ₂またはＲｂＣｌを使用することができる。また、形質転換は、その宿主細胞に対する原形質を調製した後、またはエレクトロポレーションで実施することができる。この発明によって提供される、微生物が発現したポリペプチドまたはそのフラグメントの単離と精製は、分離クロマトグラフィおよびモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を用いる免疫分離法を含む通常の方法で実施することができる。この発明のペプチド類とポリペプチド類には、ＹＫＬ−４０、ＹＫＬ−４０ペプチドおよびそれをエンコードするヌクレオチドの機能誘導体が含まれる。「機能誘導体」という用語は、ある分子の「フラグメント」、「変異体」、「類似体」または「化学的誘導体」を意味する。この発明の任意のＤＮＡ配列のような分子の「フラグメント」には、その分子の任意のヌクレオチドのサブセットが含まれる。かような分子の「変異体」は、完全な分子またはそのフラグメントに実質的に類似している天然産生分子を意味する。分子の「類似体」は、完全な分子またはそのフラグメントに実質的に類似している非天然産分子を意味する。両者の分子のアミノ酸配列が実質的に同じであれば、その一方の分子はもう一つの分子に「実質的に類似している」といわれる。実質的に類似のアミノ酸分子は類似の生物活性を有している。したがって、２種の分子が類似の活性を有している場合、その分子の一方が他方の分子に見られない追加のアミノ酸残基を含有していても、またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、上記用語をこの明細書で用いるときは、両者の分子は変異体とみなす。さらに、ある分子が、通常はその分子の部分ではない追加の化学的部分を含有している場合、別の分子の「化学的誘導体」といわれる。このような部分によって、その分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善することができる。あるいは、これらの部分によって、その分子の毒性を減少させたり、その分子の望ましくない副作用を除くかもしくは少なくするなど、実施することができる。上記のような作用を実現できる部分は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．社（米国、ペンシルバニア州、イーストン所在）、１９８０年に開示されている。ＹＫＬ−４０の一次アミノ酸配列の小さな改変（修飾）を行うと、この明細書に記載のＹＫＬ−４０ペプチドと比べて実質的に類似の活性を有するタンパク質とペプチドが得られる。このような改変は、部位特異的突然変異誘発によって行うような意図的なものであってもよく、または自然発生的なものでもよい。これらの改変によって産生されるペプチドは、全て、ＹＫＬ−４０の生物活性が存在している限り、この発明に含まれる。さらに、一つ以上のアミノ酸を欠失させて、その生物活性を大きく変えることなく生成分子の構造を改変することができる。この方法によって、一層広い用途を有する小さな活性分子を生成させることができる。例えば、酵素が望ましい触媒活性または抗原活性を発揮するのに必要でない、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のアミノ酸を除くことができる。Ｃ．ＹＫＬ−４０に対する抗体ポリモノクローナルまたはモノクローナルの抗体を、下記のこの発明の免疫検定法と治療法に用いることができる。実質的に純粋なＹＫＬ−４０または抗原性ＹＫＬ−４０ペプチドを適切な非ヒト哺乳類に、複数回、皮下または筋肉内に注射することによってポリクローナル抗体を生成させることができる。ＹＫＬ−４０ペプチドの抗原性は、そのペプチドで免疫化された動物の抗体応答の大きさを測定する通常の方法で測定することができる。一般に、抗ＹＫＬ−４０抗体を生成させるために用いられるＹＫＬ−４０ペプチドは、ＹＫＬ−４０に対して比較的高い親和性を有する高力価の抗体の産生を誘発するＹＫＬ−４０ペプチドでなければならない。所望により、免疫化を行うペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて、接合によって担体タンパク質に連結してもよい。ペプチドに化学的に連結される、このような通常用いられる担体としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風毒素がある。その連結されたペプチドは、動物（例えば、マウスまたはウサギ）を免疫化するのに用いられる。ＹＫＬ−４０は、哺乳類の種に保存することができるので、ＹＫＬ−４０タンパク質の免疫原性を高めるため担体タンパク質を使用することが好ましい。次に、上記哺乳類から採取した血液から抗体を得る。ポリクローナル抗体を生成させるのに用いる方法は、当該技術分野では公知である（例えば、Ｌａｎｇｏｎｅ他編集、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，「ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｓｅｒａＷｉｔｈＳｍａｌｌＤｏｓｅｓｏｆＩｍｍｕｎｏｇｅｎ：ＭｕｌｔｉｐｌｅＩｎｔｒａｄｅｒｍａｌＩｎｊｅｃｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ社、１９８１年参照）。動物から産生されたポリクローナル抗体は、例えば、その抗体が生成したペプチドが結合されているマトリックスに結合させ、次いでそのマトリックスから溶離することによって、さらに精製することができる。当該技術分野の当業者にとって、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮に用いる免疫学的技術に共通の各種の方法は、公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ他の論文、Ｕｎｉｔ９、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年参照）。しかし、産生されるＹＫＬ−４０の抗体は、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）が好ましい。モノクローナル抗体を製造する場合は、マウスまたはラットを免疫化することが好ましい。「抗体」という用語には、この発明で用いられる場合、エピトープ決定因子を捕捉できるＦａｂおよびＦ（ａｂ´）₂などの無傷の分子とそのフラグメントが含まれる。また、この明細書では、用語「この発明のｍＡｂ」は、ＹＫＬ−４０に対して特異性を有するモノクローナル抗体を意味する。ｍＡｂを分泌するハイブリッドーマを製造するのに用いる一般的な方法は、公知である（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの論文、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁、１９７５年）。要約すると、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが報告しているように、その方法は、黒色腫、奇形癌、または子宮頚、グリオームもしくは肺の癌がみられる５名の別個の患者の部位ドレーニングリンパ節（ｒｅｇｉｏｎａｌｄｒａｉｎｉｎｇｌｙｍｐｈｎｏｄｅ）からリンパ球を単離し（試料は外科試料から得た）、細胞をプールし、その細胞をＳＨＦＰ −１と融合させることで構成されている。癌細胞系に結合する抗体を産生するハイブリッドーマを選別した。ｍＡｂのＹＫＬ−４０特異性の確認は、比較的日常的な選別法（例えば酵素結合イムノソルベント検定法、すなわち「ＥＬＩＳＡ」法）を用いて、問題のｍＡｂの基本的な反応パターンを測定することによって実施することができる。また、ｍＡｂを評価するため、被検ｍＡｂがこの発明のｍＡｂが上記のようにして単離されたＹＫＬ−４０に結合するのを妨げるか否かを測定することによって、過度に実験を行わずに被検ｍＡｂがこの発明のｍＡｂと同じ特異性を有するか否かを測定することも可能である。被検ｍＡｂがこの発明のｍＡｂと競合する場合（この発明のｍＡｂによる結合の際に減少することによって示される）は、その２種のモノクローナル抗体は同じかまたは密接な類縁関係にあるエピトープに結合するようである。あるｍＡｂがこの発明のｍＡｂの特異性を有しているか否かを測定するさらに別の方法は、この発明のｍＡｂを、このｍＡｂが一般に反応する抗原とともにプリインキュベートし、次いで被検ｍＡｂが、抗原を捕捉する性能を阻害されるか否かを測定する方法である。被検ｍＡｂが阻害されたならば、おそらく被検ｍＡｂはこの発明のｍＡｂと同じかまたは密接な類縁関係にあるエピトープ特異性を有している。Ｄ．免疫検定法使用される免疫検定法は、疾患がみられる患者のＹＫＬ−４０の濃度が、健康なヒトに存在している正常な濃度および／または患者について測定されたバックグラウンド濃度から区別できるよう定量的でなければならない。したがって、検出可能な標識を用いる固相の競合サンドイッチ法（間接法または直接法）が好ましい。この標識は、抗体のＹＫＬ−４０抗原への結合を示す検出可能なシグナルを提供する。この抗体または抗原は、放射性同位元素、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およびコロイド金を含む、検出可能なシグナルを提供する当該技術分野で公知の任意の標識で標識を付けることができる。公知の検定法の中で、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）がその感度からみて最も好ましい。したがって、放射性同位元素が好ましい標識である。抗体に直接結合させることができるかまたはＹＫＬ−４０抗原に間接的に結合させることができる金属イオンの列は、当該技術分野の当業者にとって公知であり、¹²⁵Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、⁹⁰Ｙおよび²⁰ ¹ Ｔｌがある。抗原結合特異性を犠牲にすることなく結合が容易なことから好ましいのは、¹²⁵Ｉ（ナトリウム塩、英国、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）である。ＹＫＬ −４０に¹²⁵Ｉで標識をつけることは、Ｓａｌａｃｉｎｓｋｉ他の論文、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１７巻、１３６〜１４６頁、１９８１年に記載されている方法で行うことができる。¹²⁵Ｉの標識をつけるのに用いるヨードジェン（ｉｏｄｏｇｅｎ）（１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェニルグリコルリル）は、英国、チェスター所在のＰｉｅｒｃｅａｎｄＷａｒｒｉｎｅｒ社から市販されている。この発明の放射線免疫検定法は、実質的に等しい容積のＹＫＬ−４０抗血清とＹＫＬ−４０トレーサとともにインキュベートした基準また試料を使用する。標準と試料は、一般に２回ずつ検定する。この発明の検定法の感度（検出限界）は、約１０μｇ／Ｌである。この文脈において、感度は、ゼロ結合値（ｚｅｒｏｂｉｎｄｉｎｇｖａｌｕｅ）の標準偏差の２倍に等しい検出可能な質量と定義する。標準曲線は、一般に２０〜１００ μｇ／Ｌの範囲で直線である。以下の実施例で説明する検定法の検定内および検定間の変動係数は、それぞれ＜６．５％と＜１２％である。放射線同位元素以外の標識を用いる検定法は、必ずしもＲＩＡほどに鋭敏ではないが、特定の利点があるので、好ましいＲＩＡ法の代替法として使用できることが、当該技術分野の当業者であれば分かるであろう。例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ法）は、ＥＬＩＳＡ微量滴定リーダーと、多数の研究所および臨床研究所で容易に入手できる試薬を使用して容易に自動化することが出る。蛍光、化学発光および生物発光の標識は、視覚で検出できる利点があるが、抗体によって補足される抗原の量を検定法で定量するには放射性同位元素ほど有用ではない。さらに、当該技術分野の当業者にとって分かっていることであるが、生体試料中のＹＫＬ−４０の存在を検出し定量するのに免疫検定法以外の方法を使用できる。例えば、ＹＫＬ−４０をエンコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による定量プロトコルを用いて検出することができる。定量ＰＣＲ法を実施するのに好ましい方法は、標的ＹＫＬ−４０遺伝子鋳型とは配列または大きさが異なる競合体になる、変位を誘発された一つ以上の塩基対を含有する競合体鋳型を用いて行う競合ＰＣＲ法である。生成するＰＣＲ産物の一本鎖（通常はアンチセンスストランド）が、適切な反応物にしっかり結合された固相支持体に、アミノ−カルボキシル、アミノ−アミノ、ビオチン−ストレプタビジンなどを経由して適切にしっかり結合されて固定化されるように、プライマーのうちの一つはビオチニル化されるかまたは好ましくはアミノ化される。ＰＣＲ産物、固相支持体および反応物間の結合が共有結合であると、その結合の変性条件下での切断に対する耐性の信頼性が高くなるので最も好ましい。ＰＣＲ産物のアミノ化またはビオチニル化されたストランドが一旦固定化されると、結合されていない相補ストランドは、アルカリ性変性洗浄で分離され、反応環境から除去される。標的および競合体の核酸に対応する配列特異的オリゴヌクレオチド（「ＳＳＯ」）は、検出標識で標識をつける。次に、このＳＳＯは、上記の除去された結合されていないセンスストランドの競合なしで、上記アンチセンスストランドとハイブリッドを形成させる。過当な検定試薬を添加し、使用された検出標識と固相支持手段に適当なＥＬＩＳＡ測定手段、好ましくはＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーによって、ハイブリッド形成度を測定する。標的と競合体の鋳型を含む鋳型を増幅するＰＣＲ反応から別個に誘導した標準曲線を用い、上記の測定値を比較して標的核酸の含有量を求めた。この方法は、定量的であり、ＰＣＲのサイクルに左右されず、かつＳＳＯプローブと、ＰＣＲ産物の相補ストランドとの競合による影響を受けない点が有利である。あるいは、重合ステップの一部とハイブリッド形成ステップの全てを固相支持体上で実施してもよい。この方法では、ヌクレオチド重合プライマー（好ましくはオリゴヌクレオチド）がＰＣＲ産物のストランドではなくて固相支持体に捕捉される。標的と競合体核酸ＰＣＲ産物を溶解して固相支持体に添加して、次いで重合ステップを実施する。重合産物の結合されていないセンスストランドを前記変性条件下で除去する。標的対競合核酸の比率は、適当な測定手段（好ましくはＥＬＩＳＡリーダー）と上記標準曲線を用いて、標識をつけたオリゴヌクレオチドＳＳＯプローブを検出することによって求めることができる。この方法の効率は、非常に大きいので、重合ステップの連鎖反応が不必要になり、その結果、この方法を実施するのに要する時間が短くなる。最終の重合産物は、ハイブリッドを形成するために反応管から固相支持体に移す必要がないので、損失もしくは損傷する可能性が制約されるから、この方法の正確さは高くなる。しかし、特別の試料の場合必要ならば、ＰＣＲを使用して別個の反応管内で標的と競合体の核酸を増幅し、次いで最終の重合反応を固相支持体上で実施してもよい。当該技術分野の当業者にとって公知の、結合したＰＣＲ産物が生々しているのを示す異なる検出可能なシグナルを提供できる分子（例えば、標的と競合体ＰＣＲ産物の生成を示す異なる色を呈する標識ヌクレオチドクロモソーム）を、その反応の最後の数サイクル中に反応溶液に添加してもよい。また、標的対競合体核酸の比率は、ＥＬＩＳＡ法などの適当な測定手段および免疫化ハイブリッド形成プライマーの３’末端に連結された検出標識に対して反応性の試薬を用いて求めることができる。また、この方法は、従来の非競合ＰＣＲのプロトコルを実施することによって、特別の遺伝子が試料中に存在しているか否かを（遺伝子を定量することなく）検出するのに適用することもできる。当該技術分野の当業者であれば、上記の方法に用いるのに適したプライマーを選択する方法を知っているかまたは容易に確認できるであろう。上記方法についてのさらに詳細な事項は、以下の文献の開示事項を参照して得ることができる。すなわち、Ｋｏｈｓａｋａ他の論文、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２１巻、３４６９〜３４７２頁、１９９３年、Ｂｕｎｎ他の米国特許第５，２１３，９６１号、およびＩｎｎｉｓ他の論文、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ社、１９９０年である。なお、これら文献の開示事項は、単に、定量ＰＣＲプロトコルについての現在の技術水準を示す目的で本明細書に援用するものである。Ｅ．診断への応用以下の実施例に示すように、ＹＫＬ−４０の濃度の測定値に基づいた疾患の診断は、疾患がみられない対照グループで測定した濃度または特別の患者で測定したバックグラウンド濃度と比較することによって行うことができる。その診断は、検定結果と、下記の実施例に記載されているＲＡと乳癌の診断基準のような、臨床技術分野の熟練者に知られている疾患の他の兆候とを関連づけることによって確認することができる。疾患（例えば、ＲＡ）の改善をＹＫＬ−４０の濃度の減少（および付随する軟骨の修復）に関連づけることができる場合、患者から採取した生体検定試料（例えば、滑液）中のＹＫＬ−４０濃度は、治療を行う前（バックグラウンドを求めるため）および治療中定期的に測定しなければならない。ＹＫＬ−４０の濃度の減少が一過性であることがあるから、検定は各治療の直前と各治療の後の時間間隔をおいて（例えば４週間毎に）行うことが好ましい。治療の過程、腫瘍の荷重（ｔｕｍｏｒｌｏａｄ）などの臨床上の変数によって、当該技術分野の熟練医師は、診断または疾患治療の監視を目的とする検定の適当な実施計画を決定することができる。場合によっては、血清のＹＫＬ−４０が問題の組織以外の起源から生じることがあるので、試料は、できれば問題の組織化ら採取すべきである。例えば、関節疾患を診断または監視する場合、検定試料は、冒されているかまたは冒された可能性がある関節の滑液から抜き取ることが好ましい。しかし、腫瘍の転移を診断し監視する場合は、検定試料の好ましい起源は、血液である。当該技術分野の当業者であれば、ＹＫＬ−４０が指標である特別の疾患を診断するために用いるのにどの検定試料の起源が最も適当であるかを容易に決定することができるであろう。特別の疾患の発現または改善を示すＹＫＬ−４０の濃度は、疾患によって変化し、また、変化の程度は小さいが、患者によって変化する。しかし、一般に、実施例に提供したデータが示しているが、７３６名の子供と成人の試料グループ由来の血清中に検出されたＹＫＬ−４０の濃度の中央値は、子供（６〜１７歳）の場合８０μｇ／ｌであり、成人（２０〜７９歳）の場合は１０２μｇ／ｌであった。子供または６９歳より若い成人の異なる年齢グループ間で、これらの数値に統計的に有意な変化は全く認められなかった。しかし、６９歳を超える成人は、ＹＫＬ−４０の血清中濃度が６９歳より若い成人より高い傾向がみられた。したがって、疾患の発症、悪化または改善を診断するのに利用する、問題のＹＫＬ− ４０の濃度の変化は、正常集団（すなわち健康集団）とは統計的に有意な濃度差があり、かつ問題の疾患にかかわっている臨床技術分野の熟練者にとって公知の疾患の発生および／または改善の他の臨床兆候に相関関係がある変化である（すなわち診断を行うのに有意な濃度のＹＫＬ−４０）。例えば、炎症性関節疾患の場合、ＹＫＬ−４０の滑液中濃度は、関節疾患の他の生化学的指標、特に滑液中のプロテオグリカンとコラーゲンの分解に対する単球およびマクロファージによるエラストライティック（ｅｌａｓｔｏｌｙｔｉｃ）活性に関連づけることができる。また、ＹＫＬ−４０の濃度は、滑液中の高くなったＩＬ−６の濃度と良好な相関関係がある。ＩＬ−６は、軟骨細胞と滑膜細胞によって分泌され、炎症を含む免疫応答を調節する働きを有する。炎症性および退行性の関節症の患者の滑液中に、比較的高い濃度のＩＬ−８がみられる。いくぶん程度は低いが、ＹＫＬ−４０の濃度と急性Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度の間にも相関関係がある。ＣＲＰは、リウマチ関節疾患の急性期に多量に存在し、炎症の場合に生物学的役割を演じているようである。ＹＫＬ−４０の濃度は、同様にＰ−ＩＩＩ−ＮＰの血清中濃度と相関関係があり、これは滑液中のＩＩＩ型コラーゲン代謝の局所的炎症変質を反映している。この発明は、特別の診断法に限定するものではないが、ＹＫＬ−４０の濃度の上記相関関係は、ＹＫＬ−４０の濃度が特に関節疾患の炎症を示すことを示唆している。もちろん、この発明の方法にしたがって行われたＹＫＬ−４０の測定で示されたいずれの診断結果も、臨床技術分野の当業者に公知の疾患の臨床兆候を参照して、独立して確認される。その他の例として、乳癌患者の場合、ＹＫＬ−４０の血清中濃度は、乳癌がない患者に比べて癌細胞の転移がみられる患者の方が高い。おそらく、血清中のＹＫＬ−４０の濃度が高くなるのは、少なくとも一部は、血液中への癌細胞の流入に対する結合障壁の退行が原因であろう。類似のプロセスに付随して癌細胞がリンパ循環系に流入すると考えられる。以下に示すデータによって実証されているように、ＹＫＬ−４０の血清中濃度の上昇が検出されたことは、局在部位、皮膚または孤立したリンパ腺に対してではなく内臓と骨への転移を示しているようである。しかし、前者の転移は、従来の健康診断でかなり容易に検出することができる。さらに、ＹＫＬ−４０の濃度の大きな上昇は、乳癌が転移によって再発した患者（特に骨および／または内臓への転移）の血清に出現する。年齢を釣り合わせた対照群のＹＫＬ−４０血清濃度の中央値（約１０２μｇ／ｌ）に比べて、骨への転移が確認された患者（骨は乳癌細胞が転移するもっとも普通の部位である）のＹＫＬ−４０血清中濃度の中央値は約３２８８μｇ／ｌであった。さらに、内臓への転移が確認された患者のＹＫＬ−４０血清中濃度の中央値は、約１５７μ ｇ／ｌであった。これとは対照的に、骨への転移に対して現在普通に使われている指標（血清の含アルカリ性ホスファターゼ、骨アルカリ性ホスファターゼおよび骨Ｇｌａタンパク質）は、転移性乳癌の患者の場合、著しい変動を示し、特に血清中の骨Ｇｌａタンパク質の増大は、乳癌の転移に対する診断には役立たないことが分かっている。興味深いことには、ＹＫＬ−４０血清中濃度の上昇は、各患者が癌の再発に続いて生存が期待できる月数と相関関係があり、特にＹＫＬ−４０血清中濃度が約１６４μｇ／ｌ以上の患者、さらに、わけてもＹＫＬ−４０血清中濃度が約２０７μｇ／ｌ（すなわち、「予後を行うのに有意な濃度」のＹＫＬ−４０）以上の患者にこの相関関係がある。一般に、ＹＫＬ−４０の濃度が高ければ高いほど、生存期間は短い。Ｆ．医薬選別の用途上記のように、ＹＫＬ−４０は、その産生が結合組織の退行に関連する疾患状態の過程が増大するが水分解酵素のようである。特に、ＹＫＬ−４０は、結合組織が修復されるより速く消化されるときその損失を起こす結合組織の消化に関与しているようである。したがって、ＹＫＬ−４０の産生および／または活性を阻害する薬剤は、論理的に結合組織の損失を制限すると期待できる上記の目的を達成するため、この発明のＹＫＬ−４０タンパク質、ペプチドおよび抗体は、ＹＫＬ−４０の潜在的なインヒビターを選別するのに有用である。ＹＫＬ−４０活性の潜在的なインヒビターとしては、ＹＫＬ−４０に競合して結合する基質分子およびＹＫＬ−４０に対して特異的な抗体がある。例えば、潜在的なＹＫＬ−４０基質分子は、この発明の実質的に純粋なＹＫＬ−４０をＹＫＬ−４０抗体に対して競合免疫検定法に用いて選別し、同定できる。しかし、当該技術ぶんやの当業者であれば、ＹＫＬ−４０に結合する基質分子は、結合の動力学、アフィニティーなどの他のパラメータを測定することによって特性を決定することができることは分かっているであろう。ある分子がＹＫＬ−４０を捕捉することが測定されたならば、他の潜在的基質分子は、ｍＡｂ類を、ＹＫＬ−４０に対する特異性で選別することについて先に述べたようにして、阻害および／または競合結合を試験することによって結合性について選別することができる。Ｇ．治療への応用ＹＫＬ−４０酵素活性の上記予測が正確であるとすれば、ＹＫＬ−４０基質分子および抗ＹＫＬ−４０抗体で阻害しおよび／またはＹＫＬ−４０を、医薬として許容される基質分子に対して競合結合させることによって弱める（つまり、ＹＫＬ−４０に対する宿主の応答例えば結合組織の消化を減少させる）ことができると期待される。上記目的を達成するため、所望の程度の純度を有するＹＫＬ−４０基質分子またはＹＫＬ−４０に対するアフィニティを所望の程度に持っている抗ＹＫＬ−４０抗体を、薬理学的に許容される担体と混合することによって、ＹＫＬ−４０基質分子または抗ＹＫＬ−４０の組成物を投与用に調製する。上記の担体は、利用される投与量および濃度では、受容者に対して非毒性である。このような組成物の製造は、通常、上記特定のタンパク質と以下のもの、すなわち緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量のポリペプチド（約１０個未満の残基）、タンパク質、アミノ酸、グルコースもしくはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート薬、グルタチオンなどの安定剤、および賦形剤を混合して行う。このような組成物は、凍結乾燥してもよく、医薬として許容される。すなわち、所望の用途に用いるため適切に調製され、認可される。関節疾患および退行性の臓器疾患（例えば、肝硬変）を治療する場合、ＹＫＬ −４０の活性は、全身ではなくて関節または臓器を標的とする方が好ましい。問題の関節または臓器に対する投与経路（例えば、注射、カテーテル挿入法など）は、臨床技術分野の熟練者にとって公知である。あるいは、患者の発現している症状と達成すべき治療目的によって熟練臨床医師が変更した投与量で腸または非経口の経路で投与してもよい。ＹＫＬ−４０の活性および／または産生のレベルは、治療すべき疾患状態に関連する結合組織の損失の臨床発現の低下を参照しながら上記の検定法で監視することができる。上記の結果を達成する投与量が、「治療上有効な」投与量とみなされる。しかし、一般に、ＹＫＬ−４０基質分子の投与量は、約１０単位／ｍ² 〜２０，０００単位／ｍ²の範囲で変化させ、好ましくは、約５０００〜６０００単位／ｍ²の範囲であり、１週間ごとに１回以上、１日ないしは数日間に亘って投与される。Ｈ．治療および診断の用途に用いるキットこの発明は、先に述べた診断試験と治療の用途に用いるキットを提供するものである。診断と試験の用途の場合、このキットには下記のものの全てまたは一部が入っている。すなわち、検定試薬、緩衝剤、ＹＫＬ−４０のタンパク質および／またはフラグメント、ＹＫＬ−４０組み替え発現ベクター、ＹＫＬ−４０のオリゴヌクレオチドと他のハイブリッド形成プローブおよび／またはプライマー、ＹＫＬ−４０基質分子、および／または適切な検定装置である。治療用製品には、凍結乾燥されたＹＫＬ−４０基質分子または抗ＹＫＬ−４０の懸濁液を再構成するのに用いる滅菌食塩水または他の医薬として許容される乳液および懸濁液のベース、ＹＫＬ−４０基質分子または抗ＹＫＬ−４０の組成物用の適切にラベルを付けて認可された容器、並びに上記の診断キットの要素とともに用いるこれら治療用製品を入れるキットが含まれる。ＹＫＬ−４０の濃度と、関節疾患活性、関節疾患の治療経過、臓器の分解、癌細胞の転移および癌細胞生存率との相関関係を示す実施例を以下に述べる。しかし、これらの実施例は、この発明を限定するとみなすべきではなく、この発明の範囲は、後記の特許請求の範囲によって定義される。実施例Ｉヒト骨肉腫細胞系ＭＧ６３からのＹＫＬ−４０の単離と精製ヒト骨肉腫細胞系ＭＧ６３の無血清のならし培地からＹＫＬ−４０を精製した（ＭＧ６３細胞は、米国、メリーランド州、ロックビル所在のAmerican Type Cu lture Collectionから入手した）。１０％の新生仔ウシ血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣおよび１μｇ／ｍｌのビタミンＫ₁を含有するＲＰＭＩ１６４０培地が入っている１００ｍｍのシャーレ内で細胞を培養した。その培養物は、１０％ＣＯ₂ 含有の加湿大気中で３７℃でインキュベートした。細胞が密集状態になったとき、培地を取り出し、次に細胞層を１０ミリリットル（ｍｌ）のリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した。５０μｇ／ｍｌのビタミンＣと１μｇ／ｍｌのビタミンＫ₁を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌを各シャーレに添加した。４８時間後、ならし培地を各シャーレからデカントし、次いで同じ濃度の添加成分を含有する新しい無血清培地１０ｍｌで置換した。この手順を１０日間４８時間ごとに繰り返した。ならし培地を遠心分離に付して細胞と残渣を除いて、使用するまで−２０℃で貯蔵した。 Nyrkos他の論文、Biochem．J．第２６９巻、２６５〜２６８頁、１９９０年に記載されているヘパリン・アフィニティ・クロマトグラフィ法の改変法を用いてＹＫＬ−４０を精製した。具体的に述べると、まず第一にＹＫＬ−４０を、室温で２時間攪拌することによって、ＨＥＰＡＲＩＮ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＣＬ− ６Ｂ樹脂（Pharmacia社から入手）４０ｍｌ（充填容積）に吸着させて、ならし培地４．７５Ｌから濃縮した。次に、この樹脂を２×２４ｃｍのカラムに入れ、次いで０．０５ＭのＮａＣｌの直線勾配液（各条件で２００ｍｌずつ）を用いてＹＫＬ−４０を室温で上記樹脂から溶離した。ＹＫＬ−４０の純度を確認するため、先に述べたＨＥＰＡＲＩＮ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＣＬ−６Ｂアフィニティ・クロマトグラフィ法から得たピーク画分の第三画分ごとに得た５μｌずつを、２５μｌのＳＤＳ負荷緩衝液と混合し、５〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲル（米国、カリフォルニア州、リッチモンド所在のBioRad，Laboratories社）の電気泳動に付し、次にクーマシーブリリアントブルーで染色した。この発明の検定法で標準およびトレーサとして使用する最終のＹＫＬ−４０の濃度は、ＹＫＬ−４０の溶液１ｍｌ当たり１ミリグラム（ｍｇ）に対して吸光度が１．４４であることに基づいている。関節軟骨は、死亡後１８時間以内の死体および骨関節症に対して関節置換を受けている患者の膝から入手し、当該技術分野で公知の方法に従い逐次酵素消化方で軟骨細胞を単離した。（例えば、Guerne他の論文、Ｊ.Immun.第１４４巻、４９９〜５０５頁、１９９０年を参照）。得られた細胞は、軟骨細胞の均一な集団であった。というのは、細胞の単離には軟骨の表層のみを用い、そして繊維芽細胞または滑膜細胞と異なり、その細胞は癒着性でなかったからである。その細胞を、１０％のウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを補充したＤＭＥＭ高グルコース培地（米国、カリフォルニア州、アービン所在のIrvin Sc ientific社）中で培養した。細胞は、３７℃で１０％ＣＯ２含有の加湿大気中、１７５ｃｍ²組織培養フラスコ（初代培養）または１００ｍｍのシャーレ（後記継代）で培養させた。集密単層をトリプシン処理した後、細胞を１：３の比率で継代培養を行った。分析に用いるならし培地を得るため、細胞が集密状態に到達した後、培地を取り出し、細胞の層を３０ｍｌ（１７５ｃｍ²フラスコ）または１０ｍｌ（１００ｍｍのシャーレ）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。次に、抗体および５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを含有する同容積の無血清ＤＭＥＭ高グルコース培地を４８時間後に取り出し、同容積の新しい無血清培地で代替した。この手順を１４日間４８時間ごとに繰り返した。ならし培地は、１６００×ｇで５分間、遠心分離に付して細胞と残渣を除いて、使用するまで−２０℃で凍結した。実施例ＩＩ放射線免疫検定法に用いる検定試料の調製１．検定試料の起源検定試料は、炎症例または退行性の関節疾患の４９名の患者（３４名の女性と１５名の男性、年齢２３〜８０歳、年齢の中央値６５歳）の血清から得た。２９名の患者はＲＡに、７名は骨関節症に、４名は結晶因性関節炎に、２名は乾癖性関節炎に、５名は反応性関節炎に、そして２名は単関節炎（monoarthritis）にそれぞれ冒されていた。診断は、Arnett他の論文（１９８８年）、Arthritis Rh eum．第３１巻、３１５〜３２４頁に記載されている判定基準（American Rheuma tism Association Standard）と、膝の臨床およびＸ線写真による検査と、そして滑液の顕微鏡による直接検鏡とに基づいて行った。これらの患者は、血清中のＣＲＰ濃度が２５〜１６００（中央値１６５）であった。３４名の患者は非ステロイド系の抗炎症薬を服用中であり、そして１７名は緩徐作用性抗リウマチ薬を服用中であった。１５名の患者は、過去３か月間以内に全身的または局所的に糖質コルチコイドによる治療を受けていた。膝の炎症は、触知可能な滑膜の腫脹（範囲０〜３）および触診時の痛み（０〜３）からなる０〜６の範囲の臨床指数の格付けによって評価した。２．血清および滑液の収集血液の試料は、室温下で凝固させ、次に１５００×ｇで１０分間遠心分離に付した。局所麻酔なしで通常の無菌法を利用して膝関節の吸引を実施した。滑液を、１．２ｍｍゲージの針を使用して、各被検者からできるだけ完全に取り出し、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）最終濃度５ｍＭ）が入っている滅菌チューブに集めた。滑液試料は、外来残渣を除くため、１８００×ｇで３０分間遠心分離に付した。試料は、直ちに分析するかまたは−８０℃で貯蔵してその後分析した。実施例ＩＩＩＹＫＬ−４０の放射線免疫検定に用いる標識を付けた抗原と抗体の製造１．放射線ヨウ素で処理したＹＫＬ−４０の製造先に引用したヨードジェン（iodogen）法に従って、精製ＹＫＬ−４０に１２５１（ナトリウム塩、英国、Amersham社）で標識を付けた。具体的に述べると、１０μｇのＹＫＬ−４０を、１１０μｌの反応容積で、酸化剤として２μｇのヨードジェン（英国、イングランド、チェエスター所在のPierce and Warriner社）を用いて１８．５ＭＢｑの１２５１とともに１０分間インキュベートした。ヨウ素化は、反応混合物をヨードジェンチューブから移動させることによって停止させた。標識を付けたＹＫＬ−４０を、検定緩衝液（１６ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、０．１２ＭのＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミン）と平衡化させたSEPHADEX G-25 カラム（１×１２．５ｃｍ、Pharmacia社から入手）を用いて、遊離のヨウ素から分離した。標識ＹＫＬ−４０の算出比活性は、約１５Ｃｉ／ｇであった。ＹＫＬ−４０（精製）およびＲＡの患者の血清から採取したＹＫＬ−４０の溶離位置を図１に示す。２．抗体の製造ニュージーランド白ウサギを、精製ＹＫＬ−４０を多くの部位に皮下または筋肉内に毎月注射することによって免疫化した。各注射は、不完全フロイントアジュバント中に乳化したヒトＹＫＬ−４０の０．５ｇ（１：１）で行った。最初の４回の注射は、２週間の間をおいて行い、４番目の注射を行ってから１０〜１２日目にウサギから採血した。その後、注射は、４週間間隔で行い、各注射を終わってから１０〜１２日目に採血した。交差免疫電気泳動法によって、その抗体がＹＫＬ−４０に対して単一特異性であることが分かった。放射性同位元素の標識が、所定の検定法で等価の機能を有する抗原ではなく上記の抗体に結合することを、当該技術分野の当業者は理解できるであろう。実施例ＩＶリウマチ様関節炎などの関節疾患の患者の血清および滑液中のＹＫＬ−４０の濃度を検定するＹＫＬ−４０の放射線免疫検定法実施例ＩＩで述べた検定試料を以下のようにして検定した。ＹＫＬ−４０の抗体、標準およびトレーサーは、検定緩衝液で希釈した。この検定法では、１００ μｌの標準または試料を、最終容積４００ μｌで、１００μｌのＹＫＬ−４０抗血清（１：１０，０００）および１００μ ｌのＹＫＬ−４０トレーサー（約１５，０００カウント毎分）とともに、室温下で２０〜２４時間インキュベートした。抗体が結合したトレーサーを、１００ｐｌのＳＡＣ−ＣＥＬ（ロバ抗ウサギ抗体をコートしたセルロースの懸濁液、英国、Wellcome Diagnostics Ltd．社）とともに室温下で３０分間インキュベートすることによって分離した。１ｍｌの蒸留水を添加した後、そのチューブを２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液をデカントし、次に沈殿の放射能を自動ガンマカウンタで計数して１０，０００カウントの時間を求めた。精密さ（検定内の変動）は、単一の検定法で３個の品質管理血清の各々について繰り返し測定（２０回）を行って算出した。再現性（検定間の変動）は、３個の品質管理血清の各々について５か月間に亘って得たデータ（２０回の検定）から算出した。対応する血清とＥＤＴＡ血漿の試料中のＹＫＬ−４０の濃度を７５名の血液提供者で比較した。標準と試料は、２回ずつ測定した。標準曲線は、スプライン関数を用いて作成した。二つの患者群と対照の個々の血清中ＹＫＬ−４０濃度を図２に示す。炎症性リウマチ疾患の患者のＹＫＬ−４０血清中濃度（中央値１３８μｇ／Ｌ、下側四分位点〜上側四分位点１０３〜２１１μｇ／ｌ）は、骨関節症の患者のＹＫＬ−４０血清中濃度（中央値１１２μｇ／Ｌ、下側四分位点〜上側四分位点９３〜１５２μｇ／Ｌ）と統計的に差はなかった（ｐ＝０．４４）。両方の患者群の血清中ＹＫＬ−４０は、対照のヒトのそれ（中央値５０μｇ／Ｌ、下側四分位点〜上側四分位点３６〜６４μｇ／ｌ）より優位に高かった（ｐ＝０．００１）。炎症性リウマチ疾患の患者の膝関節滑液中のＹＫＬ−４０の濃度（中央値２２１０μｇ／ｌ、下側四分位点〜上側四分位点１６２５〜３０４０μｇ／ｌ）は、骨関節症の患者の濃度（中央値１７２０μｇ／ｌ、下側四分位点〜上側四分位点１２７０〜１９５０μｇ／ｌ）と有意差はなかった。したがって、ＹＫＬ−４０の血清中濃度は、関節疾患、特に炎症性関節疾患の発生に関連があるようである。しかし、評価された異なる関節疾患の差異は、これらのデータからは明らかでない。実施例Ｖ血清検定試料中のＹＫＬ−４０の安定性検定試料中のＹＫＬ−４０抗原に対する凍結・融解の作用を評価するため、新しい血清試料を６名の成人から入手し、各資料について１０個ずつアリコート（分取）を調製した。一つのアリコートを氷上に保持し、残りを−２０℃で凍結した。６０分間の間隔をおいてアリコートを取り出し、室温で融解させた。一つの試料は氷上に保持し、残りは再び凍結した。この手順を９回繰り返したが、血清中ＹＫＬ−４０の反応性の損失はなかった。室温での長時間の保存の作用を評価するため、新しい血清試料を１２名の成人から入手し、各試料について４個ずつアリコートを調製した。一つのアリコートを−２０℃で直ちに凍結し、残りは室温下で２４時間および１２０時間貯蔵した。これらの期間中、反応性は安定であった。実施例ＶＩ血清および滑液中のＹＫＬ−４０と、炎症の他の生化学的指標との相関関係、並びに軟骨の再成形図３に示すように、実施例ＩＩに記載した血清と滑液の試料について測定したＹＫＬ−４０の濃度は相関関係が高く、かつ滑液／血清のＹＫＬ−４０の比率が高かった。ＹＫＬ−４０の血清中濃度および滑液中濃度は、ＣＲＰの血清中濃度、ＩＬ−６の滑液中濃度および滑液Ｍφの弾性組織分解のレベルと有為な相関関係があった。これらは、下記のようにしてこれらの試料を検定して、測定した。血清ＹＫＬ−４０はこれら試料の血清Ｍφの弾性組織分解のレベルとＰ−ＩＩＩ −ＮＰの血清中濃度とも相関関係があった。これらの試料について測定した滑液中ＹＫＬ−４０濃度は、膝の炎症の臨床指数と相関関係があった。血清中または滑液中のＹＫＬ−４０の濃度と、血清中ＩＬ−６濃度および滑液中Ｐ−ＩＩＩ− ＮＰ濃度との間に、相関関係はなかった。ＣＲＰの血清中濃度は、比濁分析法（ドイツ、マルブルク所在、Behringwerke 社）で測定した。インターロイキン６（ＩＬ−６）の活性は、当該技術分野で公知の高度に特異的なＩＬ−６依存性マウスハイブリドーマ細胞系Ｂ１３，２９クローンＢ９を用いて生物検定法で測定した。ＩＩＩ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド（Ｐ−ＩＩＩ−ＮＰ）は、市販のＲＩＡ（Ｐ−ＩＩＩ−ＮＰＲＩＡキット、フィンランド、オウルンサロ所在、Farmos Diagnostica社）で測定した。単球／マクロファージ（Ｍφ）の弾性組織分解活性は、Jensen他の論文、 Scand．J．Rheum.第２０巻、８３〜９０頁、１９９１年に記載されている生Ｍφ の弾性組織分解の検定法で試験した。これらの検定の試験結果を以下の表Ｉに示す。実施例ＶＩＩＹＫＬ−４０の血清中濃度の変化および関節炎患者の治療経過の相関関係この１年間に、（１）大きな群の活動性リウマチ様関節炎患者の疾患活性をＹＫＬ−４０が反映しているか否か、および（２）メチルプレドニソロン（ＭＰ）静脈投与してから４〜８週間炎症を軽減することが知られている）を静脈投与して毎月治療した場合疾患を軽減する医薬のペニシラミンまたはアザチオプリンの作用を高めるかまたは加速するか否かを、疾患の経過および／または改善の指標としてＹＫＬ−４０を用いて評価するため、二重盲検プラシーボ対照試験を主として行った。この試験には、American Rheumatism Association（前記のArnett 他の論文、Arthritis Rheum．を参照）で定義された確定的または古典的リウマチ様関節炎の患者９７名が参加した。血液の試料は、朝のパルス治療の直前に収集し、血漿中のＹＫＬ−４０を実施例ＩＶに記載されているようにＲＩＡで測定した。ＲＡ患者９７名について検出した血清中ＹＫＬ−４０の最初の濃度の中央値は１７４μｇ／ｌ（範囲は４０〜５８３μｇ／ｌ）であった。これらＲＡ患者の血漿中ＹＫＬ−４０の濃度は、２６０名の健康な成人の同様に測定したＹＫＬ−４０血漿中濃度（中央値１０２μ ｇ／ｌ、範囲３８〜５１４μｇ／ｌ）より有意に高かった（ｐ≧０．００１）。比較するため、ＲＡ患者全員および９９名の健康な成人について、血清中のヒアルロナンとＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度も試験した（スウェーデン、ウプサラ所在のPharmacia社から入手したヒアルロナンの放射線検定法を使用）。各患者の手、手首および足のＸ線撮影を、治療を開始する前と治療３６０日目に再び行った。放射線医師がこれらＸ線写真をブラインドで評価した。少なくとも１ｍｍの深さのびらんが存在し、かつ１２か月後にびらんの数が増加または変化したときは、臨床上有意であるとみなした。表ＩＩには、二つの治療群の臨床データおよび血清中ＹＫＬ−４０と血清中ヒアルロナンの初期の値を示す。これらの群に有意差はなかった。患者らは、パルス治療の二重盲検プラシーボ対照試験に入り、４週間ごとに合計６回１０００ｍｇずつメチルプレドニソロン（ＭＰ）を静脈に注射され、続いて６か月間はパルス治療を行わなかった。最初のパルス治療を終わってから７日目に、患者らは、Hansen他の論文、Br.Med.J.、第３０１巻、２６８頁、１９９０年に記載されているようにして、ペニシラミンまたはアザチオプリンで治療を開始した。５７名の患者が同じ疾患改善薬を全体に亘って投与されて、試験を完了した（３７名はＭＰ［ペニシラミン／アザチオプリン：２０：１１］で治療し、２６名にはプラシーボを使用）。１１名の患者は、試験中にペニシラミンからアザチオプリンに変更し、そして２９名は、副作用があるかまたはアザチオプリンでの治療効果がないため、研究から除いた。この試験から得たデータを下記のように統計的に分析した。治療中の血清中ＹＫＬ−４０と血清中ヒアルロナンの比較的長時間に亘る変化を評価するため、各被検者の初期の値を１００％とし、治療を開始した後に得た値は初期の値の百分率として表した。群間の平均差を対になっていないデータに対するスチューデントＴ検定法によって評価した。ＹＫＬ−４０の値の生データを評価したとき、群間の比較は、対になっていない差についてのノンパラメトリックのマン・ホイトニー検定法と対になっている差についてのウイルコクソン検定法を用いて、計算した。これらの分析を行う場合、ｐ値が０．０５未満のとき有意であるとみなした。異なるパラメータ間の相関関係は、スピアマンのｒｈｏ検定法を用いて算出した。この分析の場合、ｐ値が０．０１未満のとき有意であるとみなした。利用した分析検定法は、全て当該技術分野で標準の検定法である。図４（ａ）は、試験を完了した５７名の患者の１年間の試験期間の血清中ＹＫＬ−４０と血清中ヒアルロナンの変化を示す。ＹＫＬ−４０の濃度は、ＭＰによる治療（図４（ａ）中の●印）が始まった後、初期値に比べて有意に低くなり、次いでこの治療を中止した後、初期値に戻った。これとは対照的に、ペニシラミンまたはアザチオプリンだけで治療した群（図４（ａ）中の○印）では、ＹＫＬ −４０濃度は８４日後にバックグランドと有意差があるに過ぎない。ＹＫＬ−４０濃度に対するＭＰによる治療の効果は、関節疾患の他の生化学的指標に対するその効果とも比較した。ウシ軟骨から単利した特異的ヒアルロナン結合タンパク質（スウェーデン、ウプサラ所在のPhar macia社）を用いて、放射分析検定法により血清中ヒアルロナンを測定した。血清中Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、比濁分析法（ドイツ、マルブルク所在の Beringwerke社）によって測定した。血清中ヒアルロナンは、ＭＰ群において１日目と１６８日目に有意に減少したに過ぎない（図４（ｂ）中の●印、プラシーボ群は○で示す）が、血清中ＣＲＰは、ＭＰ治療群では試験期間全体に亘って有意に低下し、そしてプラシーボ群では８４日後に有意に低下した（図示せず）。ヒアルロナンについて測定した値は、１日目を除いてＭＰ群とプラシーボ群との間に有意差はなかった（図４（ｂ）参照）。ＭＰによる治療の経過での血漿中ＹＫＬ−４０の濃度の変化は、図５（ａ）と５（ｂ）に示すように、血清中ヒアルロナンの濃度の変化と異なっていた。したがって、ＭＰによる治療によって、血漿中ＹＫＬ−４０が有意ではあるが一過性の減少を起こし、そして血漿中のＹＫＬ−４０は治療に続く最初の数か月間、治療応答の他の指標と相関関係があった。実施例ＶＩＩＩＹＫＬ−４０の血清中濃度の、乳癌の再発後の生存率に対する関係乳癌患者６０名（２９〜７８歳）の臨床群のＹＫＬ−４０血清中濃度を、実施例ＩＶに記載のＲＩＡを用いて測定した。比較を行うため、対照群の１３７名の疾患にかかっていない女性（２０〜７９歳）のＹＫＬ −４０血清中濃度も測定した。これらの後者の測定値はＹＫＬ−４０の正常な値と中央値を示し、この実施例に引用した。臨床群と対照群のメンバーはそれぞれ次のとおりであった。１．臨床群原発乳癌にかかっているとすでに診断された２９〜７８歳の女性６０名。これらの女性は、全て抗新生物全身治療の潜在的な候補者であった。試験へのエントリーの基準は、１）限局性疾患の一次治療の後に遠隔転移した疑い、２）最初の診断時での局部的に進行した疾患または遠隔転移、および３）初めて再発した後の骨への転移が進行している疑いがある患者、である。いかなる時点でも他の原発癌にかかっている患者は、この試験に入れなかった。患者３９名（６５％）は、アジュバントの治療を前に受けたことがあった。これらの患者の内２２名（５６％）は、原発腫瘍を切除した後直ちにシクロホスファミド、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシルによるアジュバント多剤併用化学療法を受けていた。これらの患者のいずれも、この試験の開始時（すなわち、検定試料収集の時点）前の１２週間の間には治療を受けていなかった。２．対照群健康な女性１３７名（２０〜７９歳）のＹＫＬ−４０血清中濃度を対照群として用いるため確認した。血清の試料は、デンマークのHvidovre HospitalのRegio nal Blood Transfusion Servicesを訪れた給血者、デンマーク、コペンハーゲンの異なる博物館に勤めている女性たち、およびコペンハーゲンの老人のシェアードハウス（shared house）で生活している老人女性たちから入手した。これらの女性たちは、全て健康（分かっている疾患を持っていない）で、全く医薬を服用しておらず、かつ全て肝臓と腎臓の機能が正常であった。臨床群の各患者が、その癌の再発が観察されてから続いて生存した期間を観察した。腫瘍細胞の転移の性質も各患者について明らかにした。これらのデータは、その癌が再発した時点で各患者について測定したＹＫＬ−４０血清中濃度と相関関係があった。３．再発ここで報告する血清分析値は、全てこの試験に入る時点で６０名の各女性から入手した血液試料にいつて測定した分析値であった。これらの女性の内４７名は、乳癌の再発が最初に疑われた時点でこの試験に入った（基準１）。その後の試験で、これらの女性の内の６名は実際には乳癌は再発していないことが判明した。６名の女性は、最初の乳癌の診断の時点で疾患が局所で進行していたかまたは遠隔転移が起こっていたので、この試験に入り（基準２）、そして７名の女性は、乳癌が初めて再発してから９〜２７か月後に骨に転移した疑いがあったので、この試験に入った（基準３）。４．再発後の生存患者６０名の内９名は、分析の時点で依然として生存していた。乳癌が初めて再発した４１名の患者が再発後に生存した期間の中央値は１６か月（２５％点〜７５％点（四分位範囲）＝９〜２６か月）であり、そして全患者６０名の対応する値は１６か月（７〜４０か月）であった。表ＩＩＩに１７種の変数に対する一変量の生存データを要約した。年齢、退形成度、血清ＬＨＤ、血清ＡＰ、血清アルブミンおよび血清ＹＫＬ−４０は、全て６０名の患者の場合、有意な一変量予後因子であった。図８は、個々のＹＫＬ−４０の血清中濃度の再発後生存月数に対する関係を示す。追跡の時点で、血清ＹＫＬ−４０が高い２５名の患者は全て死亡したが、これに比べて血清ＹＫＬ−４０が正常な３５名の患者の内２６名が死亡した。１６か月以内に死亡した患者の６７％（３０名中２０名）は、血清ＹＫＬ−４０が高かった。乳癌が初めて再発した４１名の患者のＹＫＬ−４０血清中濃度によるカプラン・メイヤー生存曲線を図６に示す。数は少ないが、上記２群（血清ＹＫＬ−４０が正常かまたは高い２群）の生存数は、明らかに異なっている。乳癌が初めて再発した４１名の患者の１８か月後の生存率は、血清ＹＫＬ−４０が正常な患者の場合６０％であり、血清ＹＫＬ−４０が高い患者の場合２４％であった（ｐ＜０．０００９）。患者６０名全員について計算を行ったところ、ＹＫＬ−４０血清中濃度が正常な患者と高い患者それぞれの１８か月後の生存率は６３％と２０％であった（ｐ＜０．０００１）。図６に示すように、再発に続いて１６か月後になお生存している臨床群のメンバーの７６％は、ＹＫＬ−４０の血清中濃度が１６４μｇ／Ｌ以下であった。再発に続いて３０か月を超えて生存していたメンバーの８５％は、ＹＫＬ−４０血清中濃度が１６４μｇ／Ｌ未満であった。したがって、乳癌が初めて再発した後の患者の生存期間は、血清ＹＫＬ−４０が正常な群の患者の場合、ＹＫＬ−４０血清中濃度が約１６４μｇ／ｌ以上の患者、特にＹＫＬ−４０血清中濃度が約２０７μｇ／ｌ（ＹＫＬ−４０の「予後上で有意な濃度」）以上の患者と比べて有意に延長された（ｐ＝０．０００９）。これらのデータは、ＹＫＬ−４０の血清中濃度が高いということが、乳癌が進行している患者の生存期間が短いことと相関関係があることを示し、このような濃度が検出されたならば、一層強力な治療プロトコルが許容されることを示唆している。この試験の患者の場合のように、早期に死亡した患者の臨床症状が、癌の再発に引き続いてより長い期間生存した患者の臨床症状と実質的に差がない場合、血清ＹＫＬ−４０の測定値は特に有益である。ＹＫＬ−４０の血清中濃度と同時に測定した他の血液タンパク質（例えば、血清アルカリ性ホスファターゼなど）の血清中濃度に基づいた類似のカプラン・マイヤー曲線は、臨床群のメンバーの生存率に対して明確な相関関係を示さなかった。５．転移の部位この研究の女性６０名の内、３０名の患者（５０％）が軟組織で再発し、骨への転移（Ｘ線または骨の生検で検出）が４０名（６７％）の患者に見られ、そして内蔵への転移（肺、胸膜または肝臓）は１９名（３２％）の患者に起こった。図９は、臨床群の患者における主な転移部位に従って血清ＹＫＬ−４０の分布を示す。転移がない患者６名は、全てＹＫＬ−４０の血清中濃度が正常であった。これらの群の間のＹＫＬ−４０血清中濃度は、クラスカル・ウォリス検定の結果、高度に有意であった（ｐ＝０．０３）。内蔵または骨への転移があった患者の血清ＹＫＬ−４０の中央値は、転移がない患者の濃度および健康な年齢の釣り合った女性の濃度（１０２μｇ／ｌ、ｐ＜０．００１）に比べて有意に高かった（ｐ＜０．５）。乳癌が初めて再発した４１名の患者だけを計算に用いても、類似の有意差性が認められた。転移があった５４名の患者の内、２５名はＹＫＬ−４０血清中濃度が限界濃度（cut-off level）の２０７μｇ／ｌを超えていた。軟組織で再発した患者の場合（ｎ＝１０）、血清ＹＫＬ−４０の中央値は１２３μｇ／Ｌであり、そして２名の患者だけ血清ＹＫＬ−４０が高かった。これら２名の患者の内の１名は、ＹＫＬ−４０血清中濃度が非常に高く（９０４μｇ／ｌ）、５か月後に死亡した。血液サンプリングの時点でこの患者は胸膜浸出を起こしていたが、顕微鏡検鏡では悪性細胞は認められなかった。骨への転移があった患者（＝／−軟組織での再発（Ｎ＝２５））の血清ＹＫＬ−４０の中央値は１５７μｇ／ｌであり、これら患者の内１２名（４８％）は血清ＹＫＬ−４０が高かった。４名の患者は、内蔵への転移だけが認められ、これら患者の内３名（７５％）の血清ＹＫＬ−４０は正常値を超える値であった。図１２は、Ｘ線検査による骨への転移の存在に対する個々のＹＫＬ−４０血清中濃度を示す。内蔵への転移があった患者の場合、ＹＫＬ−４０血清中濃度が増大するので、この発明の発明者らは、内蔵への罹患がない患者（Ｎ＝４１）の診断値だけを評価した。２箇所以上の骨への転移があった患者は、骨への転移が１箇所だけか全くなかった患者に比べて、血清ＹＫＬ−４０が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。Ｘ線写真が正常であった４名の患者は、ＹＫＬ−４０が高かった。しかし、これらの患者の内の２名は、ポジティブ・ボーン・スキャンニング（ positive bone scanning）と生検を行った結果、骨髄癌症が見出され、残りの２名は６か月以内にＸ線写真で認められる骨への転移が発生した。一つ以上の骨への転移の有無に対するＹＫＬ−４０血清中濃度の関係を述べると、試験結果が陽性の臨床群のメンバーは、試験結果が陰性のメンバーとは対照的にＹＫＬ−４０の濃度が高かった。そのうえに、二つ以上の骨への転移があり試験結果が陽性のメンバーは、一つの骨への転移があるメンバーとは対照的にＹＫＬ−４０の濃度が高かった（図１０参照）。ＹＫＬ−４０の血清中濃度と、各患者の更年期状態など他の臨床パラメータとの間に明確な関係はなかった（以下の表ＩＩＩとＩＶ参照）。しかし、ＹＫＬ−４０の血清中濃度は、内蔵への転移があった患者の７５％と骨への転移があった患者の４８％が正常の濃度より高かった。ＹＫＬ−４０の濃度と年齢の間に明確な関係はないようであったが、図７に示すように、ＹＫＬ−４０の異常な濃度は７０歳未満の健康な女性（対照群）には現れなかった。したがって、特に、測定された他の血液タンパク質と比較すると（表ＩＩＩ〜ＩＶ参照）、ＹＫＬ−４０の濃度は、乳癌の癌細胞の骨および内蔵への転移について診断上の価値がある。６．コックスの回帰分析初期コックスモデルには一変量の有意な血液検査と再発なしの期間が含まれていた。血清アルブミンは、その値が患者の４０％についてしか記録されていなかったので、含めなかった。この初期モデルは、血清ＹＫＬ−４０と血清ＬＤＨだけが、６０名の患者が再発した後の生存についての独立した予後因子であることを示した（表ＩＩＩ）。変数減少法と変数増加法によって、血清ＹＫＬ−４０（ｐ＝０．００１）と血清ＬＤＨ（ｐ＝０．０１）を除いて、全てのコバリエート（covariate）をエリミネート（eliminate）した。乳癌が初めて再発した４１名の患者だけを計算に含めた場合も、やはり変数減少法と変数増加法によって、血清ＹＫＬ−４０（ｐ＝０．０００４）と血清ＬＤＨ（ｐ＝０．０３７）を除いて、全てのコバリエートをエリミネートした。これら二種のＹＫＬ−４０血清中濃度と二種のＬＤＨ血清中濃度の４種の組合せの推定生存パターンに基づいて算出した、血清ＬＤＨが正常であって、血清ＹＫＬ−４０が正常な患者と血清ＹＫＬ−４０が高い患者についての１２か月後の生存率は、それぞれ８３％と５６％であった。ＬＤＨ血清中濃度が高い患者の中で、ＹＫＬ−４０が正常な患者および血清ＹＫＬ−４０が高い患者の１２か月の生存率は、それぞれ６７％と２８％であった。実施例ＩＸ骨関節症の患者の血清と滑液の中のＹＫＬ−４０の検出と定量およびひざの外傷を有する患者に検出された濃度との比較関節の結合組織の加速代謝が、炎症性関節疾患（例えば、ＲＡなど）のみならず、退行性関節疾患（例えば骨関節症など）で起こることが知られている。しかし、その類似点以上に、退行性関節疾患と炎症性関節疾患の発生機序は、類似していない。例えば、退行性関節炎は、重量と衝撃の負荷に繰り返しさらされることによって起こる骨の微小骨折に関連すると考えられている。治癒する場合、その骨折は、硬質で厚い軟骨下の骨で覆われるが、この骨は重量の負荷に伴うエネルギーを吸収しにくい。したがって、関節軟骨の軟骨細胞は、骨から屈折した圧力を受けて軟骨細胞の増殖と代謝を刺激する。最初、身体は必要に応じて修復することができるが、結局、退行性プロセスが優勢になり、軟骨が損失するに至る（例えば「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ」、第１１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ社１９８７年１４５６頁など参照）。これとは対照的に、炎症性関節疾患での軟骨の損失は、滑液の炎症によって起こると考えられている。時間の経過とともに、滑液は関節窩中に突出する絨毛を形成する。特に、ＲＡになる素因は遺伝によって付与されると考えられているが、ＨＬＡ−ＤＲ４、すなわちクラス１１の主要組織適合性遺伝子複合体の分子との関連は、まだ明らかになっていない。炎症性関節疾患は、非炎症性関節疾患から炎症性関節疾患を区別する徴候である早朝硬直を含めて、かなり特異的な臨床発症を起こす（例えば前掲の「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ」１４２３頁など参照）。炎症性関節疾患と非炎症性関節疾患との間で発生機序および病状に差があると仮定すると、一方の疾患の指標が他方の疾患の指標として役立つであろうとは予想できないであろう。したがって、ＹＫＬ−４０の濃度が、ＲＡの患者の体液中のみならず、骨関節症の患者の体液中でも診断を行うのに有意な程度まで上昇することを発見したことは、予想外のことであった。この発見は、外傷のひざ損傷および骨関節症（後期）の患者由来のＹＫＬ−４０の血清中および滑液中の濃度を、健康な小児と成人由来のＹＫＬ−４０血清中濃度（この後者のデータでＹＫＬ−４０血清中濃度のベースライン「正常」濃度を確認した）と比較する研究中になされた。１．対照群正常な小児４７６名（６〜１７歳、２３６名の女子と２４０名の男子）がこの試験に参加した。また２７５名の成人（１８〜７９歳、１４６名の女性と１２７名の男性）がこの試験に参加した。各参加者は、通常の医療標準に従って検査され、健康であると確認された。２．患者群成人９６名（１８〜７９歳、３７名の女性と５９名の男性）がこの試験に参加した。臨床上、これらの参加者を次のようにグループ分けした。Ａ群＝ひざの痛みがあるので関節鏡検査を行ったが、ひざの疾患はないと確認された１２名の患者、Ｂ群＝滑膜炎はないが、外傷を示す異常な関節鏡検査結果を示す１８名の患者、Ｃ群＝軽度〜中度の滑膜炎の患者２２名、Ｄ群＝急性の重症滑膜炎の１８名の患者、Ｅ群＝慢性外傷後滑膜炎の１０名の患者、Ｆ群＝骨関節症（後期、ひざ）の１６名の患者。血清は、各患者から収集し、滑液は、５１名の患者から分析を行うのに充分な量だけ入手した。これらの患者は、通常の医療基準に従って、その外の点では健康であると確認された。これらの患者は、１４名の骨関節症の患者（これらの患者は非ステロイドの抗炎症薬を投与されていた）を除いて、医薬を投与されていなかった。ＹＫＬ−４０の血清中および滑液中の濃度は、実施例ＩＶに記載されているようにして測定した。検定結果の統計的分析は、標準の方法に従って分析を行う市販のソフトウェアプログラム（ＳＳＰＳソフトウェア）を用いて実施した。群間の比較は、当該技術分野で公知のノンパラメトリックのマン・ホイトニー検定法とクラスカル・ウォリス検定法を用いて算出して行った。異なるパラメータ間の相関関係は、当該技術分野で公知のスピアマンｒｈｏ検定法を用いて算出した。ｐ値が０．０５未満のとき有意であるとみなした。この試験で得たデータを以下に示す。要約すると、後期ひざ骨関節症の患者は、患者群中の他の参加者および対照群と比べて、ＹＫＬ−４０の血清中および滑液中の濃度が有意に高かった（１．５〜２．０倍）（表ＶとＶＩ参照）。ＹＫＬ−４０の濃度は、血清中に比べて滑液中の方が約１０倍であることが見出されたが、これは多分ＹＫＬ−４０が局所で産生されることを反映しているのであろう。軟骨は、骨関節症のひざには比較的少量存在しているので、滑液中に見出されたＹＫＬ−４０のかなりの部分が、滑膜細胞の過形成または滑膜細胞によるＹＫＬ−４０の分泌の増大によって、滑膜において合成されると考えられる。この仮定は、さらに重症の滑膜炎の患者の方が、軽度の滑膜炎または滑膜炎なしの患者と比べて、ＹＫＬ−４０の濃度が有意に高かった（７〜１６倍）という観察結果で裏付けされている。しかし、ＹＫＬ −４０は、軟骨細胞によって滑液中に分泌されている可能性もある。その起源の如何に拘わらず、ひざの外傷の症例とは対照的に、ＹＫＬ−４０は、骨マトリックスの成分に作用してＹＫＬ−４０に関連する骨関節症などの結合組織疾患を発現させた後、該成分を分解するようである。実施例Ｘアルコール肝硬変の患者および健康な肝臓組織を有する成人由来の血清中のＹＫＬ−４０濃度の検出成人３９名がこの試験に参加した。すなわち、正常な肝機能を有する患者１６名（７名の女性と９名の男性、年齢３５〜７４歳）および肝臓疾患を有する患者２３名（８名の女性と１５名の男性、年齢３１〜７５歳）である。正常な肝機能を有する成人のうち、７名は健康であったが、７名は動脈性高血圧症と診断され、１名は腎血管性高血圧症と診断され、そして１名は腸性虚血と診断された。肝臓の機能が異状な成人のうち、１８名は活動性肝炎を伴ったアルコール肝硬変であり、２名は活動性肝炎なしのアルコール肝硬変であり、２名は未知原因の肝炎であり、そして１名は脂肪変性肝炎であった。この試験の期間中、患者はだれもアルコールを消費していなかった。一夜断食した後、患者たちは局所麻酔下で肝静脈に（肝疾患の患者２０名および肝機能が正常である患者１４名）または腎静脈に（肝疾患の患者１７名および肝機能が正常である患者１３名）にカテーテルを挿入した。血液試料は、各患者の大腿動脈と臓器静脈から入手し次いで実施例ＩＶに記載したようにして放射線免疫検定方で分析した。対照基準として実施例ＩＸに報告した健康成人由来のデータを使用して、上記患者から収集したデータと比較した。統計的分析は、実施例ＩＸに記載したのと同様にして実施した。動静脈除去率は、Ｅ＝Ｃａ−Ｃｖ／Ｃａ（式中、Ｃａは大腿動脈血漿中のＹＫＬ−４０の免疫反応性であり、そしてＣｖは腎静脈由来の血漿中のＹＫＬ−４０の免疫反応性である）として求めた。硬変症の患者と対照の腎臓除去率には有意差はなく、それぞれ０．０５１（範囲＝０．００７６〜０．１４）および０．０２８（範囲＝−０．０２９４〜０．３０４０）であった。しかし、肝疾患の患者は、ＹＫＬ−４０の濃度が、肝機能が正常の患者由来の試料中に検出したＹＫＬ−４０の濃度と比べて非常に高かった（ｐ＜０．００１）。肝疾患の患者由来の動脈血と静脈血中に検出された血清ＹＫＬ−４０値の中央値を、肝機能が正常な患者由来の動脈血と静脈血中に検出された血清ＹＫＬ−４０値の中央値と比較した。表ＶＩに示すように、前者の測定値は後者の測定値の約４倍であったが（ｐは０．００１未満であった）、これはＹＫＬ−４０が肝組織の退行に関連していることを強く示している。この発明について十分に説明したので、当該技術分野の当業者にとって、この発明の精神および範囲から逸脱することなく、上記の実施例を改変できるであろうことは明らかであろう。配列の概要配列番号：１はＹＫＬ−４０タンパク質のＮ末端アミノ酸配列である。配列番号：２はＹＫＬ−４０タンパク質の内部アミノ酸配列（「ＹＫＬ−４０ペプチドＡ」）である。配列番号：３はＹＫＬ−４０タンパク質の別の内部アミノ酸配列（「ＹＫＬ−４０ペプチドＢ」）である。配列番号：４はＹＫＬ−４０の遺伝子のコーディング領域のｃＤＮＡヌクレオチド配列である。成熟した分泌タンパク質の開始コドンは１３５位のヌクレオチドから始まる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/564 ＢＧ０１Ｎ 33/577 8310−2Ｊ 33/574 Ｄ // Ｇ０１Ｎ 33/564 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ 33/574 ＡＢＪ (72)発明者ジョハンセンジュリアエス. デンマークＤＫ―2000 コペンハーゲンＦシー．エフ．リッチスベイ 99 エイアイティーユー

Claims

【特許請求の範囲】１．診断を行うのに有意な濃度のＹＫＬ−４０が哺乳類の生体試料中に存在しているか否かを検出することからなる、哺乳類のＹＫＬ−４０含有結合組織の分解に関連する疾患状態の存在を確認する方法。２．試料中のＹＫＬ−４０の量を免疫検定法を用いて検出する請求の範囲１記載の方法。３．免疫検定方が競合免疫検定法である請求の範囲２記載の方法。４．免疫検定法が、放射性同位元素、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およびコロイド金属からなる群から選択される検出可能な標識を利用してＹＫＬ−４０を検出する請求の範囲３記載の方法。５．疾患状態が、炎症性または退行性の間接疾患である請求の範囲１記載の方法。６．疾患が肝硬変である請求の範囲１記載の方法。７．疾患状態が転移性癌である請求の範囲１記載の方法。８．疾患状態が転移性乳癌である請求の範囲１記載の方法。９．哺乳類がヒトである請求の範囲１記載の方法。１０．免疫検定方法がポリクロナール抗体を使用してＹＫＬ−４０を検出する請求の範囲２記載の方法。１１．免疫検定方法がモノクロナール抗体を使用してＹＫＬ−４０を検出する請求の範囲２記載の方法。１２．生体試料が、疾患状態になった組織である請求の範囲１記載の方法。１３．生体試料が血液、血清または血漿である請求の範囲１２記載の方法。１４．ＹＫＬ−４０が、癌が再発した後に患者から採取した血清の試料中に予後を行うのに有意な濃度で存在しているのか否かを検出し測定することからなる、癌が寛解後に再発した乳癌患者の生存期間の予後を示唆するデータを得る方法。１５．データを得る方法が、血清試料中にＹＫＬ−４０が存在していることを、ＹＫＬ−４０に対して特異的な抗体に結合された検出可能な標識に提供されるシグナルで示す競合免疫検定法からなる請求の範囲１４記載の方法。１６．検出可能な標識が、放射性同位元素、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およびコロイド金属からなる群から選択される請求の範囲１５記載の方法。１７．抗体が、ＹＫＬ−４０に対して特異的に反応性であるポリクロナール抗体である請求の範囲１５記載の方法。１８．抗体が、ＹＫＬ−４０に対して特異的に反応性であるモノクロナール抗体である請求の範囲１５記載の方法。１９．哺乳類の生体試料中に存在するＹＫＬ−４０の量の増減を検出することからなる、哺乳類のＹＫＬ−４０含有結合組織の分解に関連する疾患状態の経過または改善を監視する方法。２０．試料中のＹＫＬ−４０の量が免疫検定法を用いて検出される請求の範囲１９記載の方法。２１．免疫検定法が競合免疫検定法である請求の範囲２０記載の方法。２２．免疫検定法が、放射性同位元素、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およびコロイド金属からなる群から選択される検出可能な標識を、シグナルとして使用してＹＫＬ−４０を検出する請求の範囲２０記載の方法。２３．疾患が炎症または退行性の関節疾患である請求の範囲１９記載の方法。２４．哺乳類がヒトである請求の範囲１９記載の方法。２５．免疫検定方法がポリクロナール抗体を使用してＹＫＬ−４０を検出する請求の範囲２１記載の方法。２６．免疫検定方法がモノクロナール抗体を使用してＹＫＬ−４０を検出する請求の範囲２１記載の方法。２７．生体試料が、疾患状態になった組織から採取した体液または組織の試料である請求の範囲２６記載の方法。２８．非ヒト哺乳類の免疫下によって産生され、ＹＫＬ−４０に対して特異的に反応性であるポリクロナール抗体。２９．非ヒト哺乳類から採取した細胞から形成されたハイブリドーマから産生され、ＹＫＬ−４０に対して特異的に反応性であるモノクロナール抗体。３０．医薬として許容される担体中の治療上有効な投与量のＹＫＬ−４０の基分子を投与することからなる、組織中のＹＫＬ−４０の活性を減少させることによって、ＹＫＬ−４０含有結合組織の分解に関連する哺乳類の疾患状態を治療する方法。３１．疾患状態が炎症または退行性の関節疾患であり、そしてＹＫＬ−４０の基分子が冒された関節の滑液中に投与される請求の範囲３０記載の方法。３２．医薬として許容される担体中の治療上有効な投与量の抗ＹＫＬ−４０抗体を投与することからなる、組織中のＹＫＬ−４０の活性を減少させることによって、ＹＫＬ−４０含有組織の分解に関連する哺乳類の疾患状態を治療する方法。３３．疾患状態が炎症または退行性の関節疾患であり、そしてＹＫＬ−４０の基質分子が冒された関節の滑液中に投与される請求の範囲３２記載の方法。３４．ＹＫＬ−４０抗体と免疫検定用試薬が入っている、請求の範囲１記載の方法に用いるキット。３５．ＹＫＬ−４０抗体と免疫検定用試薬が入っている、請求の範囲２０記載の方法に用いるキット。３６．医薬として許容される担体中にＹＫＬ−４０の基質分子を含有してなる医薬組成物。３７．医薬として許容される担体中にＹＫＬ−４０の抗体を含有してなる医薬組成物。３８．免疫検定方法がサンドイッチ免疫検定法である請求の範囲２記載の方法。３９．サンドイッチ免疫検定法が酵素結合イムノソルベント検定法である請求の範囲３８記載の方法。４０．免疫検定法がサンドイッチ免疫検定法である請求の範囲１４記載の方法。４１．サンドイッチ免疫検定法が酵素結合イムノソルベント検定法である請求の範囲４０記載の方法。４２．免疫検定法がサンドイッチ免疫検定法である請求の範囲２０記載の方法。４３．サンドイッチ免疫検定法が酵素結合イムノソルベント検定法である請求の範囲４２記載の方法。