JP2878455B2 - 哺乳類の結合組織マトリックスの分解の指標としてのｙｋｌ−４０の検定方法 - Google Patents
哺乳類の結合組織マトリックスの分解の指標としてのｙｋｌ−４０の検定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 関連米国特許願 この件は、1993年７月９日に出願され現在は放棄され
ている米国特許願第08/089,/989号の一部継続出願であ
る。
ている米国特許願第08/089,/989号の一部継続出願であ
る。
政府の権利の説明 この発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成
番号AR−27029の下に政府援助を部分的に受けてなされ
た。米国政府がこの発明についてある種の権利を有して
いる可能性がある。
番号AR−27029の下に政府援助を部分的に受けてなされ
た。米国政府がこの発明についてある種の権利を有して
いる可能性がある。
発明の背景 1.発明の分野 この発明は、哺乳類の結合組織の細胞外繊維マトリッ
クスの代謝に関連する循環タンパク質の同定に関する。
さらに詳しくは、この発明は、哺乳類の結合組織代謝に
関連するタンパク質であるYKL−40の分子およびフラグ
メントを検出および定量する検定方法に関する。また、
この発明には、哺乳類のYKL−40の血清中濃度と、関節
疾患や或る種の腫瘍の転移など、マトリックス代謝が役
割を演じる疾患の存在および状態との相関関係を示すこ
とも含まれる。
クスの代謝に関連する循環タンパク質の同定に関する。
さらに詳しくは、この発明は、哺乳類の結合組織代謝に
関連するタンパク質であるYKL−40の分子およびフラグ
メントを検出および定量する検定方法に関する。また、
この発明には、哺乳類のYKL−40の血清中濃度と、関節
疾患や或る種の腫瘍の転移など、マトリックス代謝が役
割を演じる疾患の存在および状態との相関関係を示すこ
とも含まれる。
2.関連技術の説明 哺乳類の結合組織（例えば、関節の軟骨、血管系とリ
ンパ系の脈完璧組織など）の細胞外マトリックスは、細
胞の結合組織からの移動に対して、強度および（程度を
変えて）バリヤーを付与する。しかし、ある種の疾患の
過程で、該マトリックスは、加水分解酵素によって分解
される。該マトリックスが分解されるにつれて、結合組
織の統合性が損われて、組織の細胞、副生物およびマト
リックス代謝の他の残留物が体液および／またはリンパ
管または血管の循環系中に漏出する。これらの分子およ
び細胞を検出すれば、或る特定の場合には、細胞外マト
リックスがどのようにして合成され、そしてどのように
して失われるのかを含めて、細胞外マトリックスの生化
学的特性に関する情報が得られる。また、マトリックス
の異常代謝が行われている間に産生および／または分泌
される特定の分子が疾患の過程に密接に関連している場
合、患者の体液および／または組織中の該分子を定量す
ることは、臨床医がその疾患の経過を監視するのに役立
つ。
ンパ系の脈完璧組織など）の細胞外マトリックスは、細
胞の結合組織からの移動に対して、強度および（程度を
変えて）バリヤーを付与する。しかし、ある種の疾患の
過程で、該マトリックスは、加水分解酵素によって分解
される。該マトリックスが分解されるにつれて、結合組
織の統合性が損われて、組織の細胞、副生物およびマト
リックス代謝の他の残留物が体液および／またはリンパ
管または血管の循環系中に漏出する。これらの分子およ
び細胞を検出すれば、或る特定の場合には、細胞外マト
リックスがどのようにして合成され、そしてどのように
して失われるのかを含めて、細胞外マトリックスの生化
学的特性に関する情報が得られる。また、マトリックス
の異常代謝が行われている間に産生および／または分泌
される特定の分子が疾患の過程に密接に関連している場
合、患者の体液および／または組織中の該分子を定量す
ることは、臨床医がその疾患の経過を監視するのに役立
つ。
ヒトの関節の軟骨は、いくつもの異なる種類のタンパ
ク質とプロテオグリカンを含有し、そのうちのいくつか
は関節軟骨中にしか存在していないことが知られてい
る。マトリックスのこれら成分は、マトリックスが或る
種の関節疾患の過程で分解すると、軟骨の組織から放出
される。特定の体液または組織中に存在する放出された
マトリックス成分（そのフラグメントと類縁巨大分子を
含む）を量は、その疾患の強さと相関関係がある。逆
に、関節軟骨の損傷が可逆的である場合（例えば、関節
組織の感染症で起こる二次反応性関節炎（secondary re
active arthritis）の場合）は、予め測定された放出マ
トリックス成分の濃度の減少は、その疾患の寛解の程度
と相関関係がある。
ク質とプロテオグリカンを含有し、そのうちのいくつか
は関節軟骨中にしか存在していないことが知られてい
る。マトリックスのこれら成分は、マトリックスが或る
種の関節疾患の過程で分解すると、軟骨の組織から放出
される。特定の体液または組織中に存在する放出された
マトリックス成分（そのフラグメントと類縁巨大分子を
含む）を量は、その疾患の強さと相関関係がある。逆
に、関節軟骨の損傷が可逆的である場合（例えば、関節
組織の感染症で起こる二次反応性関節炎（secondary re
active arthritis）の場合）は、予め測定された放出マ
トリックス成分の濃度の減少は、その疾患の寛解の程度
と相関関係がある。
しかし、実際は、軟骨および他の結合組織の代謝に関
する信頼できる指標の同定、並びにこれら指標を検出す
る検定法の開発は、難しい課題であることが分かってき
た。ある種の放出されたフラグメントと分子は、リンパ
節、肝臓および食作用によって循環系から迅速に除去さ
れる（例えば、Frazer他の論文、Hyaluronan、Sources
Turnover and Metabolism、Clinical Impact of Bone a
nd Connective Markers、31〜49頁、（Acad.Press社、1
989年）、Smedsrodの論文、「Catabolism in Liver Sin
usoids」、上記文献中51〜73頁、およびHeinegardの論
文、Brit.J.Rheumatol.、30（Suppl.1）、21〜24頁、19
91年を参照）。さらに、ある種の分子がいくつもの異な
る結合組織中に存在し、確かめられていないその分子の
循環濃度に基づいて特定の組織の代謝に関与している。
特定分子の濃度によって問題の組織の代謝を追跡できる
場合でも、これらの分子は、疾患の段階で、その大量が
または結合組織が失われたときに、検出できない濃度ま
で減少するかまたは構造が生化学的に変化する。
する信頼できる指標の同定、並びにこれら指標を検出す
る検定法の開発は、難しい課題であることが分かってき
た。ある種の放出されたフラグメントと分子は、リンパ
節、肝臓および食作用によって循環系から迅速に除去さ
れる（例えば、Frazer他の論文、Hyaluronan、Sources
Turnover and Metabolism、Clinical Impact of Bone a
nd Connective Markers、31〜49頁、（Acad.Press社、1
989年）、Smedsrodの論文、「Catabolism in Liver Sin
usoids」、上記文献中51〜73頁、およびHeinegardの論
文、Brit.J.Rheumatol.、30（Suppl.1）、21〜24頁、19
91年を参照）。さらに、ある種の分子がいくつもの異な
る結合組織中に存在し、確かめられていないその分子の
循環濃度に基づいて特定の組織の代謝に関与している。
特定分子の濃度によって問題の組織の代謝を追跡できる
場合でも、これらの分子は、疾患の段階で、その大量が
または結合組織が失われたときに、検出できない濃度ま
で減少するかまたは構造が生化学的に変化する。
したがって、当然のことであるが、検定法特に血清を
利用する検定法（特定のタンパク質の濃度を関節疾患の
活性と関連づける検定法）を開発する試みが成功不成功
を交わえ行わてれいる。Rohdeと同僚は、リウマチ様関
節炎（RA）の患者のアミノ末端のIII型プロコラーゲン
ペプチドとその分解生成物の血清中濃度の放射線免疫検
定法（RIA）を報告している（Rhode他の論文、Eur.J.Cl
in.Invesrt.,9巻、451〜459頁、1979年）。このプロペ
プチド（Ｐ−III−NP）は、いくつもの体液中に検出す
ることができる。その後の報告で、Rhodeらの放射線免
疫検定法を用いてＰ−III−NPの血清中濃度を疾患の活
性に関連づける試みがなさている（Ｈφrslev−Peterse
n他の論文、Arth.and Rheum.第５巻、592〜599頁、1986
年）。Ｐ−III−NPの血清中濃度は、活性RAの患者の場
合、著しく上昇するが、この濃度は不活性RAの患者でも
同様の程度まで上昇するので、これら二つの状態をＰ−
III−NPの濃度だけに基づいて識別することは困難であ
る。
利用する検定法（特定のタンパク質の濃度を関節疾患の
活性と関連づける検定法）を開発する試みが成功不成功
を交わえ行わてれいる。Rohdeと同僚は、リウマチ様関
節炎（RA）の患者のアミノ末端のIII型プロコラーゲン
ペプチドとその分解生成物の血清中濃度の放射線免疫検
定法（RIA）を報告している（Rhode他の論文、Eur.J.Cl
in.Invesrt.,9巻、451〜459頁、1979年）。このプロペ
プチド（Ｐ−III−NP）は、いくつもの体液中に検出す
ることができる。その後の報告で、Rhodeらの放射線免
疫検定法を用いてＰ−III−NPの血清中濃度を疾患の活
性に関連づける試みがなさている（Ｈφrslev−Peterse
n他の論文、Arth.and Rheum.第５巻、592〜599頁、1986
年）。Ｐ−III−NPの血清中濃度は、活性RAの患者の場
合、著しく上昇するが、この濃度は不活性RAの患者でも
同様の程度まで上昇するので、これら二つの状態をＰ−
III−NPの濃度だけに基づいて識別することは困難であ
る。
RAの患者の他の結合組織の代謝物と成分の血清中濃度
の検定が、治療のプロトコルに関連して試みられ、その
プロトコルの成功が評価されたが、やはり成功と不成功
が混じった状態であった。例えば、Ｈφrslev−Peterse
n他の論文（上記文献）は、Ｐ−III−NP、免疫反応性プ
ロピルヂヒドロキシラーゼタンパク質（1RPH）、IV型コ
ラーゲンの7S領域（Col IV、7S）およびラミニンのフ
ラグメントPI（Ｓ−Lam）（これらは、細胞外介在コラ
ーゲン類と基底膜類の代謝に関連している）の血清中濃
度を測定した。Ｐ−III−NP、1RPHおよびCol IV、7Sの
血清中濃度は、RA患者の場合（健康な成人と比べて）上
昇したが、その疾患が明らかに寛解していて、正常状態
まで減少しなかった。また、Ｓ−Lamの濃度は、活性RA
患者と不活性RA患者の両者ともに正常のままであった。
したがって、これらのタンパク質的血清中の存在と量
は、RAの経過または寛解と明確な相関関係がないようで
ある。
の検定が、治療のプロトコルに関連して試みられ、その
プロトコルの成功が評価されたが、やはり成功と不成功
が混じった状態であった。例えば、Ｈφrslev−Peterse
n他の論文（上記文献）は、Ｐ−III−NP、免疫反応性プ
ロピルヂヒドロキシラーゼタンパク質（1RPH）、IV型コ
ラーゲンの7S領域（Col IV、7S）およびラミニンのフ
ラグメントPI（Ｓ−Lam）（これらは、細胞外介在コラ
ーゲン類と基底膜類の代謝に関連している）の血清中濃
度を測定した。Ｐ−III−NP、1RPHおよびCol IV、7Sの
血清中濃度は、RA患者の場合（健康な成人と比べて）上
昇したが、その疾患が明らかに寛解していて、正常状態
まで減少しなかった。また、Ｓ−Lamの濃度は、活性RA
患者と不活性RA患者の両者ともに正常のままであった。
したがって、これらのタンパク質的血清中の存在と量
は、RAの経過または寛解と明確な相関関係がないようで
ある。
また、同様の難しさによって、他の結合組織の疾患の
経過に対する信頼できる指標の同定が妨げられている。
したがって、結合組織代謝に対する信頼できる指標とし
て役立つ候補的分子とフラグメントの同定は、臨床化学
の研究の重要な目標である。この目的のため、マトリッ
クス生成細胞による特定のタンパク質の発現が、抗原の
免疫検定法および候補的指標タンパク質をコードするmR
NAのハイブリッド形成検定法によって評価された。しか
し、細胞外マトリックスからのタンパク質の単離は、そ
のマトリックスの多数の成分になる分泌タンパク質の同
定に限定される。そのため、候補的タンパク質の同定は
制限された。
経過に対する信頼できる指標の同定が妨げられている。
したがって、結合組織代謝に対する信頼できる指標とし
て役立つ候補的分子とフラグメントの同定は、臨床化学
の研究の重要な目標である。この目的のため、マトリッ
クス生成細胞による特定のタンパク質の発現が、抗原の
免疫検定法および候補的指標タンパク質をコードするmR
NAのハイブリッド形成検定法によって評価された。しか
し、細胞外マトリックスからのタンパク質の単離は、そ
のマトリックスの多数の成分になる分泌タンパク質の同
定に限定される。そのため、候補的タンパク質の同定は
制限された。
1992年に、この発明の発明者らは、マトリックス形成
細胞が分泌する全てのタンク質の同定法を報告した（Jo
hansen他の論文、J.Bone and Min.Res.、第７巻、501
〜512頁、1992年）。この方法を用いて、40kDのタンパ
ク質をヒト骨細胞の分泌タンパク質として同定した。こ
の発明の発明者らは、上記タンパク質（そのＮ末端の最
初の３個のアミノ酸と分子量にちなんでYKL−40と命名
した）が骨におけるビタミンＤの作用に役割を果してい
るという仮設を立てた。YKL−40は、その乳腺が退行し
つつある非泌乳雌牛の乳房の分泌物中に存在していると
Rejmanらが同定したのと同じタンパク質のようである
（Rejman他の論文、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第1
50巻、329〜334頁、1988年）。
細胞が分泌する全てのタンク質の同定法を報告した（Jo
hansen他の論文、J.Bone and Min.Res.、第７巻、501
〜512頁、1992年）。この方法を用いて、40kDのタンパ
ク質をヒト骨細胞の分泌タンパク質として同定した。こ
の発明の発明者らは、上記タンパク質（そのＮ末端の最
初の３個のアミノ酸と分子量にちなんでYKL−40と命名
した）が骨におけるビタミンＤの作用に役割を果してい
るという仮設を立てた。YKL−40は、その乳腺が退行し
つつある非泌乳雌牛の乳房の分泌物中に存在していると
Rejmanらが同定したのと同じタンパク質のようである
（Rejman他の論文、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第1
50巻、329〜334頁、1988年）。
以下に詳細に述べるように、その後、YKL−40は、リ
ウマチ様関節炎、骨関節症などの異種の病状を有する疾
患を含む関節疾患の信頼できる指標として役立つことが
発見されたのである。予想外のことであったが、YKL−4
0の血清中濃度は、乳癌細胞が転移している患者の場合
著しく上昇し、特にその癌が再発し転移してから比較的
短期間生存する患者の場合に著しく上昇することがで発
見されたのである。さらに、この発明の発明者らは、肝
臓、前立腺などの臓器の結合組織が分解しているヒトの
血清中に、著しく高い濃度のYKL−40が出現することを
測定した。
ウマチ様関節炎、骨関節症などの異種の病状を有する疾
患を含む関節疾患の信頼できる指標として役立つことが
発見されたのである。予想外のことであったが、YKL−4
0の血清中濃度は、乳癌細胞が転移している患者の場合
著しく上昇し、特にその癌が再発し転移してから比較的
短期間生存する患者の場合に著しく上昇することがで発
見されたのである。さらに、この発明の発明者らは、肝
臓、前立腺などの臓器の結合組織が分解しているヒトの
血清中に、著しく高い濃度のYKL−40が出現することを
測定した。
したがって、この明細書で述べている生体試料中のYK
L−40の濃度を検出し定量する方法は、関節疾患のみな
らず癌細胞の転移の経過を示す手段を提供する。さら
に、YKL−40の血清中濃度と結合組織の代謝との明らか
な関係に基づいて、上記の方法は、結合組織の代謝が役
割を演じる、例えば骨粗しょう症のような他の疾患の診
断と監視を行うのに有用であろうと予測することができ
る。
L−40の濃度を検出し定量する方法は、関節疾患のみな
らず癌細胞の転移の経過を示す手段を提供する。さら
に、YKL−40の血清中濃度と結合組織の代謝との明らか
な関係に基づいて、上記の方法は、結合組織の代謝が役
割を演じる、例えば骨粗しょう症のような他の疾患の診
断と監視を行うのに有用であろうと予測することができ
る。
発明の概要 疾患の活性を結合組織マトリックスの損失および／ま
たは合成に関連づけることができる疾患の指標を検出し
定量することは、疾患とその改善の両方の経過を診断し
監視するのに有益である。その指標の一つが約40kDの分
子量を有するタンパク質のYKL−40であり、このタンパ
ク質は、関節疾患のヒト患者の血液と滑液中ならびに乳
癌または肝臓などの臓器の障害がみられるヒト患者の血
液中の濃度が高いことが発見されたのである。
たは合成に関連づけることができる疾患の指標を検出し
定量することは、疾患とその改善の両方の経過を診断し
監視するのに有益である。その指標の一つが約40kDの分
子量を有するタンパク質のYKL−40であり、このタンパ
ク質は、関節疾患のヒト患者の血液と滑液中ならびに乳
癌または肝臓などの臓器の障害がみられるヒト患者の血
液中の濃度が高いことが発見されたのである。
これらの症状の共通点は、それらの結合組織の損失に
対する関係である。具体的に述べると、関節疾患での結
合組織の損失は、その疾患の過程で放出される酵素によ
って分解されることが原因である。癌細胞の転移の場合
は、血管壁およびおそらく身体臓器の結合組織が分解し
て原発癌組織から細胞が移動できるようになると考えら
れる。同様に、硬変症のような臓器の退行変性疾患にお
ける臓器組織の損失の場合は、その臓器内の結合組織も
分解されていると考えられる。
対する関係である。具体的に述べると、関節疾患での結
合組織の損失は、その疾患の過程で放出される酵素によ
って分解されることが原因である。癌細胞の転移の場合
は、血管壁およびおそらく身体臓器の結合組織が分解し
て原発癌組織から細胞が移動できるようになると考えら
れる。同様に、硬変症のような臓器の退行変性疾患にお
ける臓器組織の損失の場合は、その臓器内の結合組織も
分解されていると考えられる。
したがって、この発明の目的は、YKL−40に対して特
異的な抗体、および適切な場合には検出可能に標識をつ
けた抗原（YKL−40）、を用いて生体試料中のYKL−40を
検出し定量する方法を提供するものである。
異的な抗体、および適切な場合には検出可能に標識をつ
けた抗原（YKL−40）、を用いて生体試料中のYKL−40を
検出し定量する方法を提供するものである。
この発明の他の目的は、生体試料中に検出されるYKL
−40の濃度によって示されているような結合組織の損失
および／または合成に関連する疾患の診断方法を提供す
ることである。この点について、この発明は、関節疾患
（例えばRA）、癌細胞の転移（例えば、乳癌の場合にお
ける）、骨の結合組織の損失に関連する疾患（例えば、
骨粗しょう症および骨関節症）、ならびに臓器の結合組
織および／または他の組織の損失に関連する疾患（例え
ば肝硬変）を診断するのに、特に有用であると考えられ
る。
−40の濃度によって示されているような結合組織の損失
および／または合成に関連する疾患の診断方法を提供す
ることである。この点について、この発明は、関節疾患
（例えばRA）、癌細胞の転移（例えば、乳癌の場合にお
ける）、骨の結合組織の損失に関連する疾患（例えば、
骨粗しょう症および骨関節症）、ならびに臓器の結合組
織および／または他の組織の損失に関連する疾患（例え
ば肝硬変）を診断するのに、特に有用であると考えられ
る。
この発明の他の目的は、YKL−40の濃度を定量して、Y
KL−40の存在に関連する結合組織の代謝に関係がある疾
患の経過および／または改善を監視する方法を提供する
ことである。やはり、この発明は、関節疾患（例えばR
A）、癌細胞の転移（例えば、乳癌の場合）、骨粗しょ
う症、骨関節症などの骨の結合組織の損失に関連する疾
患、および臓器の結合組織の損失をもたらす例えば肝硬
変のような疾患の経過および／または改善を追跡するの
に、特に有用であると考えられる。
KL−40の存在に関連する結合組織の代謝に関係がある疾
患の経過および／または改善を監視する方法を提供する
ことである。やはり、この発明は、関節疾患（例えばR
A）、癌細胞の転移（例えば、乳癌の場合）、骨粗しょ
う症、骨関節症などの骨の結合組織の損失に関連する疾
患、および臓器の結合組織の損失をもたらす例えば肝硬
変のような疾患の経過および／または改善を追跡するの
に、特に有用であると考えられる。
図面の簡単な説明 図１は、実質的に純粋な血清YKL−40の、ゲル濾過カ
ラムの溶出位置を示す。
ラムの溶出位置を示す。
図２は、炎症性リウマチ関節疾患がみられるヒト患者
から採集した生体試料（血清と滑液）中のYKL−40を放
射線免疫検定法で測定した結果を示す。精製されたYKL
−40を●印で示す。健康人のYKL−40の血清中濃度を○
で示し、リウマチ様関節炎の患者由来の血清中のYKL−4
0の濃度を△印で示し、そしてリウマチ様関節炎の患者
の滑液中のYKL−40の濃度を□印で示す。
から採集した生体試料（血清と滑液）中のYKL−40を放
射線免疫検定法で測定した結果を示す。精製されたYKL
−40を●印で示す。健康人のYKL−40の血清中濃度を○
で示し、リウマチ様関節炎の患者由来の血清中のYKL−4
0の濃度を△印で示し、そしてリウマチ様関節炎の患者
の滑液中のYKL−40の濃度を□印で示す。
図３は、関節疾患にかかっていると診断されたヒト患
者から採集した血清中のYKL−40および関節疾患の他の
生化学的指標の検定結果を示す。
者から採集した血清中のYKL−40および関節疾患の他の
生化学的指標の検定結果を示す。
図４（ａ）〜（ｂ）は、RAに対するメチルプレドニソ
ロン（MP）による治療の効果についての１年間の研究結
果における57名の活性RAの患者の血清中YKL−40の血清
中ヒアルロナンの濃度の変化を示す。MPによる治療を受
けた患者は図中に●印で示し、一方、対照群の患者はプ
ラシーボ（偽薬）を投与された（○印で示す）。全ての
患者がペニシラミンまたはアザチオブリンを投与されて
いた。
ロン（MP）による治療の効果についての１年間の研究結
果における57名の活性RAの患者の血清中YKL−40の血清
中ヒアルロナンの濃度の変化を示す。MPによる治療を受
けた患者は図中に●印で示し、一方、対照群の患者はプ
ラシーボ（偽薬）を投与された（○印で示す）。全ての
患者がペニシラミンまたはアザチオブリンを投与されて
いた。
図５（ａ）〜（ｂ）は、RAに対するメチルプレドニソ
ロン（MP）による治療の効果についての１年間の研究結
果における57名の活性RAの患者の血清中YKL−40と血清
中ヒアルロナンの濃度の変化を示す。MPによる治療を受
けた患者は図中に●印で示し、一方、対照群の患者はプ
ラシーボ投与された（○印で示す）。全ての患者がペニ
シラミンまたはアザチオブリンを投与されていた。各被
検者について、最初の濃度を100％とし、その後の値は
全て各々の最初の値の百分率で表した。
ロン（MP）による治療の効果についての１年間の研究結
果における57名の活性RAの患者の血清中YKL−40と血清
中ヒアルロナンの濃度の変化を示す。MPによる治療を受
けた患者は図中に●印で示し、一方、対照群の患者はプ
ラシーボ投与された（○印で示す）。全ての患者がペニ
シラミンまたはアザチオブリンを投与されていた。各被
検者について、最初の濃度を100％とし、その後の値は
全て各々の最初の値の百分率で表した。
図６は、その癌が再発し転移した後の乳癌患者60名
（年齢29〜78歳）について測定したYKL−40血清中濃度
を、各患者がその後に生存した期間の長さとの関係を示
す。カプラン・メイヤー（Kaplan−Meier）生存曲線を
示す。
（年齢29〜78歳）について測定したYKL−40血清中濃度
を、各患者がその後に生存した期間の長さとの関係を示
す。カプラン・メイヤー（Kaplan−Meier）生存曲線を
示す。
図７は、年齢が20〜29歳の137名の疾患なしの女性由
来の血清と滑液中に検出されたYKL−40の濃度を示す。
来の血清と滑液中に検出されたYKL−40の濃度を示す。
図８は、乳癌患者のYKL−40の血清中濃度（図６につ
いて述べたのと同様にして測定）の同定し、そして各患
者がその後その疾患が原因で死亡した時を示すグラフで
ある。これらのデータは、患者が満たした、この試験に
入れるための選択基準（実施例VIIIに記載されている）
に従って確認されている。●または○印＝選択基準＃１
を満たしている患者、□または■＝乳癌が再発していな
い患者、×＝選択基準＃２を満たしいる患者、および／
または△＝選択基準＃３を満たしている患者。白抜きと
×の記号は、記録した時点でなお生存している患者を示
し、黒ぬりの記号は、記録した時点で志望していた患者
を示す。
いて述べたのと同様にして測定）の同定し、そして各患
者がその後その疾患が原因で死亡した時を示すグラフで
ある。これらのデータは、患者が満たした、この試験に
入れるための選択基準（実施例VIIIに記載されている）
に従って確認されている。●または○印＝選択基準＃１
を満たしている患者、□または■＝乳癌が再発していな
い患者、×＝選択基準＃２を満たしいる患者、および／
または△＝選択基準＃３を満たしている患者。白抜きと
×の記号は、記録した時点でなお生存している患者を示
し、黒ぬりの記号は、記録した時点で志望していた患者
を示す。
図９は、乳癌の転移の主要部位（転移が起こっている
場合）に関連する再発性転移乳癌に関する試験で、患者
の血清中に検出されたYKL−40の濃度を示す。これらの
データは、患者が満たした、この試験に入れるための選
択基準（実施例VIIIに記載されている）にしたがって確
認されている。●＝選択基準＃１を満たしている患者、
□＝乳ガンが再発していない患者、×＝選択基準＃２を
満たしている患者、および＝選択基準＃３を満たしてい
る患者。
場合）に関連する再発性転移乳癌に関する試験で、患者
の血清中に検出されたYKL−40の濃度を示す。これらの
データは、患者が満たした、この試験に入れるための選
択基準（実施例VIIIに記載されている）にしたがって確
認されている。●＝選択基準＃１を満たしている患者、
□＝乳ガンが再発していない患者、×＝選択基準＃２を
満たしている患者、および＝選択基準＃３を満たしてい
る患者。
図10は、骨への転移はあるが内臓は癌におかされてい
ない再発性乳癌に関する試験で、患者の血清中に検出さ
れたYKL−40の濃度を示す。これらのデータは、患者が
満たした、この試験に入れるための選択基準（実施例VI
IIに記載されている）にしたがって確認されている。●
＝選択基準＃１を満たしている患者、□＝乳癌が再発し
ていない患者、×＝選択基準＃２を満たしている患者、
および＝選択基準＃３を満たしている患者。
ない再発性乳癌に関する試験で、患者の血清中に検出さ
れたYKL−40の濃度を示す。これらのデータは、患者が
満たした、この試験に入れるための選択基準（実施例VI
IIに記載されている）にしたがって確認されている。●
＝選択基準＃１を満たしている患者、□＝乳癌が再発し
ていない患者、×＝選択基準＃２を満たしている患者、
および＝選択基準＃３を満たしている患者。
発明の詳細な説明 A.定義 以下の定義は、この発明の考案を簡単にするため提供
するものである。したがって、これらの定義がこの発明
を限定しているとみなすべきではなく、この発明は、後
述の特許請求の範囲によって範囲が定義される。
するものである。したがって、これらの定義がこの発明
を限定しているとみなすべきではなく、この発明は、後
述の特許請求の範囲によって範囲が定義される。
1.「抗体」としては、YKL−40タンパク質のエピトープ
決定因子を捕捉することができるFabおよびＦ（ab′）
２などの無傷の分子とそのフラグメントが含まれる。
決定因子を捕捉することができるFabおよびＦ（ab′）
２などの無傷の分子とそのフラグメントが含まれる。
2.「抗原」（この発明の検定法に関連して使用される場
合）は、YKL−40タンパク質および／またはその免疫原
性ペプチドフラグメントを意味する。YKL−40の遺伝子
の全コーディング領域は、配列番号:4として記載してあ
る。この発明には、YKL−40タンパク質とその免疫原性
ペプチドフラグメントが含まれると解される。
合）は、YKL−40タンパク質および／またはその免疫原
性ペプチドフラグメントを意味する。YKL−40の遺伝子
の全コーディング領域は、配列番号:4として記載してあ
る。この発明には、YKL−40タンパク質とその免疫原性
ペプチドフラグメントが含まれると解される。
3.「哺乳類」という用語には、この明細書で用いる場
合、ヒトおよび非ヒトの両者が含まれる。
合、ヒトおよび非ヒトの両者が含まれる。
4.「mAb」はモノクローナル抗体を意味する。
5.「実質的に純粋の」という用語は、YKL−40を説明す
るのに用いる場合、YKL−40とともに天然に見出される
他の分子を特に含有していない実質的に無傷の分子を意
味する。
るのに用いる場合、YKL−40とともに天然に見出される
他の分子を特に含有していない実質的に無傷の分子を意
味する。
6.「疾患状態」は、哺乳類の疾病または損傷を意味す
る。
る。
7.哺乳類の疾患状態でのYKL−40の役割に関する「関連
する」という用語は、哺乳類の組織または体液中へのYK
L−40の放出を意味し、その放出は疾患状態中またはそ
の開始時に、疾患状態が開始すなわち発生した結果起こ
る。
する」という用語は、哺乳類の組織または体液中へのYK
L−40の放出を意味し、その放出は疾患状態中またはそ
の開始時に、疾患状態が開始すなわち発生した結果起こ
る。
9.「改善する」という用語は、疾患状態の寛解または治
癒を含めて疾患状態の重症度または悪化が軽減すること
を意味する。
癒を含めて疾患状態の重症度または悪化が軽減すること
を意味する。
10.YKL−40を「含有する」結合組織は、分泌されたYKL
−40が作用しているかまたはYKL−40が分泌されている
結合組織を意味する。
−40が作用しているかまたはYKL−40が分泌されている
結合組織を意味する。
B.YKL−40の単離と精製 この発明の方法によるすべての検定法に用いる抗体お
よびこの発明の方法による競合検定法に用いる抗原を生
成させるために、YKL−40は、好ましくは実質的に純粋
の形態で生体試料から得るかまたは合成しなければなら
ない。天然のYKL−40は、YKL−40が存在していることが
知られている任意の哺乳類の体液または組織から得るこ
とができる。YKL−40の哺乳類中への自然の分布はまだ
完全に分かっていないが、YKL−40は、血清、滑液、お
よび軟骨細胞と骨肉腫細胞（MG63細胞系、米国、メリー
ランド州、ロックビル所在のAmerican Type Culture
Colleotion［「ATCC」］）のならし培地の中に発見さ
れている。ノーザンブラット分析法によって、YKL−40
のmRNAが、肝臓では高レベルで、脳、腎臓および胎盤で
は弱く、ならびに心臓、肺および骨格筋では検出不能の
レベルで発現されていることが分かっている（Hakala他
の論文、J.Biol.Chem、第268巻、25803〜25810頁、1993
年）。
よびこの発明の方法による競合検定法に用いる抗原を生
成させるために、YKL−40は、好ましくは実質的に純粋
の形態で生体試料から得るかまたは合成しなければなら
ない。天然のYKL−40は、YKL−40が存在していることが
知られている任意の哺乳類の体液または組織から得るこ
とができる。YKL−40の哺乳類中への自然の分布はまだ
完全に分かっていないが、YKL−40は、血清、滑液、お
よび軟骨細胞と骨肉腫細胞（MG63細胞系、米国、メリー
ランド州、ロックビル所在のAmerican Type Culture
Colleotion［「ATCC」］）のならし培地の中に発見さ
れている。ノーザンブラット分析法によって、YKL−40
のmRNAが、肝臓では高レベルで、脳、腎臓および胎盤で
は弱く、ならびに心臓、肺および骨格筋では検出不能の
レベルで発現されていることが分かっている（Hakala他
の論文、J.Biol.Chem、第268巻、25803〜25810頁、1993
年）。
ならし培地は、好ましくはRPMI1640血清なし培地（米
国、カリフォルニア州、アービン所在のIrvine Scient
ific社）を用い、当該技術分野で公知の方法にしたがっ
てYKL−40産生細胞を培養することによって調製するこ
とができる。YKL−40は、当該技術分野で公知の方法、
例えば、アフィニティークロマトグラフィまたはゲル濾
過法（例えば、米国、ニュージャージー州、ピスカタウ
ェイ所在のPharmacia社から入手できるSEPHACRYL Ｓ−
200−HR樹脂を使用）などによって精製される。YKL−40
は、分子量が約40kDである。そのＮ末端のアミノ酸配列
は、配列番号:1として挙げた配列に示してある。YKL−4
0の遺伝子の全コーディング領域は、配列番号:4に入っ
ている。そのＮ末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列
（内部アミノ酸配列は、配列番号:2（「YKL−40ペプチ
ドＡ」）と配列番号3:（「YKL−40ペプチドＢ」）に示
してある）が、細菌の多糖ヒドロラーゼ（キチナーゼ）
と実質的に相同であることは、YKL−40が結合組織の多
糖成分を分解するという結論を裏付けている。具体的に
述べると、配列番号:2は、キチナーゼの内部アミノ酸配
列の14/19残基と相関関係があり、一方YKL−40のＮ末端
の配列の残基が約50％がキチナーゼのＮ末端配列（配列
番号:3）と相関関係がある。また、YKL−40は、活性化
されたマウスマクロファージ（PIR受託番号第S27879
号）が分泌するタンパク質と実質的に同じ配列を有して
いる。配列の整列状態にいくらか差があるが、YKL−40
の完全な383個の残基の配列（受託番号第M80927号、配
列番号:4を参照）の26〜359位の残基と、505個の残基の
マクロファージ分泌タンパク質の27〜369位の残基との
間に、142個の同一性がある。
国、カリフォルニア州、アービン所在のIrvine Scient
ific社）を用い、当該技術分野で公知の方法にしたがっ
てYKL−40産生細胞を培養することによって調製するこ
とができる。YKL−40は、当該技術分野で公知の方法、
例えば、アフィニティークロマトグラフィまたはゲル濾
過法（例えば、米国、ニュージャージー州、ピスカタウ
ェイ所在のPharmacia社から入手できるSEPHACRYL Ｓ−
200−HR樹脂を使用）などによって精製される。YKL−40
は、分子量が約40kDである。そのＮ末端のアミノ酸配列
は、配列番号:1として挙げた配列に示してある。YKL−4
0の遺伝子の全コーディング領域は、配列番号:4に入っ
ている。そのＮ末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列
（内部アミノ酸配列は、配列番号:2（「YKL−40ペプチ
ドＡ」）と配列番号3:（「YKL−40ペプチドＢ」）に示
してある）が、細菌の多糖ヒドロラーゼ（キチナーゼ）
と実質的に相同であることは、YKL−40が結合組織の多
糖成分を分解するという結論を裏付けている。具体的に
述べると、配列番号:2は、キチナーゼの内部アミノ酸配
列の14/19残基と相関関係があり、一方YKL−40のＮ末端
の配列の残基が約50％がキチナーゼのＮ末端配列（配列
番号:3）と相関関係がある。また、YKL−40は、活性化
されたマウスマクロファージ（PIR受託番号第S27879
号）が分泌するタンパク質と実質的に同じ配列を有して
いる。配列の整列状態にいくらか差があるが、YKL−40
の完全な383個の残基の配列（受託番号第M80927号、配
列番号:4を参照）の26〜359位の残基と、505個の残基の
マクロファージ分泌タンパク質の27〜369位の残基との
間に、142個の同一性がある。
YKL−40が所定の疾患状態で機能する機構についての
特定の理論によってこの発明は限定されないが、上記の
配列の同一性は、YKL−40が、細胞の細胞外環境中のま
だ同定されていない巨大分子のグリコシド結合を加水分
解する酵素であることを強く示唆している。キチン自体
は、脊椎動物中に発見されておらず、かつYKL−40は、
明らかにキチナーゼ活性をもっていないので、恐らく、
先祖のキチナーゼが分岐進化して脊椎動物の酵素の特異
性が変化し、その結果現在はキチナーゼが標的としてい
るのとは異なるグリコシド結合を開裂するのであろう。
特定の理論によってこの発明は限定されないが、上記の
配列の同一性は、YKL−40が、細胞の細胞外環境中のま
だ同定されていない巨大分子のグリコシド結合を加水分
解する酵素であることを強く示唆している。キチン自体
は、脊椎動物中に発見されておらず、かつYKL−40は、
明らかにキチナーゼ活性をもっていないので、恐らく、
先祖のキチナーゼが分岐進化して脊椎動物の酵素の特異
性が変化し、その結果現在はキチナーゼが標的としてい
るのとは異なるグリコシド結合を開裂するのであろう。
健康な結合組織中で、YKL−40は、組織を正常に改造
する役割を果たしている。結合組織の分解性疾患に冒さ
れているヒトの血清と滑液の中に以下に述べるように検
出されるYKL−40が著しく増大しかつ健康な細胞中にはY
KL−40は明らかに存在しないことから、YKL−40に関連
する疾患でのYKL−40の産生および／または分泌は、未
知の疾患の過程によって異常なレベルまで上昇すると考
えられる。したがって、YKL−40は、単に分解された結
合組織の構造成分ではなくて、疾患の過程で活発な役割
を演じる細胞産物のようである。したがって、分泌され
たYKL−40が作用するままたはYKL−40が分泌される結合
組織は、便宜上、この明細書ではYKL−40「含有」結合
組織と呼ぶ。
する役割を果たしている。結合組織の分解性疾患に冒さ
れているヒトの血清と滑液の中に以下に述べるように検
出されるYKL−40が著しく増大しかつ健康な細胞中にはY
KL−40は明らかに存在しないことから、YKL−40に関連
する疾患でのYKL−40の産生および／または分泌は、未
知の疾患の過程によって異常なレベルまで上昇すると考
えられる。したがって、YKL−40は、単に分解された結
合組織の構造成分ではなくて、疾患の過程で活発な役割
を演じる細胞産物のようである。したがって、分泌され
たYKL−40が作用するままたはYKL−40が分泌される結合
組織は、便宜上、この明細書ではYKL−40「含有」結合
組織と呼ぶ。
この発明の検定法に用いるYKL−40とその免疫原性フ
ラグメントは、当該技術分野で公知の方法によって合成
することもできる。従来の技術を利用し、全長の遺伝子
を当該技術分野で公知の適切な発現ベクターを使用して
発現させることができるし、または該ペプチドを、YKL
−40に対する導出アミノ酸配列に相当するアミノ酸を用
いて化学的に構築することができる。
ラグメントは、当該技術分野で公知の方法によって合成
することもできる。従来の技術を利用し、全長の遺伝子
を当該技術分野で公知の適切な発現ベクターを使用して
発現させることができるし、または該ペプチドを、YKL
−40に対する導出アミノ酸配列に相当するアミノ酸を用
いて化学的に構築することができる。
例えば、YKL−40は、過度の実験を行うことなく、α
−アミノ基をｔ−BOCまたはFMOCなどで保護する通常使
用されている方法で合成することができる。両方の方法
では、単一のアミノ酸がペプチドのＣ末端から出発して
各ステップで付加され段階的に合成が行われる（Coliga
n他の論文、「Current Protocols in Immunolog
y」、Wiley Interscience社、991、Unit ９参照）。
この発明のペプチド類は、0.1〜1.0mMolのアミン類/gポ
リマーを含有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体
を用いて、Merrifield、J.Am.Chem.Soc.、第85巻、2149
頁、1962年、およびStewartおよびYoungの論文、Solid
Phase Peptides Synthesis（Freeman、サンフラン
シスコ、27〜62頁、1969年）などに記載されている各種
の公知の固相ペプチド合成法によっても合成できる。
−アミノ基をｔ−BOCまたはFMOCなどで保護する通常使
用されている方法で合成することができる。両方の方法
では、単一のアミノ酸がペプチドのＣ末端から出発して
各ステップで付加され段階的に合成が行われる（Coliga
n他の論文、「Current Protocols in Immunolog
y」、Wiley Interscience社、991、Unit ９参照）。
この発明のペプチド類は、0.1〜1.0mMolのアミン類/gポ
リマーを含有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体
を用いて、Merrifield、J.Am.Chem.Soc.、第85巻、2149
頁、1962年、およびStewartおよびYoungの論文、Solid
Phase Peptides Synthesis（Freeman、サンフラン
シスコ、27〜62頁、1969年）などに記載されている各種
の公知の固相ペプチド合成法によっても合成できる。
この後著の方法では、化学合成が完了したとき、ペプ
チドは脱保護し、次いで液体HF−10％アニソールで約15
分間〜１時間０℃で処理してポリマーから間裂させるこ
とができる。試薬類を蒸発させた後、１％酢酸溶液を用
いてペプチドをポリマーから抽出し、次いで凍結乾燥し
て粗製物を得る。この粗製物は、通常、例えば、溶媒と
して５％の酢酸を用いるSephadex Ｇ−15のゲル濾過法
のような方法で精製することができる。カラムの適当な
画分を凍結乾燥して均質のペプチドまたはペプチド誘導
体が得られ、次にこれらは、アミノ酸分析法、薄層クロ
マトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外
吸収分光法、モル施光度、溶解度などの標準の方法によ
って特性を決定し、次いで固相エドマン分解法によって
定量することができる。
チドは脱保護し、次いで液体HF−10％アニソールで約15
分間〜１時間０℃で処理してポリマーから間裂させるこ
とができる。試薬類を蒸発させた後、１％酢酸溶液を用
いてペプチドをポリマーから抽出し、次いで凍結乾燥し
て粗製物を得る。この粗製物は、通常、例えば、溶媒と
して５％の酢酸を用いるSephadex Ｇ−15のゲル濾過法
のような方法で精製することができる。カラムの適当な
画分を凍結乾燥して均質のペプチドまたはペプチド誘導
体が得られ、次にこれらは、アミノ酸分析法、薄層クロ
マトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外
吸収分光法、モル施光度、溶解度などの標準の方法によ
って特性を決定し、次いで固相エドマン分解法によって
定量することができる。
また、YKL−40およびYKL−40ペプチド類を製造するの
に用いるDNA配列は、いくつもの方法で得ることができ
る。例えば、そのDNAは、該技術分野で公知のハイブリ
ッド形成法を用いて単離することができる。これらの方
法としては、限定されないが、次の方法がある。すなわ
ち、１）プローブを、ゲノムまたはcDNAのライブラリー
とハイブリッドを形成させて共有されているヌクレオチ
ド配列を検出する方法、２）発現ライブラリーを抗体で
選別して共有されている構造の特徴を検出する方法、お
よび３）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で合成する方法
である。
に用いるDNA配列は、いくつもの方法で得ることができ
る。例えば、そのDNAは、該技術分野で公知のハイブリ
ッド形成法を用いて単離することができる。これらの方
法としては、限定されないが、次の方法がある。すなわ
ち、１）プローブを、ゲノムまたはcDNAのライブラリー
とハイブリッドを形成させて共有されているヌクレオチ
ド配列を検出する方法、２）発現ライブラリーを抗体で
選別して共有されている構造の特徴を検出する方法、お
よび３）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で合成する方法
である。
ハイブリッド形成法は、各プローブが潜在的に、変性
二本鎖DNAの不均質混合物を含有しているハイブリッド
形成試料中の特定のDNA配列の完全な相補体である場
合、標識をつけた混合合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、組換えクローンを選別するのに有用である。
このような選別の場合、ハイブリッド形成は、一本鎖DN
Aまたは変性二本鎖DNAについて行うことが好ましい。ハ
イブリッド形成法は、問題のポリペプチドに関連するmR
NA配列の量が極端に少ない起源から誘導されたcDNAクト
ーンを検出するのに特に有用である。換言すれば、非特
異的結合を避けるために誘導したストリンジエントハイ
ブリッド形成条件（Maniatis、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、1984年）
を用いることによって、例えば、標的DNAに混合物中の
単一のプローブとハイブリッドを形成させることによっ
て、特定のcDANクローンをオートトラジオグラフィで視
覚化することができる。
二本鎖DNAの不均質混合物を含有しているハイブリッド
形成試料中の特定のDNA配列の完全な相補体である場
合、標識をつけた混合合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、組換えクローンを選別するのに有用である。
このような選別の場合、ハイブリッド形成は、一本鎖DN
Aまたは変性二本鎖DNAについて行うことが好ましい。ハ
イブリッド形成法は、問題のポリペプチドに関連するmR
NA配列の量が極端に少ない起源から誘導されたcDNAクト
ーンを検出するのに特に有用である。換言すれば、非特
異的結合を避けるために誘導したストリンジエントハイ
ブリッド形成条件（Maniatis、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、1984年）
を用いることによって、例えば、標的DNAに混合物中の
単一のプローブとハイブリッドを形成させることによっ
て、特定のcDANクローンをオートトラジオグラフィで視
覚化することができる。
YKL−40含有cDNAライブラリーは、cDNAから誘導され
た各種のmRNAを卵母細胞中に注射し、充分な時間をかけ
てそのcDAN遺伝子産物を発現させ、次いで、例えば、YK
L−40に対して特異的な抗体を用いるか、または繰り返
しモチーフのプロープとYKL−40に特徴的な組織発現パ
ターンとを用いることによって、所望のcDNA発現産物の
存在を試験することによって選別することができる。あ
るいは、cDNAライブラリーは、ポリペプチドに対して特
異的な抗体を用いて、少なくとも一つのエピトープを有
するYKL−40について間接的に選別することができる。
下記のＣ章で述べるように、このような抗体は、ポリク
ローナルまたはモノクローナルの抗体として誘導するこ
とが可能であり、YKL40cDNA（配列番号:4参照）の存在
を示す発現産物を検出するのに用いることができる。
た各種のmRNAを卵母細胞中に注射し、充分な時間をかけ
てそのcDAN遺伝子産物を発現させ、次いで、例えば、YK
L−40に対して特異的な抗体を用いるか、または繰り返
しモチーフのプロープとYKL−40に特徴的な組織発現パ
ターンとを用いることによって、所望のcDNA発現産物の
存在を試験することによって選別することができる。あ
るいは、cDNAライブラリーは、ポリペプチドに対して特
異的な抗体を用いて、少なくとも一つのエピトープを有
するYKL−40について間接的に選別することができる。
下記のＣ章で述べるように、このような抗体は、ポリク
ローナルまたはモノクローナルの抗体として誘導するこ
とが可能であり、YKL40cDNA（配列番号:4参照）の存在
を示す発現産物を検出するのに用いることができる。
適当なプローブが入手できるならば、核酸ハイブリッ
ド形成法による選別法によって任意の生物から任意の遺
伝子配列を単離することができる。問題のタンク質をコ
ードする配列の一部分に相当するオリゴヌクレオチドの
プローブは、化学合成することができる。これを行うに
は、アミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが分
かっていなければならないということが要求される。そ
のタンパク質をエンコードするDNA配列は、その遺伝コ
ードから導出できるが、そのコードの縮重を考慮しなけ
ればならない。配列が縮重している場合、混合付加反応
を行うことができる。これには、変性二本鎖DNAの不均
一混合物が含まれている。このような選別の場合、ハイ
ブリッド形成は、一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAについ
て実施することが好ましい。
ド形成法による選別法によって任意の生物から任意の遺
伝子配列を単離することができる。問題のタンク質をコ
ードする配列の一部分に相当するオリゴヌクレオチドの
プローブは、化学合成することができる。これを行うに
は、アミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが分
かっていなければならないということが要求される。そ
のタンパク質をエンコードするDNA配列は、その遺伝コ
ードから導出できるが、そのコードの縮重を考慮しなけ
ればならない。配列が縮重している場合、混合付加反応
を行うことができる。これには、変性二本鎖DNAの不均
一混合物が含まれている。このような選別の場合、ハイ
ブリッド形成は、一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAについ
て実施することが好ましい。
また、YKL−40またはそのフラグメントをエンコード
する特定のDNA配列は、１）ゲノムDNAから二本鎖DNA配
列を単離し、次いで２）目的とするペプチドに対して必
要なコドンを提供するDNA配列の化学的に製造する、こ
とによって得ることができる。
する特定のDNA配列は、１）ゲノムDNAから二本鎖DNA配
列を単離し、次いで２）目的とするペプチドに対して必
要なコドンを提供するDNA配列の化学的に製造する、こ
とによって得ることができる。
YKL−40をエンコードする遺伝子は、組換え発現ベク
ター中に挿入することができる。用語「組換え発現ベク
ター」は、適当な遺伝配列の挿入もしくは組み込みによ
って操作された、当該技術分野で公知のプラスミド、ウ
イルスまたは他の伝達体を意味する。この発現ベクター
は、宿主の挿入された遺伝配列を有効に転写できるよう
にするプロモータ配列を含有している。
ター中に挿入することができる。用語「組換え発現ベク
ター」は、適当な遺伝配列の挿入もしくは組み込みによ
って操作された、当該技術分野で公知のプラスミド、ウ
イルスまたは他の伝達体を意味する。この発現ベクター
は、宿主の挿入された遺伝配列を有効に転写できるよう
にするプロモータ配列を含有している。
宿主細胞の組換えDNAによる形質転換も、当該技術分
野の当業者に公知の通常の方法で実施できる。宿主がイ
ー・コリ（E.coli）のような原核生物の場合、DNAを取
り込むことができるコンピテント細胞は、指数的成長相
で培養したのち収穫し、次に当該技術分野で公知の手順
によってCaCl2法で処理した細胞から製造することがで
きる。あるいは、MgCl2またはRbClを使用することがで
きる。また、形質転換は、その宿主細胞に対する原形質
を調製した後、またはエレクトロポレーションで実施す
ることができる。
野の当業者に公知の通常の方法で実施できる。宿主がイ
ー・コリ（E.coli）のような原核生物の場合、DNAを取
り込むことができるコンピテント細胞は、指数的成長相
で培養したのち収穫し、次に当該技術分野で公知の手順
によってCaCl2法で処理した細胞から製造することがで
きる。あるいは、MgCl2またはRbClを使用することがで
きる。また、形質転換は、その宿主細胞に対する原形質
を調製した後、またはエレクトロポレーションで実施す
ることができる。
この発明によって提供される、微生物が発現したポリ
ペプチドまたはそのフラグメントの単離と精製は、分離
クロマトグラフィおよびモノクローナル抗体もしくはポ
リクローナル抗体を用いる免疫分離法を含む通常の方法
で実施することができる。
ペプチドまたはそのフラグメントの単離と精製は、分離
クロマトグラフィおよびモノクローナル抗体もしくはポ
リクローナル抗体を用いる免疫分離法を含む通常の方法
で実施することができる。
この発明のペプチド類とポリペプチド類には、YKL−4
0、YKL−40ペプチドおよびそれをエンコードするヌクレ
オチドの機能誘導体が含まれる。「機能誘導体」という
用語は、ある分子の「フラグメント」、「変異体」、
「類似体」または「化学的誘導体」を意味する。この発
明の任意のDNA配列のような分子の「フラグメント」に
は、その分子の任意のヌクレオチドのサブセットが含ま
れる。かような分子の「変異体」は、完全な分子または
そのフラグメントに実質的に類似している天然産生分子
を意味する。分子の「類似体」は、完全な分子またはそ
のフラグメントに実質的に類似している非天然産分子を
意味する。
0、YKL−40ペプチドおよびそれをエンコードするヌクレ
オチドの機能誘導体が含まれる。「機能誘導体」という
用語は、ある分子の「フラグメント」、「変異体」、
「類似体」または「化学的誘導体」を意味する。この発
明の任意のDNA配列のような分子の「フラグメント」に
は、その分子の任意のヌクレオチドのサブセットが含ま
れる。かような分子の「変異体」は、完全な分子または
そのフラグメントに実質的に類似している天然産生分子
を意味する。分子の「類似体」は、完全な分子またはそ
のフラグメントに実質的に類似している非天然産分子を
意味する。
両者の分子のアミノ酸配列が実質的に同じであれば、
その一方の分子はもう一つの分子に「実質的に類似して
いる」といわれる。実質的に類似のアミノ酸分子は類似
の生物活性を有している。したがって、２種の分子が類
似の活性を有している場合、その分子の一方が他方の分
子に見られない追加のアミノ酸残基を含有していても、
またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、上記用語
をこの明細書で用いるときは、両者の分子は変異体とみ
なす。
その一方の分子はもう一つの分子に「実質的に類似して
いる」といわれる。実質的に類似のアミノ酸分子は類似
の生物活性を有している。したがって、２種の分子が類
似の活性を有している場合、その分子の一方が他方の分
子に見られない追加のアミノ酸残基を含有していても、
またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、上記用語
をこの明細書で用いるときは、両者の分子は変異体とみ
なす。
さらに、ある分子が、通常はその分子の部分ではない
追加の化学的部分を含有している場合、別の分子の「化
学的誘導体」といわれる。このような部分によって、そ
の分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善す
ることができる。あるいは、これらの部分によって、そ
の分子の毒性を減少させたり、その分子の望ましくない
副作用を除くかもしくは少なくするなど、実施すること
ができる。上記のような作用を実現できる部分は、例え
ばRemington's Pharmaceutical Sciences,第16版、Ma
ck Publishing Co.社（米国、ペンシルバニア州、イ
ーストン所在）、1980年に開示されている。
追加の化学的部分を含有している場合、別の分子の「化
学的誘導体」といわれる。このような部分によって、そ
の分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善す
ることができる。あるいは、これらの部分によって、そ
の分子の毒性を減少させたり、その分子の望ましくない
副作用を除くかもしくは少なくするなど、実施すること
ができる。上記のような作用を実現できる部分は、例え
ばRemington's Pharmaceutical Sciences,第16版、Ma
ck Publishing Co.社（米国、ペンシルバニア州、イ
ーストン所在）、1980年に開示されている。
YKL−40の一次アミノ酸配列の小さな改変（修飾）を
行うと、この明細書に記載のYKL−40ペプチドと比べて
実質的に類似の活性を有するタンパク質とペプチドが得
られる。このような改変は、部位特異的突然変異誘発に
よって行うような意図的なものであってもよく、または
自然発生的なものでもよい。これらの改変によって産生
されるペプチドは、全て、YKL−40の生物活性が存在し
ている限り、この発明に含まれる。さらに、一つ以上の
アミノ酸を欠失させて、その生物活性を大きく変えるこ
となく生成分子の構造を改変することができる。この方
法によって、一層広い用途を有する小さな活性分子を生
成させることができる。例えば、酵素が望ましい触媒活
性または抗原活性を発揮するのに必要でない、アミノ末
端もしくはカルボキシ末端のアミノ酸を除くことができ
る。
行うと、この明細書に記載のYKL−40ペプチドと比べて
実質的に類似の活性を有するタンパク質とペプチドが得
られる。このような改変は、部位特異的突然変異誘発に
よって行うような意図的なものであってもよく、または
自然発生的なものでもよい。これらの改変によって産生
されるペプチドは、全て、YKL−40の生物活性が存在し
ている限り、この発明に含まれる。さらに、一つ以上の
アミノ酸を欠失させて、その生物活性を大きく変えるこ
となく生成分子の構造を改変することができる。この方
法によって、一層広い用途を有する小さな活性分子を生
成させることができる。例えば、酵素が望ましい触媒活
性または抗原活性を発揮するのに必要でない、アミノ末
端もしくはカルボキシ末端のアミノ酸を除くことができ
る。
C.YKL−40に対する抗体 ポリモノクローナルまたはモノクローナルの抗体を、
下記のこの発明の免疫検定法と治療法に用いることがで
きる。実質的な純粋なYKL−40または抗原性YKL−40ペプ
チドを適切な非ヒト哺乳類に、複数回、皮下または筋肉
内に注射することによってポリクローナル抗体を生成さ
せることができる。YKL−40ペプチドの抗原性は、その
ペプチドで免疫化された動物の抗体応答の大きさを測定
する通常の方法で測定することができる。一般に、抗YK
L−40抗体を生成させるために用いられるYKL−40ペプチ
ドは、YKL−40に対して比較的高い親和性を有する高力
価の抗体の産生を誘発するYKL−40ペプチドでなければ
ならない。
下記のこの発明の免疫検定法と治療法に用いることがで
きる。実質的な純粋なYKL−40または抗原性YKL−40ペプ
チドを適切な非ヒト哺乳類に、複数回、皮下または筋肉
内に注射することによってポリクローナル抗体を生成さ
せることができる。YKL−40ペプチドの抗原性は、その
ペプチドで免疫化された動物の抗体応答の大きさを測定
する通常の方法で測定することができる。一般に、抗YK
L−40抗体を生成させるために用いられるYKL−40ペプチ
ドは、YKL−40に対して比較的高い親和性を有する高力
価の抗体の産生を誘発するYKL−40ペプチドでなければ
ならない。
所望により、免疫化を行うペプチドは、当該技術分野
で公知の方法を用いて、接合によって担体タンパク質に
連結してもよい。ペプチドに化学的に連結される、この
ような通常用いられる担体としては、キーホール・リン
ペット・ヘモシアニン（KLH）、チログロブリン、ウシ
血清アルブミン（BSA）および破傷風毒素がある。その
連結されたペプチドは、動物（例えば、マウスまたはウ
サギ）を免疫化するのに用いられる。YKL−40は、哺乳
類の種に保存することができるので、YKL−40タンパク
質の免疫原性を高めるため担体タンパク質を使用するこ
とが好ましい。
で公知の方法を用いて、接合によって担体タンパク質に
連結してもよい。ペプチドに化学的に連結される、この
ような通常用いられる担体としては、キーホール・リン
ペット・ヘモシアニン（KLH）、チログロブリン、ウシ
血清アルブミン（BSA）および破傷風毒素がある。その
連結されたペプチドは、動物（例えば、マウスまたはウ
サギ）を免疫化するのに用いられる。YKL−40は、哺乳
類の種に保存することができるので、YKL−40タンパク
質の免疫原性を高めるため担体タンパク質を使用するこ
とが好ましい。
次に、上記哺乳類から採取した血液から抗体を得る。
ポリクローナル抗体を生成させるのに用いる方法は、当
該技術分野では公知である（例えば、Langone他編集、M
ethods of Enzymology,「Production of Antisera
With Small Doses of Immunogen:Multiple Intr
adermal Injections」,Acad.Press社、1981年参照）。
動物から産生されたポリクローナル抗体は、例えば、そ
の抗体が生成したペプチドが結合されているマトリック
スに結合させ、次いでそのマトリックスから溶離するこ
とによって、さらに精製することができる。当該技術分
野の当業者にとって、ポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体の精製および／または濃縮に用いる免疫学
的技術に共通の各種の方法は、公知である（例えば、Co
ligan他の論文、Unit ９、Current Protocols in I
mmunology、Wiley Interscience、1991年参照）。
ポリクローナル抗体を生成させるのに用いる方法は、当
該技術分野では公知である（例えば、Langone他編集、M
ethods of Enzymology,「Production of Antisera
With Small Doses of Immunogen:Multiple Intr
adermal Injections」,Acad.Press社、1981年参照）。
動物から産生されたポリクローナル抗体は、例えば、そ
の抗体が生成したペプチドが結合されているマトリック
スに結合させ、次いでそのマトリックスから溶離するこ
とによって、さらに精製することができる。当該技術分
野の当業者にとって、ポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体の精製および／または濃縮に用いる免疫学
的技術に共通の各種の方法は、公知である（例えば、Co
ligan他の論文、Unit ９、Current Protocols in I
mmunology、Wiley Interscience、1991年参照）。
しかし、産生されるYKL−40の抗体は、モノクローナ
ル抗体（「mAb」）が好ましい。モノクローナル抗体を
製造する場合は、マウスまたはラットを免疫化すること
が好ましい。「抗体」という用語には、この発明で用い
られる場合、エピトープ決定因子を捕捉できるFabおよ
びＦ（ab′）２などの無傷の分子とそのフラグメントが
含まれる。また、この明細書では、用語「この発明のmA
b」は、YKL−40に対して特異性を有するモノクローナル
抗体を意味する。
ル抗体（「mAb」）が好ましい。モノクローナル抗体を
製造する場合は、マウスまたはラットを免疫化すること
が好ましい。「抗体」という用語には、この発明で用い
られる場合、エピトープ決定因子を捕捉できるFabおよ
びＦ（ab′）２などの無傷の分子とそのフラグメントが
含まれる。また、この明細書では、用語「この発明のmA
b」は、YKL−40に対して特異性を有するモノクローナル
抗体を意味する。
mAbを分泌するハイブリッドーマを製造するのに用い
る一般的な方法は、公知である（KohlerとMilsteinの論
文、Nature、256巻、495頁、1975年）。要約すると、Ko
hlerとMilsteinが報告しているように、その方法は、黒
色腫、奇形癌、または子宮頸、グリオームもしくは肺の
癌がみられる５名の別個の患者の部位ドレーニングリン
パ節（regional draining lymph node）からリンパ
球を単離し（試料は外科試料から得た）、細胞をプール
し、その細胞をSHFP−１と融合させることで構成されて
いる。癌細胞系に結合する抗体を産生するハイブリッド
ーマを選別した。
る一般的な方法は、公知である（KohlerとMilsteinの論
文、Nature、256巻、495頁、1975年）。要約すると、Ko
hlerとMilsteinが報告しているように、その方法は、黒
色腫、奇形癌、または子宮頸、グリオームもしくは肺の
癌がみられる５名の別個の患者の部位ドレーニングリン
パ節（regional draining lymph node）からリンパ
球を単離し（試料は外科試料から得た）、細胞をプール
し、その細胞をSHFP−１と融合させることで構成されて
いる。癌細胞系に結合する抗体を産生するハイブリッド
ーマを選別した。
mAbのYKL−40特異性の確認は、比較的日常的な選別法
（例えば酵素結合イムノソルベント検定法、すなわち
「ELISA」法）を用いて、問題のmAbの基本的な反応パタ
ーンを測定することによって実施することができる。
（例えば酵素結合イムノソルベント検定法、すなわち
「ELISA」法）を用いて、問題のmAbの基本的な反応パタ
ーンを測定することによって実施することができる。
また、mAbを評価するため、被検mAbがこの発明のmAb
が上記のようにして単離されたYKL−40に結合するのを
妨げるか否かを測定することによって、過度に実験を行
わずに被検mAbがこの発明のmAbと同じ特異性を有するか
否かを測定することも可能である。被検mAbがこの発明
のmAbと競合する場合（この発明のmAbによる結合の際に
減少することによって示される）は、この２種のモノク
ローナル抗体は同じかまたは密接な類縁関係にあるエピ
トープに結合するようである。
が上記のようにして単離されたYKL−40に結合するのを
妨げるか否かを測定することによって、過度に実験を行
わずに被検mAbがこの発明のmAbと同じ特異性を有するか
否かを測定することも可能である。被検mAbがこの発明
のmAbと競合する場合（この発明のmAbによる結合の際に
減少することによって示される）は、この２種のモノク
ローナル抗体は同じかまたは密接な類縁関係にあるエピ
トープに結合するようである。
あるmAbがこの発明のmAbの特異性を有しているか否か
を測定するさらに別の方法は、この発明のmAbを、このm
Abが一般に反応する抗原とともにプリインキュベート
し、次いで被検mAbが、抗原を捕捉する性能を阻害され
るか否かを測定する方法である。被検mAbが阻害された
ならば、おそらく被検mAbはこの発明のmAbと同じかまた
は密接な類縁関係にあるエピトープ特異性を有してい
る。
を測定するさらに別の方法は、この発明のmAbを、このm
Abが一般に反応する抗原とともにプリインキュベート
し、次いで被検mAbが、抗原を捕捉する性能を阻害され
るか否かを測定する方法である。被検mAbが阻害された
ならば、おそらく被検mAbはこの発明のmAbと同じかまた
は密接な類縁関係にあるエピトープ特異性を有してい
る。
D.免疫検定法 使用される免疫検定法は、疾患がみられる患者のYKL
−40の濃度が、健康なヒトに存在している正常な濃度お
よび／または患者について測定されたバックグラウンド
濃度から区別できるよう定量的でなければならない。し
たがって、検出可能な標識を用いる固相の競合サンドイ
ッチ法（間接法または直接法）が好ましい。この標識
は、抗体のYKL−40抗原への結合を示す検出可能なシグ
ナルを提供する。この抗体または抗原は、放射性同位元
素、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およ
びコロイド金を含む、検出可能なシグナルを提供する当
該技術分野で公知の任意の標識で標識を付けることがで
きる。公知の検定法の中で、放射線免疫検定法（RIA）
がその感度からみて最も好ましい。したがって、放射性
同位元素が好ましい標識である。
−40の濃度が、健康なヒトに存在している正常な濃度お
よび／または患者について測定されたバックグラウンド
濃度から区別できるよう定量的でなければならない。し
たがって、検出可能な標識を用いる固相の競合サンドイ
ッチ法（間接法または直接法）が好ましい。この標識
は、抗体のYKL−40抗原への結合を示す検出可能なシグ
ナルを提供する。この抗体または抗原は、放射性同位元
素、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およ
びコロイド金を含む、検出可能なシグナルを提供する当
該技術分野で公知の任意の標識で標識を付けることがで
きる。公知の検定法の中で、放射線免疫検定法（RIA）
がその感度からみて最も好ましい。したがって、放射性
同位元素が好ましい標識である。
抗体に直接結合させることができるかまたはYKL−40
抗原に間接的に結合させることができる金属イオンの列
は、当該技術分野の当業者にとって公知であり、125I、
111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、90Yおよび201T
lがある。抗原結合特異性を犠牲にすることなく結合が
容易なことから好ましいのは、125I（ナトリウム塩、英
国、Amersham社）である。YKL−40に125Iで標識をつけ
ることは、Salacinski他の論文、Anal.Biochem.117巻、
136〜146頁、1981年に記載されている方法で行うことが
できる。125Iの標識をつけるのい用いるヨードジェン
（iodogen）（1,3,4,6−テトラクロロ−３α,6α−ジフ
ェニルグリコルリル）は、英国、チェスター所在のPier
ce and Warriner社から市販されている。
抗原に間接的に結合させることができる金属イオンの列
は、当該技術分野の当業者にとって公知であり、125I、
111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、90Yおよび201T
lがある。抗原結合特異性を犠牲にすることなく結合が
容易なことから好ましいのは、125I（ナトリウム塩、英
国、Amersham社）である。YKL−40に125Iで標識をつけ
ることは、Salacinski他の論文、Anal.Biochem.117巻、
136〜146頁、1981年に記載されている方法で行うことが
できる。125Iの標識をつけるのい用いるヨードジェン
（iodogen）（1,3,4,6−テトラクロロ−３α,6α−ジフ
ェニルグリコルリル）は、英国、チェスター所在のPier
ce and Warriner社から市販されている。
この発明の放射線免疫検定法は、実質的に等しい容積
のYKL−40抗血清とYKL−40トレーサとともにインキュベ
ートした基準また試料を使用する。標準と試料は、一般
に２回ずつ検定する。この発明の検定法の感度（検出限
界）は、約10μg/Lである。この文脈において、感度
は、ゼロ結合値（zero binding value）の標準偏差の
２倍に等しい検出可能な質量と定義する。標準曲線は、
一般に20〜100μg/Lの範囲で直線である。以下の実施例
で説明する検定法の検定内および検定間の変動係数は、
それぞれ＜6.5％と＜12％である。
のYKL−40抗血清とYKL−40トレーサとともにインキュベ
ートした基準また試料を使用する。標準と試料は、一般
に２回ずつ検定する。この発明の検定法の感度（検出限
界）は、約10μg/Lである。この文脈において、感度
は、ゼロ結合値（zero binding value）の標準偏差の
２倍に等しい検出可能な質量と定義する。標準曲線は、
一般に20〜100μg/Lの範囲で直線である。以下の実施例
で説明する検定法の検定内および検定間の変動係数は、
それぞれ＜6.5％と＜12％である。
放射線同位元素以外の標識を用いる検定法は、必ずし
もRIAほどに鋭敏ではないが、特定の利点があるので、
好ましいRIA法の代替法として使用できることが、当該
技術分野の当業者であれば分かるであろう。例えば、酵
素結合イムノソルベント検定法（ELISA法）は、ELISA微
量滴定リーダーと、多数の研究所および臨床研究所で容
易に入手できる試薬を使用して容易に自動化することが
出る。蛍光、化学発光および生物発光の標識は、視覚で
検出できる利点があるが、抗体によって補足される抗原
の量を検定法で定量するには放射性同位元素ほど有用で
はない。
もRIAほどに鋭敏ではないが、特定の利点があるので、
好ましいRIA法の代替法として使用できることが、当該
技術分野の当業者であれば分かるであろう。例えば、酵
素結合イムノソルベント検定法（ELISA法）は、ELISA微
量滴定リーダーと、多数の研究所および臨床研究所で容
易に入手できる試薬を使用して容易に自動化することが
出る。蛍光、化学発光および生物発光の標識は、視覚で
検出できる利点があるが、抗体によって補足される抗原
の量を検定法で定量するには放射性同位元素ほど有用で
はない。
さらに、当該技術分野の当業者にとって分かっている
ことであるが、生体試料中のYKL−40の存在を検出し定
量するのに免疫検定法以外の方法を使用できる。例え
ば、YKL−40をエンコードするポリヌクレオチドは、当
該技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によ
る定量プロトコルを用いて検出することができる。定量
PCR法を実施するのに好ましい方法は、標的YKL−40遺伝
子鋳型とは配列または大きさが異なる競合体になる、変
位を誘発された一つ以上の塩基対を含有する競合体鋳型
を用いて行う競合PCR法である。生成するPCR産物の一本
鎖（通常はアンチセンスストランド）が、適切な反応物
にしっかり結合された固相支持体に、アミノ−カルボキ
シル、アミノ−アミノ、ビチオン−ストレプタビジンな
どを経由して適切にしっかり結合され固定化されるよう
に、プライマーのうちの一つはビオチニル化されるかま
たは好ましくはアミノ化される。PCR産物、固体支持体
および反応物間の結合が共有結合であると、その結合の
変性条件下での切断に対する耐性の信頼性が高くなるの
で最も好ましい。
ことであるが、生体試料中のYKL−40の存在を検出し定
量するのに免疫検定法以外の方法を使用できる。例え
ば、YKL−40をエンコードするポリヌクレオチドは、当
該技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によ
る定量プロトコルを用いて検出することができる。定量
PCR法を実施するのに好ましい方法は、標的YKL−40遺伝
子鋳型とは配列または大きさが異なる競合体になる、変
位を誘発された一つ以上の塩基対を含有する競合体鋳型
を用いて行う競合PCR法である。生成するPCR産物の一本
鎖（通常はアンチセンスストランド）が、適切な反応物
にしっかり結合された固相支持体に、アミノ−カルボキ
シル、アミノ−アミノ、ビチオン−ストレプタビジンな
どを経由して適切にしっかり結合され固定化されるよう
に、プライマーのうちの一つはビオチニル化されるかま
たは好ましくはアミノ化される。PCR産物、固体支持体
および反応物間の結合が共有結合であると、その結合の
変性条件下での切断に対する耐性の信頼性が高くなるの
で最も好ましい。
PCR産物のアミノ化またはビオチニル化されたストラ
ンドが一旦固定化されると、結合されていない相補スト
ランドは、アルカリ性変性洗浄で分離され、反応環境か
ら除去される。標的および競合体の核酸に対応する配列
特異的オリゴヌクレオチド（「SSO」）は、検出標識で
標識をつける。次に、このSSOは、上記の除去された結
合されていないセンスストランドの競合なしでい、上記
アンチセンスストランドとハイブリッドを形成させる。
過当な検定試薬を添加し、使用された検出標識と固相支
持手段に適当なELISA測定手段、好ましくはELISAマイク
ロプレートリーダーによって、ハイブリッド形成度を測
定する。標的と競合体の鋳型を含む鋳型を増幅するPCR
反応から別個に誘導した標準曲線を用い、上記の測定値
を比較して標的核酸の含有量を含めた。この方法は、定
量的であり、PCRのサイクルに左右されず、かつSSOプロ
ーブと、PCR産物の相補ストランドとの競合による影響
を受けない点が有利である。
ンドが一旦固定化されると、結合されていない相補スト
ランドは、アルカリ性変性洗浄で分離され、反応環境か
ら除去される。標的および競合体の核酸に対応する配列
特異的オリゴヌクレオチド（「SSO」）は、検出標識で
標識をつける。次に、このSSOは、上記の除去された結
合されていないセンスストランドの競合なしでい、上記
アンチセンスストランドとハイブリッドを形成させる。
過当な検定試薬を添加し、使用された検出標識と固相支
持手段に適当なELISA測定手段、好ましくはELISAマイク
ロプレートリーダーによって、ハイブリッド形成度を測
定する。標的と競合体の鋳型を含む鋳型を増幅するPCR
反応から別個に誘導した標準曲線を用い、上記の測定値
を比較して標的核酸の含有量を含めた。この方法は、定
量的であり、PCRのサイクルに左右されず、かつSSOプロ
ーブと、PCR産物の相補ストランドとの競合による影響
を受けない点が有利である。
あるいは、重合ステップの一部とハイブリッド形成ス
テップの全てを固相支持体上で実施してもよい。この方
法では、ヌクレオチド重合プライマー（好ましくはオリ
ゴヌクレオチド）がPCR産物のストランドではなくて固
相支持体に捕捉される。標的と競合体核酸PCR産物を溶
解して固相支持体に添加して、次いで重合ステップを実
施する。重合産物の結合されていないセンスストランド
を前記変性条件下で除去する。
テップの全てを固相支持体上で実施してもよい。この方
法では、ヌクレオチド重合プライマー（好ましくはオリ
ゴヌクレオチド）がPCR産物のストランドではなくて固
相支持体に捕捉される。標的と競合体核酸PCR産物を溶
解して固相支持体に添加して、次いで重合ステップを実
施する。重合産物の結合されていないセンスストランド
を前記変性条件下で除去する。
標的対競合核酸の比率は、適当な測定手段（好ましく
はELISAリーダー）と上記標準曲線を用いて、標識をつ
けたオリゴヌクレオチドSSOプローブを検出することに
よって求めることができる。この方法の効率は、非常に
大きいので、重合ステップの連鎖反応が不必要になり、
その結果、この方法を実施するのに要する時間が短くな
る。最終の重合産物は、ハイブリッドを形成するために
反応管から固相支持体に移す必要がないので、損失もし
くは損傷する可能性が制約されるから、この方法の正確
さは高くなる。しかし、特別の試料の場合必要ならば、
PCRを使用して別個の反応管内愛で標的と競合体の核酸
を増幅し、次いで最終の重合反応を固相支持体上で実施
してもよい。
はELISAリーダー）と上記標準曲線を用いて、標識をつ
けたオリゴヌクレオチドSSOプローブを検出することに
よって求めることができる。この方法の効率は、非常に
大きいので、重合ステップの連鎖反応が不必要になり、
その結果、この方法を実施するのに要する時間が短くな
る。最終の重合産物は、ハイブリッドを形成するために
反応管から固相支持体に移す必要がないので、損失もし
くは損傷する可能性が制約されるから、この方法の正確
さは高くなる。しかし、特別の試料の場合必要ならば、
PCRを使用して別個の反応管内愛で標的と競合体の核酸
を増幅し、次いで最終の重合反応を固相支持体上で実施
してもよい。
当該技術分野の当業者にとって公知の、結合したPCR
産物が生々しているのを示す異なる検出可能なシグナル
を提供できる分子（例えば、標的と競合体PCR産物の生
成を示す異なる色を呈する標識ヌクレオチドクロモソー
ム）を、その反応の最後の数サイクル中に反応溶液に添
加してもよい。また、標的対競合体核酸の比率は、ELIS
A法などの適当な測定手段および免疫化ハイブリッド形
成プライマーの３′末端に連結された検出標識に対して
反応性の試薬を用いて求めることができる。また、この
方法は、従来の非競合PCRのプロトコルを実施すること
によって、特別の遺伝子が試料中に存在しているか否か
を（遺伝子を定量することなく）検出するのに適用する
こともできる。
産物が生々しているのを示す異なる検出可能なシグナル
を提供できる分子（例えば、標的と競合体PCR産物の生
成を示す異なる色を呈する標識ヌクレオチドクロモソー
ム）を、その反応の最後の数サイクル中に反応溶液に添
加してもよい。また、標的対競合体核酸の比率は、ELIS
A法などの適当な測定手段および免疫化ハイブリッド形
成プライマーの３′末端に連結された検出標識に対して
反応性の試薬を用いて求めることができる。また、この
方法は、従来の非競合PCRのプロトコルを実施すること
によって、特別の遺伝子が試料中に存在しているか否か
を（遺伝子を定量することなく）検出するのに適用する
こともできる。
当該技術分野の当業者であれば、上記の方法に用いる
のに適したプライマーを選択する方法を知っているかま
たは容易に確認できるであろう。上記方法についてのさ
らに詳細な事項は、以下の文献の開示事項を参照して得
ることができる。すなわち、Kohsaka他の論文、Nuc.Aci
ds Res.、21巻、3469〜3472頁、1993年、Bunn他の米国
特許第5,213,961号、およびInnis他の論文、PCP Proto
cols:A Guide to Methods and Applications、Aca
d.Press社、1990年である。なお、これら文献の開示事
項は、単に、定量PCPプロトコルについての現在の技術
水準を示す目的で本明細書に援用するものである。
のに適したプライマーを選択する方法を知っているかま
たは容易に確認できるであろう。上記方法についてのさ
らに詳細な事項は、以下の文献の開示事項を参照して得
ることができる。すなわち、Kohsaka他の論文、Nuc.Aci
ds Res.、21巻、3469〜3472頁、1993年、Bunn他の米国
特許第5,213,961号、およびInnis他の論文、PCP Proto
cols:A Guide to Methods and Applications、Aca
d.Press社、1990年である。なお、これら文献の開示事
項は、単に、定量PCPプロトコルについての現在の技術
水準を示す目的で本明細書に援用するものである。
E.診断への応用 以下の実施例に示すように、YKL−40の濃度の測定値
に基づいた疾患の診断は、疾患がみられない対照グルー
プで測定した濃度または特別の患者で測定したバックグ
ラウンド濃度と比較することによって行うことができ
る。その診断は、検定結果と、下記の実施例に記載され
ているRAと乳癌の診断基準のような、臨床技術分野の熟
練者に知られている疾患の他の兆候とを関連づけること
によって確認することができる。
に基づいた疾患の診断は、疾患がみられない対照グルー
プで測定した濃度または特別の患者で測定したバックグ
ラウンド濃度と比較することによって行うことができ
る。その診断は、検定結果と、下記の実施例に記載され
ているRAと乳癌の診断基準のような、臨床技術分野の熟
練者に知られている疾患の他の兆候とを関連づけること
によって確認することができる。
疾患（例えば、RA）の改善をYKL−40の濃度の減少
（および付随する軟骨の修復）に関連づけることができ
る場合、患者から採取した生体検定試料（例えば、滑
液）中のYKL−40濃度は、治療を行う前（バックグラウ
ンドを求めるため）および治療中定期的に測定しなけれ
ばならない。YKL−40の濃度の減少が一過性であること
があるから、検定は各治療の直前と各治療の後の時間間
隔をおいて（例えば４週間毎に）行うことが好ましい。
治療の過程、腫瘍の荷重（tumor load）などの臨床上
の変数によって、当該技術分野の熟練医師は、診断また
は疾患治療の監視を目的とする検定の適当な実施計画を
決定することができる。
（および付随する軟骨の修復）に関連づけることができ
る場合、患者から採取した生体検定試料（例えば、滑
液）中のYKL−40濃度は、治療を行う前（バックグラウ
ンドを求めるため）および治療中定期的に測定しなけれ
ばならない。YKL−40の濃度の減少が一過性であること
があるから、検定は各治療の直前と各治療の後の時間間
隔をおいて（例えば４週間毎に）行うことが好ましい。
治療の過程、腫瘍の荷重（tumor load）などの臨床上
の変数によって、当該技術分野の熟練医師は、診断また
は疾患治療の監視を目的とする検定の適当な実施計画を
決定することができる。
場合によっては、血清のYKL−40が問題の組織以外の
起源から生じることがあるので、試料は、できれば問題
の組織化ら採取すべきである。例えば、関節疾患を診断
または監視する場合、検定試料は、冒されているかまた
は冒された可能性がある関節の滑液から抜き取ることが
好ましい。しかし、腫瘍の転移を診断し監視する場合
は、検定試料の好ましい起源は、血液である。当該技術
分野の当業者であれば、YKL−40が指標である特別の疾
患を診断するために用いるのにどの検定試料の起源が最
も適当であるかを容易に決定することができるであろ
う。
起源から生じることがあるので、試料は、できれば問題
の組織化ら採取すべきである。例えば、関節疾患を診断
または監視する場合、検定試料は、冒されているかまた
は冒された可能性がある関節の滑液から抜き取ることが
好ましい。しかし、腫瘍の転移を診断し監視する場合
は、検定試料の好ましい起源は、血液である。当該技術
分野の当業者であれば、YKL−40が指標である特別の疾
患を診断するために用いるのにどの検定試料の起源が最
も適当であるかを容易に決定することができるであろ
う。
特別の疾患の発現または改善を示すYKL−40の濃度
は、疾患によって変化し、また、変化の程度は小さい
が、患者によって変化する。しかし、一般に、実施例に
提供したデータが示しているが、736名の子供と成人の
試料グループ由来の血清中に検出されたYKL−40の濃度
の中央値は、子供（６〜17歳）の場合80μg/lであり、
成人（20〜79歳）の場合は102μg/lであった。子供また
は69歳より若い成人の異なる年齢グループ間で、これら
の数値に統計的に有意な変化は全く認められなかった。
しかし、69歳を超える成人は、YKL−40の血清中濃度が6
9歳より若い成人より高い傾向がみられた。したがっ
て、疾患の発症、悪化または改善を診断するのに利用す
る、問題のYKL−40の濃度の変化は、正常集団（すなわ
ち健康集団）とは統計的に有意な濃度差があり、かつ問
題の疾患にかかわっている臨床技術分野の熟練者にとっ
て公知の疾患の発生および／または改善の他の臨床兆候
に相関関係がある変化である（すなわち診断を行うのに
有意な濃度のYKL−40）。
は、疾患によって変化し、また、変化の程度は小さい
が、患者によって変化する。しかし、一般に、実施例に
提供したデータが示しているが、736名の子供と成人の
試料グループ由来の血清中に検出されたYKL−40の濃度
の中央値は、子供（６〜17歳）の場合80μg/lであり、
成人（20〜79歳）の場合は102μg/lであった。子供また
は69歳より若い成人の異なる年齢グループ間で、これら
の数値に統計的に有意な変化は全く認められなかった。
しかし、69歳を超える成人は、YKL−40の血清中濃度が6
9歳より若い成人より高い傾向がみられた。したがっ
て、疾患の発症、悪化または改善を診断するのに利用す
る、問題のYKL−40の濃度の変化は、正常集団（すなわ
ち健康集団）とは統計的に有意な濃度差があり、かつ問
題の疾患にかかわっている臨床技術分野の熟練者にとっ
て公知の疾患の発生および／または改善の他の臨床兆候
に相関関係がある変化である（すなわち診断を行うのに
有意な濃度のYKL−40）。
例えば、炎症性関節疾患の場合、YKL−40の滑液中濃
度は、関節疾患の他の生化学的指標、特に滑液中のプロ
テオグリカンとコラーゲンの分解に対する単球およびマ
クロファージによるエラストライティック（elastolyti
c）活性に関連づけることができる。また、YKL−40の濃
度は、滑液中の高くなったIL−６の濃度と良好な相関関
係がある。IL−６は、軟骨細胞と滑膜細胞によって分泌
され、炎症を含む免疫応答を調節する働きを有する。炎
症性および退行性の関節症の患者の滑液中に、比較的高
い濃度のIL−８がみられる。
度は、関節疾患の他の生化学的指標、特に滑液中のプロ
テオグリカンとコラーゲンの分解に対する単球およびマ
クロファージによるエラストライティック（elastolyti
c）活性に関連づけることができる。また、YKL−40の濃
度は、滑液中の高くなったIL−６の濃度と良好な相関関
係がある。IL−６は、軟骨細胞と滑膜細胞によって分泌
され、炎症を含む免疫応答を調節する働きを有する。炎
症性および退行性の関節症の患者の滑液中に、比較的高
い濃度のIL−８がみられる。
いくぶん程度は低いが、YKL−40の濃度と急性Ｃ反応
性タンパク質（CRP）の濃度の間にも相関関係がある。C
RPは、リウマチ関節疾患の急性期に多量に存在し、炎症
の場合に生物学的役割を演じているようである。YKL−4
0の濃度は、同様にＰ−III−NPの血清中濃度と相関関係
があり、これは滑液中のIII型コラーゲン代謝の局所的
炎症変質を反映している。この発明は、特別の診断法に
限定するものではないが、YKL−40の濃度の上記相関関
係は、YKL−40の濃度が特に関節疾患の炎症を示すこと
を示唆している。もちろん、この発明の方法にしたがっ
て行われたYKL−40の測定で示されたいずれの診断結果
も、臨床技術分野の当業者に公知の疾患の臨床兆候を参
照して、独立して確認される。
性タンパク質（CRP）の濃度の間にも相関関係がある。C
RPは、リウマチ関節疾患の急性期に多量に存在し、炎症
の場合に生物学的役割を演じているようである。YKL−4
0の濃度は、同様にＰ−III−NPの血清中濃度と相関関係
があり、これは滑液中のIII型コラーゲン代謝の局所的
炎症変質を反映している。この発明は、特別の診断法に
限定するものではないが、YKL−40の濃度の上記相関関
係は、YKL−40の濃度が特に関節疾患の炎症を示すこと
を示唆している。もちろん、この発明の方法にしたがっ
て行われたYKL−40の測定で示されたいずれの診断結果
も、臨床技術分野の当業者に公知の疾患の臨床兆候を参
照して、独立して確認される。
その他の例として、乳癌患者の場合、YKL−40の血清
中濃度は、乳癌がない患者に比べて癌細胞の転移がみら
れる患者の方が高い。おそらく、血清中のYKL−40の濃
度が高くなるのは、少なくとも一部は、血液中への癌細
胞の流入に対する結合障壁の退行が原因であろう。類似
のプロセスに付随して癌細胞がリ循環系に流入すると考
えられる。以下に示すデータによって実証されているよ
うに、YKL−40の血清中濃度の上昇が検出されたこと
は、局在部位、皮膚または孤立したリンパ腺に対してで
はなく内臓と骨への転移を示しているようである。しか
し、前者の転移は、従来の健康診断でかなり容易に検出
することができる。
中濃度は、乳癌がない患者に比べて癌細胞の転移がみら
れる患者の方が高い。おそらく、血清中のYKL−40の濃
度が高くなるのは、少なくとも一部は、血液中への癌細
胞の流入に対する結合障壁の退行が原因であろう。類似
のプロセスに付随して癌細胞がリ循環系に流入すると考
えられる。以下に示すデータによって実証されているよ
うに、YKL−40の血清中濃度の上昇が検出されたこと
は、局在部位、皮膚または孤立したリンパ腺に対してで
はなく内臓と骨への転移を示しているようである。しか
し、前者の転移は、従来の健康診断でかなり容易に検出
することができる。
さらに、YKL−40の濃度の大きな上昇は、乳癌が転移
によって再発した患者（特に骨および／または内臓への
転移）の血清に出現する。年齢を釣り合わせた対照群の
YKL−40血清濃度の中央値（約102μg/l）に比べて、骨
への転移が確認された患者（骨は乳癌細胞が転移するも
っとも普通の部位である）のYKL−40血清中濃度の中央
値は約3288μg/lであった。さらに、内臓への転移が確
認された患者のYKL−40血清中濃度の中央値は、約157μ
g/lであった。
によって再発した患者（特に骨および／または内臓への
転移）の血清に出現する。年齢を釣り合わせた対照群の
YKL−40血清濃度の中央値（約102μg/l）に比べて、骨
への転移が確認された患者（骨は乳癌細胞が転移するも
っとも普通の部位である）のYKL−40血清中濃度の中央
値は約3288μg/lであった。さらに、内臓への転移が確
認された患者のYKL−40血清中濃度の中央値は、約157μ
g/lであった。
これとは対照的に、骨への転移に対して現在普通に使
われている指標（血清の含アルカリ性ホスファターゼ、
骨アルカリ性ホスファターゼおよび骨Glaタンパク質）
は、転移性乳癌の患者の場合、著しい変動を示し、特に
血清中の骨Glaタンパク質の増大は、乳癌の転移に対す
る診断には役立たないことが分かっている。
われている指標（血清の含アルカリ性ホスファターゼ、
骨アルカリ性ホスファターゼおよび骨Glaタンパク質）
は、転移性乳癌の患者の場合、著しい変動を示し、特に
血清中の骨Glaタンパク質の増大は、乳癌の転移に対す
る診断には役立たないことが分かっている。
興味深いことには、YKL−40血清中濃度の上昇は、各
患者が癌の再発に続いて生存が期待できる月数と相関関
係があり、特にYKL−40血清中濃度が約164μg/l以上の
患者、さらに、わけてもYKL−40血清中濃度が約207μg/
l（すなわち、「予後を行うのに有意な濃度」のYKL−4
0）以上の患者にこの相関関係がある。一般に、YKL−40
の濃度が高ければ高いほど、生存期間は短い。
患者が癌の再発に続いて生存が期待できる月数と相関関
係があり、特にYKL−40血清中濃度が約164μg/l以上の
患者、さらに、わけてもYKL−40血清中濃度が約207μg/
l（すなわち、「予後を行うのに有意な濃度」のYKL−4
0）以上の患者にこの相関関係がある。一般に、YKL−40
の濃度が高ければ高いほど、生存期間は短い。
F.医薬選別の用途 上記のように、YKL−40は、その産生が結合組織の退
行に関連する疾患状態の過程が増大するが水分解酵素の
ようである。特に、YKL−40は、結合組織が修復される
より速く消化されるときその損失を起こす結合組織の消
化に関与しているようである。したがって、YKL−40の
産生および／または活性を阻害する薬剤は、論理的に結
合組織の損失を制限すると期待できる。
行に関連する疾患状態の過程が増大するが水分解酵素の
ようである。特に、YKL−40は、結合組織が修復される
より速く消化されるときその損失を起こす結合組織の消
化に関与しているようである。したがって、YKL−40の
産生および／または活性を阻害する薬剤は、論理的に結
合組織の損失を制限すると期待できる。
上記の目的を達成するため、この発明のYKL−40タン
パク質、ペプチドおよび抗体は、YKL−40の潜在的なイ
ンヒビターを選別するのに有用である。YKL−40活性の
潜在的なインヒビターとしては、YKL−40に競合して結
合する基質分子およびYKL−40に対して特異的な抗体が
ある。例えば、潜在的なYKL−40基質分子は、この発明
の実質的に純粋なYKL−40をYKL−40抗体に対して競合免
疫検定法に用いて選別し、同定できる。しかし、当該技
術ぶんやの当業者であれば、YKL−40に結合する基質分
子は、結合の動力学、アフィニティーなどの他のパラメ
ータを測定することによって特性を決定することができ
るこは分かっているであろう。
パク質、ペプチドおよび抗体は、YKL−40の潜在的なイ
ンヒビターを選別するのに有用である。YKL−40活性の
潜在的なインヒビターとしては、YKL−40に競合して結
合する基質分子およびYKL−40に対して特異的な抗体が
ある。例えば、潜在的なYKL−40基質分子は、この発明
の実質的に純粋なYKL−40をYKL−40抗体に対して競合免
疫検定法に用いて選別し、同定できる。しかし、当該技
術ぶんやの当業者であれば、YKL−40に結合する基質分
子は、結合の動力学、アフィニティーなどの他のパラメ
ータを測定することによって特性を決定することができ
るこは分かっているであろう。
ある分子がYKL−40を捕捉することが測定されたなら
ば、他の潜在的基質分子は、mAb類を、YKL−40に対する
特異性で選別することについて先に述べたようにして、
阻害および／または競合結合を試験とすることによって
結合性について選別することができる。
ば、他の潜在的基質分子は、mAb類を、YKL−40に対する
特異性で選別することについて先に述べたようにして、
阻害および／または競合結合を試験とすることによって
結合性について選別することができる。
G.治療への応用 YKL−40酵素活性の上記予測が正確であるとすれば、Y
KL−40基質分子および抗YKL−40抗体で阻害しおよび／
またはYKL−40を、医薬として許容される基質分子に対
して競合結合させることによって弱める（つまり、YKL
−40に対する宿主の応答例えば結合組織の消化を減少さ
せる）ことができると期待される。
KL−40基質分子および抗YKL−40抗体で阻害しおよび／
またはYKL−40を、医薬として許容される基質分子に対
して競合結合させることによって弱める（つまり、YKL
−40に対する宿主の応答例えば結合組織の消化を減少さ
せる）ことができると期待される。
上記目的を達成するため、所望の程度の純度を有する
YKL−40基質分子またはYKL−40に対するアフィニティを
所望の程度に持っている抗YKL−40抗体を、薬理学的に
許容される担体と混合することによって、YKL−40基質
分子または抗YKL−40の組成物を投与用に調製する。上
記の担体は、利用される投与量および濃度では、受容者
に対して非毒性である。このような組成物の製造は、通
常、上記特定のタンパク質と以下のもの、すなわち緩衝
剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量のポリ
ペプチド（約10個未満の残基）、タンパク質、アミノ
酸、グルコースもしくはデキストリンを含む炭水化物、
EDTAなどのキレート薬、グルタチオンなどの安定剤、お
よび賦形剤を混合して行う。このような組成物は、凍結
乾燥してもよく、医薬として許容される。すなわち、所
望の用途に用いるため適切に調製され、認可される。
YKL−40基質分子またはYKL−40に対するアフィニティを
所望の程度に持っている抗YKL−40抗体を、薬理学的に
許容される担体と混合することによって、YKL−40基質
分子または抗YKL−40の組成物を投与用に調製する。上
記の担体は、利用される投与量および濃度では、受容者
に対して非毒性である。このような組成物の製造は、通
常、上記特定のタンパク質と以下のもの、すなわち緩衝
剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量のポリ
ペプチド（約10個未満の残基）、タンパク質、アミノ
酸、グルコースもしくはデキストリンを含む炭水化物、
EDTAなどのキレート薬、グルタチオンなどの安定剤、お
よび賦形剤を混合して行う。このような組成物は、凍結
乾燥してもよく、医薬として許容される。すなわち、所
望の用途に用いるため適切に調製され、認可される。
関節疾患および退行性の臓器疾患（例えば、肝硬変）
を治療する場合、YKL−40の活性は、全身ではなくて関
節または臓器を標的とする方が好ましい。問題の関節ま
たは臓器に対する投与経路（例えば、注射、カテーテル
挿入法など）は、臨床技術分野合の熟練者にとって公知
である。あるいは、患者の発現している症状と達成すべ
き治療目的によって熟練臨床医師が変更した投与量で腸
または非経口の経路で投与してもよい。
を治療する場合、YKL−40の活性は、全身ではなくて関
節または臓器を標的とする方が好ましい。問題の関節ま
たは臓器に対する投与経路（例えば、注射、カテーテル
挿入法など）は、臨床技術分野合の熟練者にとって公知
である。あるいは、患者の発現している症状と達成すべ
き治療目的によって熟練臨床医師が変更した投与量で腸
または非経口の経路で投与してもよい。
YKL−40の活性および／または産生のレベルは、治療
すべき疾患状態に関連する結合組織の損失の臨床発現の
低下を参照しながら上記の検定法で監視することができ
る。上記の結果を達成する投与量が、「治療上有効な」
投与量とみなされる。しかし、一般に、YKL−40基質分
子の投与量は、約10単位/m2〜20,000単位/m2の範囲で変
化させ、好ましくは、約5000〜6000単位/m2の範囲であ
り、１週間ごとに１回以上、１日ないしは数日間に亘っ
て投与される。
すべき疾患状態に関連する結合組織の損失の臨床発現の
低下を参照しながら上記の検定法で監視することができ
る。上記の結果を達成する投与量が、「治療上有効な」
投与量とみなされる。しかし、一般に、YKL−40基質分
子の投与量は、約10単位/m2〜20,000単位/m2の範囲で変
化させ、好ましくは、約5000〜6000単位/m2の範囲であ
り、１週間ごとに１回以上、１日ないしは数日間に亘っ
て投与される。
H.治療および診断の用途に用いるキット この発明は、先に述べた診断試験と治療の用途に用い
るキットを提供するものである。診断と試験の用途の場
合、このキットには下記のものの全てまたは一部が入っ
ている。すなわち、検定試薬、緩衝剤、YKL−40のタン
パク質および／またはフラグメント、YKL−40組み替え
発現ベクター、YKL−40のオリゴヌクレオチドと他のハ
イブリッド形成プローブおよび／またはプライマー、YK
L−40基質分子、および／または適切な検定装置であ
る。治療用製品には、凍結乾燥されたYKL−40基質分子
または抗YKL−40の懸濁液を再構成するのに用いる滅菌
食塩水または他の医薬として許容される乳液および懸濁
液のベース、YKL−40基質分子または抗YKL−40の組成物
用の適切にラベルを付けて認可された容器、並びに上記
の診断キットの要素とともに用いるこれら治療用製品を
入れるキットが含まれる。
るキットを提供するものである。診断と試験の用途の場
合、このキットには下記のものの全てまたは一部が入っ
ている。すなわち、検定試薬、緩衝剤、YKL−40のタン
パク質および／またはフラグメント、YKL−40組み替え
発現ベクター、YKL−40のオリゴヌクレオチドと他のハ
イブリッド形成プローブおよび／またはプライマー、YK
L−40基質分子、および／または適切な検定装置であ
る。治療用製品には、凍結乾燥されたYKL−40基質分子
または抗YKL−40の懸濁液を再構成するのに用いる滅菌
食塩水または他の医薬として許容される乳液および懸濁
液のベース、YKL−40基質分子または抗YKL−40の組成物
用の適切にラベルを付けて認可された容器、並びに上記
の診断キットの要素とともに用いるこれら治療用製品を
入れるキットが含まれる。
YKL−40の濃度と、関節疾患活性、関節疾患の治療経
過、臓器の分解、癌細胞の転移および癌細胞生存率との
相関関係を示す実施例を以下に述べる。しかし、これら
の実施例は、この発明を限定するとみなすべきではな
く、この発明の範囲は、後記の特許請求の範囲によって
定義される。
過、臓器の分解、癌細胞の転移および癌細胞生存率との
相関関係を示す実施例を以下に述べる。しかし、これら
の実施例は、この発明を限定するとみなすべきではな
く、この発明の範囲は、後記の特許請求の範囲によって
定義される。
実施例Ｉ ヒト骨肉腫細胞系MG63からYKL−40の単離と精製 ヒト骨肉腫細胞系MG63の無血清のならし培地からYKL
−40の精製した（MG63細胞は、米国、メリーランド州、
ロックビル所在のAmerican Type Culture Colleotionか
ら入手した）。10％の新生仔ウシ血清、100単位/mlのペ
ニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、50μg/ml
のビタミンＣおよび１μg/mlのビタミンK1を含有するRP
MI1640培地が入っている100mmのシャーレ内で細胞を培
養した。その培養物は、10％CO2含有の加湿大気中で37
℃でインキュベートした。細胞が密集状態になったと
き、培地を取り出し、次に細胞層を10ミリリットル（m
l）のリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した。
−40の精製した（MG63細胞は、米国、メリーランド州、
ロックビル所在のAmerican Type Culture Colleotionか
ら入手した）。10％の新生仔ウシ血清、100単位/mlのペ
ニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、50μg/ml
のビタミンＣおよび１μg/mlのビタミンK1を含有するRP
MI1640培地が入っている100mmのシャーレ内で細胞を培
養した。その培養物は、10％CO2含有の加湿大気中で37
℃でインキュベートした。細胞が密集状態になったと
き、培地を取り出し、次に細胞層を10ミリリットル（m
l）のリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した。
50μg/mlのビタミンＣと１μg/mlのビタミンK1を含有
する無血清RPMI1640培地10mlの各シャーレに添加した。
48時間後、ならし培地を各シャーレからデカントし、次
いで同じ濃度の添加成分を含有する新しい無血清培地10
mlで置換した。この手順を10日間48時間ごとに繰り返し
た。ならし培地を遠心分離に対して細胞と残渣を除い
て、使用するまで−20℃で貯蔵した。
する無血清RPMI1640培地10mlの各シャーレに添加した。
48時間後、ならし培地を各シャーレからデカントし、次
いで同じ濃度の添加成分を含有する新しい無血清培地10
mlで置換した。この手順を10日間48時間ごとに繰り返し
た。ならし培地を遠心分離に対して細胞と残渣を除い
て、使用するまで−20℃で貯蔵した。
Nyrkos他の論文、Biochem.J.第269巻、265〜268頁、1
990年に記載されているヘパリン・アフィニティ・クロ
マトグラフィ法の改変法を用いてYKL−40を精製した。
具体的に伸べると、まず第一にYKL−40を、室温で２時
間撹拌することによって、HEPARIN−SEPHAROSE CL−6B
樹脂（Pharmacia社から入手）40ml（充填容積）に吸着
させて、ならし培地4.75Lから濃縮した。次に、この樹
脂を２×24cmのカラムに入れ、次いで0.05MのNaClの直
線勾配液（各条件で200mlずつ）を用いてYKL−40を室温
で上記樹脂から溶離した。
990年に記載されているヘパリン・アフィニティ・クロ
マトグラフィ法の改変法を用いてYKL−40を精製した。
具体的に伸べると、まず第一にYKL−40を、室温で２時
間撹拌することによって、HEPARIN−SEPHAROSE CL−6B
樹脂（Pharmacia社から入手）40ml（充填容積）に吸着
させて、ならし培地4.75Lから濃縮した。次に、この樹
脂を２×24cmのカラムに入れ、次いで0.05MのNaClの直
線勾配液（各条件で200mlずつ）を用いてYKL−40を室温
で上記樹脂から溶離した。
YKL−40の純度を確認するため、先に述べたHEPARIN−
SEPHAROSE CL−6Bアフィニティ・クロマトグラフィ法
から得たピーク画分の第三画分ごとに得た５μｌずつ
を、25μｌのSDS負荷緩衝液と混合し、５〜20％SDSポリ
アクリルアミド勾配ゲル（米国、カリフォルニア州、リ
ッチモンド所在のBioRad,Laboratories社）の電気泳動
に付し、次にクーマシーブリリアントブルーで染色し
た。この発明の検定法で標準およびトレーサとして使用
する最終のYKL−40の濃度は、YKL−40の溶液1ml当たり
１ミリグラム（mg）に対して吸光度が1.44であることに
基づいている。
SEPHAROSE CL−6Bアフィニティ・クロマトグラフィ法
から得たピーク画分の第三画分ごとに得た５μｌずつ
を、25μｌのSDS負荷緩衝液と混合し、５〜20％SDSポリ
アクリルアミド勾配ゲル（米国、カリフォルニア州、リ
ッチモンド所在のBioRad,Laboratories社）の電気泳動
に付し、次にクーマシーブリリアントブルーで染色し
た。この発明の検定法で標準およびトレーサとして使用
する最終のYKL−40の濃度は、YKL−40の溶液1ml当たり
１ミリグラム（mg）に対して吸光度が1.44であることに
基づいている。
関節軟骨は、死亡後18時間以内の死体および骨関節症
に対して関節置換を受けている患者の膝から入手し、当
該技術分野で公知の方法に従い逐次酵素消化方で軟骨細
胞を単離した。（例えば、Guerne他の論文、J.Immun.第
144巻、499〜505頁、1990年を参照）。得られた細胞
は、軟骨細胞の均一な集団であった。というのは、細胞
の単離には軟骨の表層のみを用い、そして繊維芽細胞ま
たは滑膜細胞と異なり、その細胞は癒着性でなかったか
らである。
に対して関節置換を受けている患者の膝から入手し、当
該技術分野で公知の方法に従い逐次酵素消化方で軟骨細
胞を単離した。（例えば、Guerne他の論文、J.Immun.第
144巻、499〜505頁、1990年を参照）。得られた細胞
は、軟骨細胞の均一な集団であった。というのは、細胞
の単離には軟骨の表層のみを用い、そして繊維芽細胞ま
たは滑膜細胞と異なり、その細胞は癒着性でなかったか
らである。
その細胞は、10％のウシ胎仔血清、100単位/mlのペニ
シリン、10μg/mlのストレプトマイシンおよび50μg/ml
のビタミンＣを補充したDMEM高グルコース培地（米国、
カリフォルニア州、アービン所在のIrvin Scientific
社）中で培養した。細胞は、37℃で10％CO2含有の加湿
大気中、175cm2組織培養フラスコ（初代培養）または10
0mmのシャーレ（後記継代）で培養させた。集密単層を
トリプシン処理した後、細胞を1:3の比率で継代培養を
行った。分析に用いるならし培地を得るため、細胞が集
密状態に到達した後、培地を取り出し、細胞の層を30ml
（175cm2フラスコ）または10ml（100mmのシャーレ）の
リン酸緩衝食塩水（PBS）で２回洗浄した。次に、抗体
および50μg/mlのビタミンＣを含有する同容積の無血清
DMEM高グルコース培地を48時間後に取り出し、同容積の
新しい無血清培地で代替した。この手順を14日間48時間
ごとに繰り返した。ならし培地は、1600×ｇで５分間、
遠心分離に付して細胞と残渣を除いて、使用するまで−
20℃で凍結した。
シリン、10μg/mlのストレプトマイシンおよび50μg/ml
のビタミンＣを補充したDMEM高グルコース培地（米国、
カリフォルニア州、アービン所在のIrvin Scientific
社）中で培養した。細胞は、37℃で10％CO2含有の加湿
大気中、175cm2組織培養フラスコ（初代培養）または10
0mmのシャーレ（後記継代）で培養させた。集密単層を
トリプシン処理した後、細胞を1:3の比率で継代培養を
行った。分析に用いるならし培地を得るため、細胞が集
密状態に到達した後、培地を取り出し、細胞の層を30ml
（175cm2フラスコ）または10ml（100mmのシャーレ）の
リン酸緩衝食塩水（PBS）で２回洗浄した。次に、抗体
および50μg/mlのビタミンＣを含有する同容積の無血清
DMEM高グルコース培地を48時間後に取り出し、同容積の
新しい無血清培地で代替した。この手順を14日間48時間
ごとに繰り返した。ならし培地は、1600×ｇで５分間、
遠心分離に付して細胞と残渣を除いて、使用するまで−
20℃で凍結した。
実施例II 放射線免疫検定法に用いる検定試料の調製 1.検定試料の起源 検定試料は、炎症例または退行性の関節疾患の49名の
患者（34名の女性と15名の男性、年齢23〜80歳、年齢の
中央値65歳）の血清から得た。29名の患者はRAに、７名
は骨関節症に、４名は結晶因性関節炎に、２名は乾癬性
関節炎に、５名は反応性関節炎に、そして２名は単関節
炎（monoarthritis）にそれぞれ冒されていた。診断
は、Arnett他の論文（1988年）、Arthritis Rheum.第31
巻、315〜324頁に記載されている判定基準（American R
heumatism Association Standard）と、膝の臨床および
Ｘ線写真による検査と、そして滑液の顕微鏡による直接
検鏡とに基づいて行った。これらの患者は、血清中のCR
P濃度が25〜1600（中央値165）であった。34名の患者は
非ステロイド系の抗炎症薬を服用中であり、そして17名
は緩徐作用性抗リウマチ薬を服用中であった。15名の患
者は、過去３か月間以内に全身的または局所的に糖質コ
ルチコイドによる治療を受けていた。膝の炎症は、触知
可能な滑膜の腫脹（範囲０〜３）および触診時の痛み
（０〜３）からなる０〜６の範囲の臨床指数の格付けに
よって評価した。
患者（34名の女性と15名の男性、年齢23〜80歳、年齢の
中央値65歳）の血清から得た。29名の患者はRAに、７名
は骨関節症に、４名は結晶因性関節炎に、２名は乾癬性
関節炎に、５名は反応性関節炎に、そして２名は単関節
炎（monoarthritis）にそれぞれ冒されていた。診断
は、Arnett他の論文（1988年）、Arthritis Rheum.第31
巻、315〜324頁に記載されている判定基準（American R
heumatism Association Standard）と、膝の臨床および
Ｘ線写真による検査と、そして滑液の顕微鏡による直接
検鏡とに基づいて行った。これらの患者は、血清中のCR
P濃度が25〜1600（中央値165）であった。34名の患者は
非ステロイド系の抗炎症薬を服用中であり、そして17名
は緩徐作用性抗リウマチ薬を服用中であった。15名の患
者は、過去３か月間以内に全身的または局所的に糖質コ
ルチコイドによる治療を受けていた。膝の炎症は、触知
可能な滑膜の腫脹（範囲０〜３）および触診時の痛み
（０〜３）からなる０〜６の範囲の臨床指数の格付けに
よって評価した。
2.血清および滑液の収集 血液の試料は、室温下で凝固させ、次に1500×ｇで10
分間遠心分離に付した。局所麻酔なしで通常の無菌法を
利用して膝関節の吸引を実施した。滑液を、1.2mmゲー
ジの針を使用して、各被検者からできるだけ完全に取り
出し、エチレンジアミンテトラアセテート（EDTA、最終
濃度5mM）が入っている滅菌チューブに集めた。滑液試
料は、外来残渣を除くため、1800×ｇで30分間遠心分離
に付した。試料は、直ちに分析するかまたは−80℃で貯
蔵してその後分析した。
分間遠心分離に付した。局所麻酔なしで通常の無菌法を
利用して膝関節の吸引を実施した。滑液を、1.2mmゲー
ジの針を使用して、各被検者からできるだけ完全に取り
出し、エチレンジアミンテトラアセテート（EDTA、最終
濃度5mM）が入っている滅菌チューブに集めた。滑液試
料は、外来残渣を除くため、1800×ｇで30分間遠心分離
に付した。試料は、直ちに分析するかまたは−80℃で貯
蔵してその後分析した。
実施例III YKL−40の放射線免疫検定に用いる標識を付けた抗原と
抗体の製造 1.放射線ヨウ素で処理したYKL−40の製造 先に引用したヨードジェン（iodogen）法に従って、
精製YKL−40に125I（ナトリウム塩、英国、Amersham
社）で標識を付けた。具体的に述べると、10μｇのYKL
−40を、110μｌの反応容積で、酸化剤として２μｇの
ヨードジェン（英国、イングランド、チェスター所在の
Pierce and Warriner社）を用いて18.5MBqの125Iととも
に10分間インキュベートした。ヨウ素化は、反応混合物
をヨードジェンチューブから移動させることによって停
止させた。標識を付けたYKL−40を、検定緩衝液（16mM
のリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4、0.12MのNaCl、0.1％
（w/v）のヒト血清アルブミン）と平衡化させたSEPHADE
X G−25カラム（１×12.5cm、Pharmacia社から入手）を
用いて、遊離のヨウ素から分離した。標準YKL−40の算
出比活性は、約15Ci/gであった。YKL−40（精製）およ
びRAの患者の血清から採取したYKL−40の溶離位置の図
１に示す。
抗体の製造 1.放射線ヨウ素で処理したYKL−40の製造 先に引用したヨードジェン（iodogen）法に従って、
精製YKL−40に125I（ナトリウム塩、英国、Amersham
社）で標識を付けた。具体的に述べると、10μｇのYKL
−40を、110μｌの反応容積で、酸化剤として２μｇの
ヨードジェン（英国、イングランド、チェスター所在の
Pierce and Warriner社）を用いて18.5MBqの125Iととも
に10分間インキュベートした。ヨウ素化は、反応混合物
をヨードジェンチューブから移動させることによって停
止させた。標識を付けたYKL−40を、検定緩衝液（16mM
のリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4、0.12MのNaCl、0.1％
（w/v）のヒト血清アルブミン）と平衡化させたSEPHADE
X G−25カラム（１×12.5cm、Pharmacia社から入手）を
用いて、遊離のヨウ素から分離した。標準YKL−40の算
出比活性は、約15Ci/gであった。YKL−40（精製）およ
びRAの患者の血清から採取したYKL−40の溶離位置の図
１に示す。
2.抗体の製造 ニュージーランド白ウサギを、精製YKL−40を多くの
部位に皮下または筋肉内に毎月注射することによって免
疫化した。各注射は、不完全フロイントアジュバント中
に乳化したヒトYKL−40の0.5g（1:1）で行った。最初の
４回の注射は、２週間の間をおいて行い、４番目の注射
を行ってから10〜12日目にウサギから採血した。その
後、注射は、４週間間隔で行い、各注射を終わってから
10〜12日目に採血した。交差免疫電気泳動法によって、
その抗体がYKL−40に対して単一特異性であることが分
かった。
部位に皮下または筋肉内に毎月注射することによって免
疫化した。各注射は、不完全フロイントアジュバント中
に乳化したヒトYKL−40の0.5g（1:1）で行った。最初の
４回の注射は、２週間の間をおいて行い、４番目の注射
を行ってから10〜12日目にウサギから採血した。その
後、注射は、４週間間隔で行い、各注射を終わってから
10〜12日目に採血した。交差免疫電気泳動法によって、
その抗体がYKL−40に対して単一特異性であることが分
かった。
放射性同位元素の標識が、所定の検定法で等価の機能
を有する抗原ではなく上記の抗体に結合することを、当
該技術分野の当業者は理解できるであろう。
を有する抗原ではなく上記の抗体に結合することを、当
該技術分野の当業者は理解できるであろう。
実施例IV リウマチ様関節炎などの関節疾患の患者の血清および滑
液中のYKL−40の濃度を検定するYKL−40の放射線免疫検
定法 実施例IIで述べた検定試料を以下のようにして検定し
た。YKL−40の抗体、標準およびトレーサーは、検定緩
衝液で希釈した。この検定法では、100μｌの標準また
は試料を、最終容積400μｌで、100μｌのYKL−40抗血
清（1:10,000）および100μｌのYKL−40トレーサー（約
15,000カウント毎分）とともに、室温下で20〜24時間イ
ンキュベートした。抗体が結合したトレーサーを100μ
ｌのSAC−CEL（ロバ抗ウサギ抗体をコートしたセルロー
スの懸濁液、英国、Wellcome Diagnostics Ltd.社）と
ともに室温下で30分間インキュベートすることによって
分離した。1mlの蒸留水を添加した後、そのチューブを2
000×ｇで10分間遠心分離し、上澄み液をデカントし、
次に沈澱の放射能を自動ガンマカウンタで計数して10,0
00カウントの時間を求めた。
液中のYKL−40の濃度を検定するYKL−40の放射線免疫検
定法 実施例IIで述べた検定試料を以下のようにして検定し
た。YKL−40の抗体、標準およびトレーサーは、検定緩
衝液で希釈した。この検定法では、100μｌの標準また
は試料を、最終容積400μｌで、100μｌのYKL−40抗血
清（1:10,000）および100μｌのYKL−40トレーサー（約
15,000カウント毎分）とともに、室温下で20〜24時間イ
ンキュベートした。抗体が結合したトレーサーを100μ
ｌのSAC−CEL（ロバ抗ウサギ抗体をコートしたセルロー
スの懸濁液、英国、Wellcome Diagnostics Ltd.社）と
ともに室温下で30分間インキュベートすることによって
分離した。1mlの蒸留水を添加した後、そのチューブを2
000×ｇで10分間遠心分離し、上澄み液をデカントし、
次に沈澱の放射能を自動ガンマカウンタで計数して10,0
00カウントの時間を求めた。
精密さ（検定内の変動）は、単一の検定法で３個の品
質管理血清の各々について繰り返し測定（20回）を行っ
て算出した。再現性（検定間の変動）は、３個の品質管
理血清の各々について５か月間に亘って得たデータ（20
回の検定）から算出した。対応する血清とEDTA血漿の試
料中のYKL−40の濃度を75名の血液提供者で比較した。
質管理血清の各々について繰り返し測定（20回）を行っ
て算出した。再現性（検定間の変動）は、３個の品質管
理血清の各々について５か月間に亘って得たデータ（20
回の検定）から算出した。対応する血清とEDTA血漿の試
料中のYKL−40の濃度を75名の血液提供者で比較した。
標準と試料は、２回ずつ測定した。標準曲線は、スプ
ライン関数を用いて作成した。
ライン関数を用いて作成した。
二つの患者群と対照の個々の血清中YKL−40濃度を図
２に示す。炎症性リウマチ疾患の患者のYKL−40血清中
濃度（中央値138μg/L、下側四分位点〜上側四分位点10
3〜211μg/l）は、骨関節症の患者のYKL−40血清中濃度
（中央値112μg/L、下側四分位点〜上側四分位点93〜15
2μg/L）と統計的に差はなかった（ｐ＝0.44）。両方の
患者群の血清中YKL−40は、対照のヒトのそれ（中央値5
0μg/L、下側四分位点〜上側四分位点36〜64μg/l）よ
り優位に高かった（ｐ＝0.001）。炎症性リウマチ疾患
の患者の膝関節滑液中のYKL−40の濃度（中央値2210μg
/l、下側四分位点〜上側四分位点1625〜3040μg/l）
は、骨関節症の患者の濃度（中央値1720μg/l、下側四
分位点〜上側四分位点1270〜1950μg/l）と有意差はな
かった。
２に示す。炎症性リウマチ疾患の患者のYKL−40血清中
濃度（中央値138μg/L、下側四分位点〜上側四分位点10
3〜211μg/l）は、骨関節症の患者のYKL−40血清中濃度
（中央値112μg/L、下側四分位点〜上側四分位点93〜15
2μg/L）と統計的に差はなかった（ｐ＝0.44）。両方の
患者群の血清中YKL−40は、対照のヒトのそれ（中央値5
0μg/L、下側四分位点〜上側四分位点36〜64μg/l）よ
り優位に高かった（ｐ＝0.001）。炎症性リウマチ疾患
の患者の膝関節滑液中のYKL−40の濃度（中央値2210μg
/l、下側四分位点〜上側四分位点1625〜3040μg/l）
は、骨関節症の患者の濃度（中央値1720μg/l、下側四
分位点〜上側四分位点1270〜1950μg/l）と有意差はな
かった。
したがって、YKL−40の血清中濃度は、関節疾患、特
に炎症性関節疾患の発生に関連があるようである。しか
し、評価された異なる関節疾患の差異は、これらのデー
タからは明らかでない。
に炎症性関節疾患の発生に関連があるようである。しか
し、評価された異なる関節疾患の差異は、これらのデー
タからは明らかでない。
実施例Ｖ 血清検定試料中のYKL−40の安定性 検定試料中のYKL−40抗原に対する凍結・融解の作用
を評価するため、新しい血清試料を６名の成人から入手
し、各試料について10個ずつアリコート（分取）を調製
した。一つのアリコートを氷上に保持し、残りを−20℃
で凍結した。60分間の間隔をおいてアリコートを取り出
し、室温で融解させた。一つの試料は氷上に保持し、残
りは再び凍結した。この手順を９回繰り返したが、血清
中YKL−40の反応性の損失はなかった。室温での長時間
の保存の作用を評価するため、新しい血清試料を12名の
成人から入手し、各試料について４個ずつアリコートを
調製した。一つのアリコートを−20℃で直ちに凍結し、
残りは室温下で24時間および120時間貯蔵した。これら
の期間中、反応性は安定であった。
を評価するため、新しい血清試料を６名の成人から入手
し、各試料について10個ずつアリコート（分取）を調製
した。一つのアリコートを氷上に保持し、残りを−20℃
で凍結した。60分間の間隔をおいてアリコートを取り出
し、室温で融解させた。一つの試料は氷上に保持し、残
りは再び凍結した。この手順を９回繰り返したが、血清
中YKL−40の反応性の損失はなかった。室温での長時間
の保存の作用を評価するため、新しい血清試料を12名の
成人から入手し、各試料について４個ずつアリコートを
調製した。一つのアリコートを−20℃で直ちに凍結し、
残りは室温下で24時間および120時間貯蔵した。これら
の期間中、反応性は安定であった。
実施例VI 血清および滑液中のYKL−40と、炎症の他の生化学的指
標との相関関係、並びに軟骨の再成形 図３に示すように、実施例IIに記載した血清と滑液の
試料について測定したYKL−40の濃度は相関関係が高
く、かつ滑液／血清のYKL−40の比率が高かった。YKL−
40の血清中濃度および滑液中濃度は、CRPの血清中濃
度、IL−６の滑液中濃度および滑液Ｍφの弾性組織分解
のレベルと有為な相関関係があった。これらは、下記の
ようにしてこれらの試料を検定して、測定した。血清YK
L−40はこれら試料の血清Ｍφの弾性組織分解のレベル
とＰ−III−NPの血清中濃度とも相関関係があった。こ
れらの試料について測定した滑液中YKL−40濃度は、膝
の炎症の臨床指数と相関関係があった。血清中または滑
液中のYKL−40の濃度と、血清中IL−６濃度および滑液
中Ｐ−III−NP濃度との間に、相関関係はなかった。
標との相関関係、並びに軟骨の再成形 図３に示すように、実施例IIに記載した血清と滑液の
試料について測定したYKL−40の濃度は相関関係が高
く、かつ滑液／血清のYKL−40の比率が高かった。YKL−
40の血清中濃度および滑液中濃度は、CRPの血清中濃
度、IL−６の滑液中濃度および滑液Ｍφの弾性組織分解
のレベルと有為な相関関係があった。これらは、下記の
ようにしてこれらの試料を検定して、測定した。血清YK
L−40はこれら試料の血清Ｍφの弾性組織分解のレベル
とＰ−III−NPの血清中濃度とも相関関係があった。こ
れらの試料について測定した滑液中YKL−40濃度は、膝
の炎症の臨床指数と相関関係があった。血清中または滑
液中のYKL−40の濃度と、血清中IL−６濃度および滑液
中Ｐ−III−NP濃度との間に、相関関係はなかった。
CRPの血清中濃度は、比濁分析法（ドイツ、マルブル
ク所在、Behringwerke社）で測定した。インターロイキ
ン６（IL−６）の活性は、当該技術分野で公知の高度に
特異的なIL−６依存性マウスハイブリドーマ細胞系B13,
29クローンB9を用いて生物検定法で測定した。III型プ
ロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド（Ｐ−III−N
P）は、市販のRIA（Ｐ−III−NP RIAキット、フィンラ
ンド、オウルンサロ所在、Farmos Diagnostica社）で測
定した。単球／マクロファージ（Ｍφ）の弾性組織分解
活性は、Jensen他の論文、Scand.J.Rhelum.第20巻、83
〜90頁、1991年に記載されている生Ｍφの弾性組織分解
の検定法で試験した。これらの検定の試験結果を以下の
表Ｉに示す。
ク所在、Behringwerke社）で測定した。インターロイキ
ン６（IL−６）の活性は、当該技術分野で公知の高度に
特異的なIL−６依存性マウスハイブリドーマ細胞系B13,
29クローンB9を用いて生物検定法で測定した。III型プ
ロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド（Ｐ−III−N
P）は、市販のRIA（Ｐ−III−NP RIAキット、フィンラ
ンド、オウルンサロ所在、Farmos Diagnostica社）で測
定した。単球／マクロファージ（Ｍφ）の弾性組織分解
活性は、Jensen他の論文、Scand.J.Rhelum.第20巻、83
〜90頁、1991年に記載されている生Ｍφの弾性組織分解
の検定法で試験した。これらの検定の試験結果を以下の
表Ｉに示す。
実施例VII YKL−40の血清中濃度の変化および関節炎患者の治療経
過の相関関係 この１年間に、（１）大きな群の活動性リウマチ様関
節炎患者の疾患活性をYKL−40が反映しているか否か、
および（２）メチルプレドニソロン（MP、静脈投与して
から４〜８週間炎症を軽減することが知られている）を
静脈投与して毎月治療した場合疾患を軽減する医薬のペ
ニシラミンまたはアザチオプリンの作用を高めるかまた
は加速するか否かを、疾患の経過および／または改善の
指標としてYKL−40を用いて評価するため、二重盲検プ
ラシーボ対照試験を主として行った。この試験には、Am
erican Rheumatism Association（前記のArnett他の論
文、Arthritis Rheum.を参照）で定義された確定的また
は古典的リウマチ様関節炎の患者97名が参加した。
過の相関関係 この１年間に、（１）大きな群の活動性リウマチ様関
節炎患者の疾患活性をYKL−40が反映しているか否か、
および（２）メチルプレドニソロン（MP、静脈投与して
から４〜８週間炎症を軽減することが知られている）を
静脈投与して毎月治療した場合疾患を軽減する医薬のペ
ニシラミンまたはアザチオプリンの作用を高めるかまた
は加速するか否かを、疾患の経過および／または改善の
指標としてYKL−40を用いて評価するため、二重盲検プ
ラシーボ対照試験を主として行った。この試験には、Am
erican Rheumatism Association（前記のArnett他の論
文、Arthritis Rheum.を参照）で定義された確定的また
は古典的リウマチ様関節炎の患者97名が参加した。
血液の試料は、朝のパルス治療の直前に収集し、血漿
中のYKL−40を実施例IVに記載されているようにRIAで測
定した。RA患者97名について検出した血清中YKL−40の
最初の濃度の中央値は174μg/l（範囲は40〜583μg/l）
であった。これらRA患者の血漿中YKL−40の濃度は、260
名の健康な成人の同様に測定したYKL−40血漿中濃度
（中央値102μg/l、範囲38〜514μg/l）より有意に高か
った（ｐ≧0.001）。比較するため、RA患者全員および9
9名の健康な成人について、血清中のヒアルロナンとＣ
反応性タンパク質（CRP）の濃度も試験した（スウェー
デン、ウプサラ所在のPharmacia社から入手したヒアル
ロナンの放射線検定法を使用）。
中のYKL−40を実施例IVに記載されているようにRIAで測
定した。RA患者97名について検出した血清中YKL−40の
最初の濃度の中央値は174μg/l（範囲は40〜583μg/l）
であった。これらRA患者の血漿中YKL−40の濃度は、260
名の健康な成人の同様に測定したYKL−40血漿中濃度
（中央値102μg/l、範囲38〜514μg/l）より有意に高か
った（ｐ≧0.001）。比較するため、RA患者全員および9
9名の健康な成人について、血清中のヒアルロナンとＣ
反応性タンパク質（CRP）の濃度も試験した（スウェー
デン、ウプサラ所在のPharmacia社から入手したヒアル
ロナンの放射線検定法を使用）。
各患者の手、手首および足のＸ線撮影を、治療を開始
する前と治療360日目に再び行った。放射線医師がこれ
らＸ線写真をブラインドで評価した。少なくとも1mmの
深さのびらんが存在し、かつ12か月後にびらんの数が増
加または変化したときは、臨床上有意であるとみなし
た。
する前と治療360日目に再び行った。放射線医師がこれ
らＸ線写真をブラインドで評価した。少なくとも1mmの
深さのびらんが存在し、かつ12か月後にびらんの数が増
加または変化したときは、臨床上有意であるとみなし
た。
表IIには、二つの治療群の臨床データおよび血清中YK
L−40と血清中ヒアルロナンの初期の値を示す。これら
の群に有意差はなかった。
L−40と血清中ヒアルロナンの初期の値を示す。これら
の群に有意差はなかった。
患者らは、パルス治療の二重盲検プラシーボ対照試験
に入り、４週間ごとに合計６回1000mgずつメチルプレド
ニソロン（MP）を静脈に注射され、続いて６か月間はパ
ルス治療を行わなかった。最初のパルス治療を終わって
から７日目に、患者らは、Hansen他の論文、Br.Med.
J.、第301巻、268頁、1990年に記載されているようにし
て、ペニシラミンまたはアザチオプリンで治療を開始し
た。57名の患者が同じ疾患改善薬を全体に亘って投与さ
れて、試験を完了した（37名はMP［ペニシラミン／アザ
チオプリン:20:11］で治療し、26名にはプラシーボを使
用）。11名の患者は、試験中にペニシラミンからアザチ
オプリンに変更し、そして29名は、副作用があるかまた
はアザチオプリンでの治療効果がないため、研究から除
いた。
に入り、４週間ごとに合計６回1000mgずつメチルプレド
ニソロン（MP）を静脈に注射され、続いて６か月間はパ
ルス治療を行わなかった。最初のパルス治療を終わって
から７日目に、患者らは、Hansen他の論文、Br.Med.
J.、第301巻、268頁、1990年に記載されているようにし
て、ペニシラミンまたはアザチオプリンで治療を開始し
た。57名の患者が同じ疾患改善薬を全体に亘って投与さ
れて、試験を完了した（37名はMP［ペニシラミン／アザ
チオプリン:20:11］で治療し、26名にはプラシーボを使
用）。11名の患者は、試験中にペニシラミンからアザチ
オプリンに変更し、そして29名は、副作用があるかまた
はアザチオプリンでの治療効果がないため、研究から除
いた。
この試験から得たデータを下記のように統計的に分析
した。治療中の血清中YKL−40と血清中ヒアルロナンの
比較的長時間に亘る変化を評価するため、各被検者の初
期の値を100％とし、治療を開始した後に得た値は初期
の値の百分率として表した。群間の平均差を対になって
いないデータに対するスチューデントＴ検定法によって
評価した。YKL−40の値の生データを評価したとき、群
間の比較は、対になっていない差についてのノンパラメ
トリックのマン・ホイトニー検定法と対になっている差
についてのウイルコクソン検定法を用いて、計算した。
これらの分析を行う場合、ｐ値が0.05未満のとき有意で
あるとみなした。異なるパラメータ間の相関関係は、ス
ピアマンのrho検定法を用いて算出した。この分析の場
合、ｐ値が0.01未満のとき有意であるとみなした。利用
した分析検定法は、全て当該技術分野で標準の検定法で
ある。
した。治療中の血清中YKL−40と血清中ヒアルロナンの
比較的長時間に亘る変化を評価するため、各被検者の初
期の値を100％とし、治療を開始した後に得た値は初期
の値の百分率として表した。群間の平均差を対になって
いないデータに対するスチューデントＴ検定法によって
評価した。YKL−40の値の生データを評価したとき、群
間の比較は、対になっていない差についてのノンパラメ
トリックのマン・ホイトニー検定法と対になっている差
についてのウイルコクソン検定法を用いて、計算した。
これらの分析を行う場合、ｐ値が0.05未満のとき有意で
あるとみなした。異なるパラメータ間の相関関係は、ス
ピアマンのrho検定法を用いて算出した。この分析の場
合、ｐ値が0.01未満のとき有意であるとみなした。利用
した分析検定法は、全て当該技術分野で標準の検定法で
ある。
図４（ａ）は、試験を完了した57名の患者の１年間の
試験期間の血清中YKL−40と血清中ヒアルロナンの変化
を示す。YKL−40の濃度は、MPによる治療（図４（ａ）
中の●印）が始まった後、初期値に比べて有意に低くな
り、次いでこの治療を中止した後、初期値に戻った。こ
れとは対照的に、ペニシラミンまたはアザチオプリンだ
けで治療した群（図４（ａ）中の○印）では、YKL−40
濃度は84日後にバックグランドと有意差があるに過ぎな
い。
試験期間の血清中YKL−40と血清中ヒアルロナンの変化
を示す。YKL−40の濃度は、MPによる治療（図４（ａ）
中の●印）が始まった後、初期値に比べて有意に低くな
り、次いでこの治療を中止した後、初期値に戻った。こ
れとは対照的に、ペニシラミンまたはアザチオプリンだ
けで治療した群（図４（ａ）中の○印）では、YKL−40
濃度は84日後にバックグランドと有意差があるに過ぎな
い。
YKL−40濃度に対するMPによる治療の効果は、関節疾
患の他の生化学的指標に対するその効果とも比較した。
ウシ軟骨から単利した特異的ヒアルロナン結合タンパク
質（スウェーデン、ウプサラ所在のPharmacia社）を用
いて、放射分析検定法により血清中ヒアルロナンを測定
した。血清中Ｃ反応性タンパク質（CRP）は、比濁分析
法（ドイツ、マルブルク所在のBeringwerke社）によっ
て測定した。
患の他の生化学的指標に対するその効果とも比較した。
ウシ軟骨から単利した特異的ヒアルロナン結合タンパク
質（スウェーデン、ウプサラ所在のPharmacia社）を用
いて、放射分析検定法により血清中ヒアルロナンを測定
した。血清中Ｃ反応性タンパク質（CRP）は、比濁分析
法（ドイツ、マルブルク所在のBeringwerke社）によっ
て測定した。
血清中ヒアルロナンは、MP群において１日目と168日
目に有意に減少したに過ぎない（図４（ｂ）中の●印、
プラシーボ群は○で示す）が、血清中CRPは、MP治療群
では試験期間全体に亘って有意に低下し、そしてプラシ
ーボ群では84日後に有意に低下した（図示せず）。ヒア
ルロナンについて測定した値は、１日目を除いてMP群と
プラシーボ群との間に有意差はなかった（図４（ｂ）参
照）。
目に有意に減少したに過ぎない（図４（ｂ）中の●印、
プラシーボ群は○で示す）が、血清中CRPは、MP治療群
では試験期間全体に亘って有意に低下し、そしてプラシ
ーボ群では84日後に有意に低下した（図示せず）。ヒア
ルロナンについて測定した値は、１日目を除いてMP群と
プラシーボ群との間に有意差はなかった（図４（ｂ）参
照）。
MPによる治療の経過での血漿中YKL−40の濃度の変化
は、図５（ａ）と５（ｂ）に示すように、血清中ヒアル
ロナンの濃度の変化と異なっていた。
は、図５（ａ）と５（ｂ）に示すように、血清中ヒアル
ロナンの濃度の変化と異なっていた。
したがって、MPによる治療によって、血漿中YKL−40
が有意ではあるが一過性の減少を起こし、そして血漿中
のYKL−40は治療に続く最初の数か月間、治療応答の他
の指標と相関関係があった。
が有意ではあるが一過性の減少を起こし、そして血漿中
のYKL−40は治療に続く最初の数か月間、治療応答の他
の指標と相関関係があった。
実施例VIII YKL−40の血清中濃度の、乳癌の再発後に生存率に対す
る関係 乳癌患者60名（29〜78歳）の臨床群のYKL−40血清中
濃度を、実施例IVに記載のRIAを用いて測定した。比較
を行うため、対照群の137名の疾患にかかっていない女
性（20〜79歳）のYKL−40血清中濃度も測定した。これ
らの後者の測定値はYKL−40の正常な値と中央値を示
し、この実施例に引用した。
る関係 乳癌患者60名（29〜78歳）の臨床群のYKL−40血清中
濃度を、実施例IVに記載のRIAを用いて測定した。比較
を行うため、対照群の137名の疾患にかかっていない女
性（20〜79歳）のYKL−40血清中濃度も測定した。これ
らの後者の測定値はYKL−40の正常な値と中央値を示
し、この実施例に引用した。
臨床群と対照群のメンバーはそれぞれ次のとおりであ
った。
った。
1.臨床群 原発乳癌にかかっているとすでに診断された29〜78歳
の女性60名。これらの女性は、全て抗新生物全身治療の
潜在的な候補者であった。試験へのエントリーの基準
は、１）限局性疾患の一次治療の後に遠隔転移した疑
い、２）最初の診断時での局部的に進行した疾患または
遠隔転移、および３）初めて再発した後の骨への転移が
進行している疑いがある患者、である。いかなる時点で
も他の原発癌にかかっている患者は、この試験に入れな
かった。
の女性60名。これらの女性は、全て抗新生物全身治療の
潜在的な候補者であった。試験へのエントリーの基準
は、１）限局性疾患の一次治療の後に遠隔転移した疑
い、２）最初の診断時での局部的に進行した疾患または
遠隔転移、および３）初めて再発した後の骨への転移が
進行している疑いがある患者、である。いかなる時点で
も他の原発癌にかかっている患者は、この試験に入れな
かった。
患者39名（65％）は、アジュバントの治療を前に受け
たことがあった。これらの患者の内22名（56％）は、原
発腫瘍を切除した後直ちにシクロホスファミド、メトト
レキサートおよび５−フルオロウラシルによるアジュバ
ント多剤併用化学療法を受けていた。これらの患者のい
ずれも、この試験の開始時（すなわち、検定試料収集の
時点）前の12週間の間には治療を受けていなかった。
たことがあった。これらの患者の内22名（56％）は、原
発腫瘍を切除した後直ちにシクロホスファミド、メトト
レキサートおよび５−フルオロウラシルによるアジュバ
ント多剤併用化学療法を受けていた。これらの患者のい
ずれも、この試験の開始時（すなわち、検定試料収集の
時点）前の12週間の間には治療を受けていなかった。
2.対照群 健康な女性137名（20〜79歳）のYKL−40血清中濃度を
対照群として用いるため確認した。血清の試料は、デン
マークのHvidovre HospitalのRegional Blood Transfus
ion Servicesを訪れた給血者、デンマーク、コペンハー
ゲンの異なる博物館に勤めている女性たち、およびコペ
ンハーゲンの老人のシェアードハウス（shared house）
で生活している老人女性たちから入手した。これらの女
性たちは、全て健康（分かっている疾患を持っていな
い）で、全く医療を服用しておらず、かつ全て肝臓の腎
臓の機能が正常であった。
対照群として用いるため確認した。血清の試料は、デン
マークのHvidovre HospitalのRegional Blood Transfus
ion Servicesを訪れた給血者、デンマーク、コペンハー
ゲンの異なる博物館に勤めている女性たち、およびコペ
ンハーゲンの老人のシェアードハウス（shared house）
で生活している老人女性たちから入手した。これらの女
性たちは、全て健康（分かっている疾患を持っていな
い）で、全く医療を服用しておらず、かつ全て肝臓の腎
臓の機能が正常であった。
臨床群の各患者が、その癌の再発が観察されてから続
いて生存した期間を観察した。腫瘍細胞の転移の性質も
各患者について明らかにした。これらのデータは、その
癌が再発した時点で各患者について測定したYKL−40血
清中濃度と相関関係があった。
いて生存した期間を観察した。腫瘍細胞の転移の性質も
各患者について明らかにした。これらのデータは、その
癌が再発した時点で各患者について測定したYKL−40血
清中濃度と相関関係があった。
3.再発 ここで報告する血清分析値は、全てこの試験に入る時
点で60名の各女性から入手した血液試料にいって測定し
た分析値であった。これらの女性の内47名は、乳癌の再
発が最初に疑われた時点でこの試験に入った（基準
１）。その後の試験で、これらの女性の内の６名は実際
には乳癌は再発していないことが判明した。６名の女性
は、最初の乳癌の診断の時点で疾患が局所で進行してい
たかまたは遠隔転移が起こっていたので、この試験に入
り（基準２）、そして７名の女性は、乳癌が初めて再発
してから９〜27か月後に骨に転移した疑いがあったの
で、この試験に入った（基準３）。
点で60名の各女性から入手した血液試料にいって測定し
た分析値であった。これらの女性の内47名は、乳癌の再
発が最初に疑われた時点でこの試験に入った（基準
１）。その後の試験で、これらの女性の内の６名は実際
には乳癌は再発していないことが判明した。６名の女性
は、最初の乳癌の診断の時点で疾患が局所で進行してい
たかまたは遠隔転移が起こっていたので、この試験に入
り（基準２）、そして７名の女性は、乳癌が初めて再発
してから９〜27か月後に骨に転移した疑いがあったの
で、この試験に入った（基準３）。
4.再発後の生存 患者60名の内９名は、分析の時点で依然として生存し
ていた。乳癌が初めて再発した41名の患者が再発後に生
存した期間の中央値は16か月（25％点〜75％点（四分位
範囲）＝９〜26か月）であり、そして全患者60名の対応
する値は16か月（７〜40か月）であった。表IIIに17種
の変数に対する一変量の生存データを要約した。年齢、
退形成度、血清LHD、血清AP、血清アルブミンおよび血
清YKL−40は、全て60名の患者の場合、有意な一変量予
後因子であった。図８は、個々のYKL−40の血清中濃度
の再発後生存月数に対する関係を示す。追跡の時点で、
血清YKL−40が高い25名の患者は全て死亡したが、これ
に比べて血清YKL−40が正常な35名の患者の内26名が死
亡した。16か月以内に死亡した患者の67％（30名中20
名）は、血清YKL−40が高かった。
ていた。乳癌が初めて再発した41名の患者が再発後に生
存した期間の中央値は16か月（25％点〜75％点（四分位
範囲）＝９〜26か月）であり、そして全患者60名の対応
する値は16か月（７〜40か月）であった。表IIIに17種
の変数に対する一変量の生存データを要約した。年齢、
退形成度、血清LHD、血清AP、血清アルブミンおよび血
清YKL−40は、全て60名の患者の場合、有意な一変量予
後因子であった。図８は、個々のYKL−40の血清中濃度
の再発後生存月数に対する関係を示す。追跡の時点で、
血清YKL−40が高い25名の患者は全て死亡したが、これ
に比べて血清YKL−40が正常な35名の患者の内26名が死
亡した。16か月以内に死亡した患者の67％（30名中20
名）は、血清YKL−40が高かった。
乳癌が初めて再発した41名の患者のYKL−40血清中濃
度によるカプラン・メイヤー生存曲線を図６に示す。数
は少ないが、上記２群（血清YKL−40が正常かまたは高
い２群）の生存数は、明らかに異なっている。乳癌が初
めて再発した41名の患者の18か月後の生存率は、血清YK
L−40が正常な患者の場合60％であり、血清YKL−40が高
い患者の場合24％であった（ｐ＜0.0009）。患者60名全
員について計算を行ったところ、YKL−40血清中濃度が
正常な患者と高い患者それぞれの18か月後の生存率は63
％と20％であった（ｐ＜0.0001）。
度によるカプラン・メイヤー生存曲線を図６に示す。数
は少ないが、上記２群（血清YKL−40が正常かまたは高
い２群）の生存数は、明らかに異なっている。乳癌が初
めて再発した41名の患者の18か月後の生存率は、血清YK
L−40が正常な患者の場合60％であり、血清YKL−40が高
い患者の場合24％であった（ｐ＜0.0009）。患者60名全
員について計算を行ったところ、YKL−40血清中濃度が
正常な患者と高い患者それぞれの18か月後の生存率は63
％と20％であった（ｐ＜0.0001）。
図６に示すように、再発に続いて16か月後になお生存
している臨床群のメンバーの76％は、YKL−40の血清中
濃度が164μg/L以下であった。再発に続いて30か月を超
えて生存していたメンバーの85％は、YKL−40血清中濃
度が164μg/L未満であった。したがって、乳癌が初めて
再発した後の患者の生存期間は、血清YKL−40が正常な
群の患者の場合、YKL−40血清中濃度が約164μg/l以上
の患者、特にYKL−40血清中濃度が約207μg/l（YKL−40
の「予後上で有意な濃度」）以上の患者と比べて有意に
延長された（ｐ＝0.0009）。これらのデータは、YKL−4
0の血清中濃度が高いということが、乳癌が進行してい
る患者の生存期間が短いことと相関関係があることを示
し、このような濃度が検出されたならば、一層強力な治
療プロトコルが許容されることを示唆している。この試
験の患者の場合のように、早期に死亡した患者の臨床症
状が、癌の再発に引き続いてより長い期間生存した患者
の臨床症状と実質的に差がない場合、血清YKL−40の測
定値は特に有益である。
している臨床群のメンバーの76％は、YKL−40の血清中
濃度が164μg/L以下であった。再発に続いて30か月を超
えて生存していたメンバーの85％は、YKL−40血清中濃
度が164μg/L未満であった。したがって、乳癌が初めて
再発した後の患者の生存期間は、血清YKL−40が正常な
群の患者の場合、YKL−40血清中濃度が約164μg/l以上
の患者、特にYKL−40血清中濃度が約207μg/l（YKL−40
の「予後上で有意な濃度」）以上の患者と比べて有意に
延長された（ｐ＝0.0009）。これらのデータは、YKL−4
0の血清中濃度が高いということが、乳癌が進行してい
る患者の生存期間が短いことと相関関係があることを示
し、このような濃度が検出されたならば、一層強力な治
療プロトコルが許容されることを示唆している。この試
験の患者の場合のように、早期に死亡した患者の臨床症
状が、癌の再発に引き続いてより長い期間生存した患者
の臨床症状と実質的に差がない場合、血清YKL−40の測
定値は特に有益である。
YKL−40の血清中濃度と同時に測定した他の血液タン
パク質（例えば、血清アルカリ性ホスファターゼなど）
の血清中濃度に基づいた類似のカプラン・マイヤー曲線
は、臨床群のメンバーの生存率に対して明確な相関関係
を示さなかった。
パク質（例えば、血清アルカリ性ホスファターゼなど）
の血清中濃度に基づいた類似のカプラン・マイヤー曲線
は、臨床群のメンバーの生存率に対して明確な相関関係
を示さなかった。
5.転移の部位 この研究の女性60名の内、30名の患者（50％）が軟組
織で再発し、骨への転移（Ｘ線または骨の生検で検出）
が40名（67％）の患者に見られ、そして内蔵への転移
（肺、胸膜または肝臓）は19名（32％）の患者に起こっ
た。
織で再発し、骨への転移（Ｘ線または骨の生検で検出）
が40名（67％）の患者に見られ、そして内蔵への転移
（肺、胸膜または肝臓）は19名（32％）の患者に起こっ
た。
図９は、臨床群の患者における主な転移部位に従って
血清YKL−40の分布を示す。転移がない患者６名は、全
てYKL−40の血清中濃度が正常であった。これらの群の
間のYKL−40血清中濃度は、クラスカル・ウォリス検定
の結果、高度に有意であった（ｐ＝0.03）。内蔵または
骨への転移があった患者の血清YKL−40の中央値は、転
移がない患者の濃度および健康な年齢の釣り合った女性
の濃度（102μg/l、ｐ＜0.001）に比べて有意に高かっ
た（ｐ＜0.5）。乳癌が初めて再発した41名の患者だけ
を計算に用いても、類似の有意差性が認められた。
血清YKL−40の分布を示す。転移がない患者６名は、全
てYKL−40の血清中濃度が正常であった。これらの群の
間のYKL−40血清中濃度は、クラスカル・ウォリス検定
の結果、高度に有意であった（ｐ＝0.03）。内蔵または
骨への転移があった患者の血清YKL−40の中央値は、転
移がない患者の濃度および健康な年齢の釣り合った女性
の濃度（102μg/l、ｐ＜0.001）に比べて有意に高かっ
た（ｐ＜0.5）。乳癌が初めて再発した41名の患者だけ
を計算に用いても、類似の有意差性が認められた。
転移があった54名の患者の内、25名はYKL−40血清中
濃度が限界濃度（cut−off level）の207μg/lを超えて
いた。軟組織で再発した患者の場合（ｎ＝10）、血清YK
L−40の中央値は123μg/Lであり、そして２名の患者だ
け血清YKL−40が高かった。これら２名の患者の内の１
名は、YKL−40血清中濃度が非常に高く（904μg/l）、
５か月後に死亡した。血液サンプリングの時点でこの患
者は胸膜浸出を起こしていたが、顕微鏡検鏡では悪性細
胞は認められなかった。骨への転移があった患者（＝／
−軟組織での再発（Ｎ＝25））の血清YKL−40の中央値
は157μg/lであり、これら患者の内12名（48％）は血清
YKL−40が高かった。４名の患者は、内蔵への転移だけ
が認められ、これら患者の内３名（75％）の血清YKL−4
0は正常値を超える値であった。
濃度が限界濃度（cut−off level）の207μg/lを超えて
いた。軟組織で再発した患者の場合（ｎ＝10）、血清YK
L−40の中央値は123μg/Lであり、そして２名の患者だ
け血清YKL−40が高かった。これら２名の患者の内の１
名は、YKL−40血清中濃度が非常に高く（904μg/l）、
５か月後に死亡した。血液サンプリングの時点でこの患
者は胸膜浸出を起こしていたが、顕微鏡検鏡では悪性細
胞は認められなかった。骨への転移があった患者（＝／
−軟組織での再発（Ｎ＝25））の血清YKL−40の中央値
は157μg/lであり、これら患者の内12名（48％）は血清
YKL−40が高かった。４名の患者は、内蔵への転移だけ
が認められ、これら患者の内３名（75％）の血清YKL−4
0は正常値を超える値であった。
図12は、Ｘ線検査による骨への転移の生存に対する個
々のYKL−40血清中濃度を示す。内蔵への転移があった
患者の場合、YKL−40血清中濃度が増大するので、この
発明の発明者らは、内蔵への罹患がない患者（Ｎ＝41）
の診断値だけを評価した。２箇所以上の骨への転移があ
った患者は、骨への転移が１箇所だけか全くなかった患
者に比べて、血清YKL−40が有意に高かった（ｐ＜0.0
5）。Ｘ線写真が正常であった４名の患者は、YKL−40が
高かった。しかし、これらの患者の内の２名は、ポジテ
ィブ・ボーン・スキャンニング（positive bone scanni
ng）の生検を行った結果、骨髄癌症が見出され、残りの
２名は６か月以内にＸ線写真で認められる骨への転移が
発生した。
々のYKL−40血清中濃度を示す。内蔵への転移があった
患者の場合、YKL−40血清中濃度が増大するので、この
発明の発明者らは、内蔵への罹患がない患者（Ｎ＝41）
の診断値だけを評価した。２箇所以上の骨への転移があ
った患者は、骨への転移が１箇所だけか全くなかった患
者に比べて、血清YKL−40が有意に高かった（ｐ＜0.0
5）。Ｘ線写真が正常であった４名の患者は、YKL−40が
高かった。しかし、これらの患者の内の２名は、ポジテ
ィブ・ボーン・スキャンニング（positive bone scanni
ng）の生検を行った結果、骨髄癌症が見出され、残りの
２名は６か月以内にＸ線写真で認められる骨への転移が
発生した。
一つ以上の骨への転移の有無に対するYKL−40血清中
濃度の関係を述べると、試験結果が陽性の臨床群のメン
バーは、試験結果が陰性のメンバーとは対照的にYKL−4
0の濃度が高かった。そのうえに、二つ以上の骨への転
移があり試験結果が陽性のメンバーは、一つの骨への転
移があるメンバーとは対照的にYKL−40の濃度が高かっ
た（図10参照）。
濃度の関係を述べると、試験結果が陽性の臨床群のメン
バーは、試験結果が陰性のメンバーとは対照的にYKL−4
0の濃度が高かった。そのうえに、二つ以上の骨への転
移があり試験結果が陽性のメンバーは、一つの骨への転
移があるメンバーとは対照的にYKL−40の濃度が高かっ
た（図10参照）。
YKL−40の血清中濃度と、各患者の更年期状態など他
の臨床パラメータとの間に明確な関係はなかった（以下
の表IIIとIV参照）。しかし、YKL−40の血清中濃度は、
内蔵への転移があった患者の75％と骨への転移があった
患者の48％が正常の濃度より高かった。YKL−40の濃度
と年齢の間に明確な関係はないようであったが、図７に
示すように、YKL−40の異常な濃度は70歳未満の健康な
女性（対照群）には現れなかった。したがって、特に、
測定された他の血液タンパク質と比較すると（表III〜I
V参照）、YKL−40の濃度は、乳癌の癌細胞の骨および内
蔵への転移について診断上の価値がある。
の臨床パラメータとの間に明確な関係はなかった（以下
の表IIIとIV参照）。しかし、YKL−40の血清中濃度は、
内蔵への転移があった患者の75％と骨への転移があった
患者の48％が正常の濃度より高かった。YKL−40の濃度
と年齢の間に明確な関係はないようであったが、図７に
示すように、YKL−40の異常な濃度は70歳未満の健康な
女性（対照群）には現れなかった。したがって、特に、
測定された他の血液タンパク質と比較すると（表III〜I
V参照）、YKL−40の濃度は、乳癌の癌細胞の骨および内
蔵への転移について診断上の価値がある。
6.コックスの回帰分析 初期コックスモデルには一変量の有意な血液検査と再
発なしの期間が含まれていた。血清アルブミンは、その
値が患者の40％についてしか記録されていなかったの
で、含めなかった。この初期モデルは、血清YKL−40と
血清LDHだけが、60名の患者が再発した後の生存につい
ての独立した予後因子であることを示した（表III）。
変数減少法と変数増加法によって、血清YKL−40（ｐ＝
0.001）と血清LDH（ｐ＝0.01）を除いて、全てのコバリ
エート（covariate）をエリミネート（eliminaite）し
た。乳癌が初めて再発した41名の患者だけを計算に含め
た場合も、やはり変数減少法と変数増加法によって、血
清YKL−40（ｐ＝0.0004）と血清LDH（ｐ＝0.037）を除
いて、全てのコバリエートをエリミネートした。
発なしの期間が含まれていた。血清アルブミンは、その
値が患者の40％についてしか記録されていなかったの
で、含めなかった。この初期モデルは、血清YKL−40と
血清LDHだけが、60名の患者が再発した後の生存につい
ての独立した予後因子であることを示した（表III）。
変数減少法と変数増加法によって、血清YKL−40（ｐ＝
0.001）と血清LDH（ｐ＝0.01）を除いて、全てのコバリ
エート（covariate）をエリミネート（eliminaite）し
た。乳癌が初めて再発した41名の患者だけを計算に含め
た場合も、やはり変数減少法と変数増加法によって、血
清YKL−40（ｐ＝0.0004）と血清LDH（ｐ＝0.037）を除
いて、全てのコバリエートをエリミネートした。
これら二種のYKL−40血清中濃度と二種のLDH血清中濃
度の４種の組合せの推定生存パターンに基づいて算出し
た、血清LDHが正常であって、血清YKL−40が正常な患者
と血清YKL−40が高い患者についての12か月後の生存率
は、それぞれ83％と56％であった。LDH血清中濃度が高
い患者の中で、YKL−40が正常な患者および血清YKL−40
が高い患者の12か月の生存率は、それぞれ67％と28％で
あった。
度の４種の組合せの推定生存パターンに基づいて算出し
た、血清LDHが正常であって、血清YKL−40が正常な患者
と血清YKL−40が高い患者についての12か月後の生存率
は、それぞれ83％と56％であった。LDH血清中濃度が高
い患者の中で、YKL−40が正常な患者および血清YKL−40
が高い患者の12か月の生存率は、それぞれ67％と28％で
あった。
実施例IX 骨関節症の患者の血清と滑液の中のYKL−40の検出と定
量およびひざの外傷を有する患者に検出された濃度との
比較 関節の結合組織の加速代謝が、炎症性関節疾患（例え
ば、RAなど）のみならず、退行性関節疾患（例えば骨関
節症など）で起こることが知られている。しかし、その
類似点以上に、退行性関節疾患と炎症性関節疾患の発生
機序は、類似していない。例えば、退行性関節炎は、重
量と衝撃の負荷に繰り返しさらされることによって起こ
る骨の微小骨折に関すると考えられている。治癒する場
合、その骨折は、硬質で厚い軟滑下の骨で覆われるが、
この骨は重量の負荷に伴うエネルギーを吸収しにくい。
したがって、関節軟骨の軟骨細胞は、骨から屈折した圧
力を受けて軟骨細胞の増殖と代謝を刺激する。最初、身
体は必要に応じて修復することができるが、結局、退行
性プロセスが優勢になり、軟骨が損失するに至る（例え
ば「Harrison's Principles of Internal Medicin
e」、第11版、McGraw−Hill社1987年1456頁など参
照）。
量およびひざの外傷を有する患者に検出された濃度との
比較 関節の結合組織の加速代謝が、炎症性関節疾患（例え
ば、RAなど）のみならず、退行性関節疾患（例えば骨関
節症など）で起こることが知られている。しかし、その
類似点以上に、退行性関節疾患と炎症性関節疾患の発生
機序は、類似していない。例えば、退行性関節炎は、重
量と衝撃の負荷に繰り返しさらされることによって起こ
る骨の微小骨折に関すると考えられている。治癒する場
合、その骨折は、硬質で厚い軟滑下の骨で覆われるが、
この骨は重量の負荷に伴うエネルギーを吸収しにくい。
したがって、関節軟骨の軟骨細胞は、骨から屈折した圧
力を受けて軟骨細胞の増殖と代謝を刺激する。最初、身
体は必要に応じて修復することができるが、結局、退行
性プロセスが優勢になり、軟骨が損失するに至る（例え
ば「Harrison's Principles of Internal Medicin
e」、第11版、McGraw−Hill社1987年1456頁など参
照）。
これとは対照的に、炎症性関節疾患での軟骨の損失
は、滑液の炎症によって起こると考えられている。時間
の経過とともに、滑液は関節窩中に突出する絨毛を形成
する。特に、RAになる素因は遺伝によって付与されると
考えられているが、HLA−DR4、すなわちクラス11の主要
組織適合性遺伝子複合体の分子との関連は、まだ明らか
になっていない。炎症性関節疾患は、非炎症性関節疾患
から炎症性関節疾患を区別する徴候である早期硬直を含
めて、かなり特異的な臨床発症を起こす（例えば前掲の
［Harrison's Principles of Internal Medicine」
1423頁など参照）。
は、滑液の炎症によって起こると考えられている。時間
の経過とともに、滑液は関節窩中に突出する絨毛を形成
する。特に、RAになる素因は遺伝によって付与されると
考えられているが、HLA−DR4、すなわちクラス11の主要
組織適合性遺伝子複合体の分子との関連は、まだ明らか
になっていない。炎症性関節疾患は、非炎症性関節疾患
から炎症性関節疾患を区別する徴候である早期硬直を含
めて、かなり特異的な臨床発症を起こす（例えば前掲の
［Harrison's Principles of Internal Medicine」
1423頁など参照）。
炎症性関節疾患と非炎症性関節疾患との間で発生機序
および病状に差があると仮定すると、一方の疾患の指標
が他方の疾患の指標として役立つであろうとは予想でき
ないであろう。したがって、YKL−40の濃度が、RAの患
者の体液中のみならず、骨関節症の患者の体液中でも診
断を行うのに有意な程度まで上昇することを発見したこ
とは、予想外のことであった。
および病状に差があると仮定すると、一方の疾患の指標
が他方の疾患の指標として役立つであろうとは予想でき
ないであろう。したがって、YKL−40の濃度が、RAの患
者の体液中のみならず、骨関節症の患者の体液中でも診
断を行うのに有意な程度まで上昇することを発見したこ
とは、予想外のことであった。
この発見は、外傷のひざ損傷および骨関節症（後期）
の患者由来のYKL−40の血清中および滑液中の濃度を、
健康な小児と成人由来のYKL−40血清中濃度（この後者
のデータでYKL−40血清中濃度のベースライン「正常」
濃度を確認した）と比較する研究中になされた。
の患者由来のYKL−40の血清中および滑液中の濃度を、
健康な小児と成人由来のYKL−40血清中濃度（この後者
のデータでYKL−40血清中濃度のベースライン「正常」
濃度を確認した）と比較する研究中になされた。
1.対照群 正常な小児476名（６〜17歳、236名の女性と240名の
男子）がこの試験に参加した。また275名の成人（18〜7
9歳、146名の女性と127名の男性）がこの試験に参加し
た。各参加者は、通常の医療標準に従って検査され、健
康であると確認された。
男子）がこの試験に参加した。また275名の成人（18〜7
9歳、146名の女性と127名の男性）がこの試験に参加し
た。各参加者は、通常の医療標準に従って検査され、健
康であると確認された。
2.患者群 成人96名（18〜79歳、37名の女性と59名の男性）がこ
の試験に参加した。臨床上、これらの参加者を次のよう
にグループ分けした。Ａ群＝ひざの痛みがあるので関節
鏡検査を行ったが、ひざの疾患はないと確認された12名
の患者、Ｂ群＝滑膜炎はないが、外傷を示す異常な関節
鏡検査結果を示す18名の患者、Ｃ群＝軽度〜中度の滑膜
炎の患者22名、Ｄ群＝急性の重症滑膜炎の18名の患者、
Ｅ群＝慢性外傷後滑膜炎の10名の患者、Ｆ群＝骨関節症
（後期、ひざ）の16名の患者。血清は、各患者から収集
し、滑液は、51名の患者から分析を行うのに充分な量だ
け入手した。
の試験に参加した。臨床上、これらの参加者を次のよう
にグループ分けした。Ａ群＝ひざの痛みがあるので関節
鏡検査を行ったが、ひざの疾患はないと確認された12名
の患者、Ｂ群＝滑膜炎はないが、外傷を示す異常な関節
鏡検査結果を示す18名の患者、Ｃ群＝軽度〜中度の滑膜
炎の患者22名、Ｄ群＝急性の重症滑膜炎の18名の患者、
Ｅ群＝慢性外傷後滑膜炎の10名の患者、Ｆ群＝骨関節症
（後期、ひざ）の16名の患者。血清は、各患者から収集
し、滑液は、51名の患者から分析を行うのに充分な量だ
け入手した。
これらの患者は、通常の医療基準に従って、その外の
点では健康であると確認された。これらの患者は、14名
の骨関節症の患者（これらの患者は非ステロイドの抗炎
症薬を投与されていた）を除いて、医薬を投与されてい
なかった。
点では健康であると確認された。これらの患者は、14名
の骨関節症の患者（これらの患者は非ステロイドの抗炎
症薬を投与されていた）を除いて、医薬を投与されてい
なかった。
YKL−40の血清中および滑液中の濃度は、実施例IVに
記載されているようにして測定した。検定結果の統計的
分析は、標準の方法に従って分析を行う市販のソフトウ
ェアプログラム（SSPSソフトウェア）を用いて実施し
た。群間の比較は、当該技術分野で公知のノンパラメト
リックのマン・ホイトニー検定法とクラスカル・ウォリ
ス検定法を用いて算出して行った。異なるパラメータ間
の相関関係は、当該技術分野で公知のスピアマンrho検
定法を用いて算出した。ｐ値が0.05未満のとき有意であ
るとみなした。
記載されているようにして測定した。検定結果の統計的
分析は、標準の方法に従って分析を行う市販のソフトウ
ェアプログラム（SSPSソフトウェア）を用いて実施し
た。群間の比較は、当該技術分野で公知のノンパラメト
リックのマン・ホイトニー検定法とクラスカル・ウォリ
ス検定法を用いて算出して行った。異なるパラメータ間
の相関関係は、当該技術分野で公知のスピアマンrho検
定法を用いて算出した。ｐ値が0.05未満のとき有意であ
るとみなした。
この試験で得たデータを以下に示す。
要約すると、後期ひざ骨関節症の患者は、患者群中の
他の参加者および対照群と比べて、YKL−40の血清中お
よび滑液中の濃度が有意に高かった（1.5〜2.0倍）（表
ＶとVI参照）。YKL−40の濃度は、血清中に比べて滑液
中の方が約10倍であることが見出されたが、これは多分
YKL−40が局所で産生されることを反映しているのであ
ろう。軟骨は、骨関節症のひざには比較的少量存在して
いるので、滑液中に見出されたYKL−40のかなりの部分
が、滑膜細胞の過形状または滑膜細胞によるYKL−40の
分泌の増大によって、滑膜において合成されると考えら
れる。この仮定は、さらに重症の滑膜炎の患者の方が、
軽度の滑膜炎または滑膜炎なしの患者と比べて、YKL−4
0の濃度が有意に高かった（７〜16倍）という観察結果
で裏付けされている。しかし、YKL−40は、軟骨細胞に
よって滑液中に分泌されている可能性もある。その起源
の如何に拘わらず、ひざの外傷の症例とは対照的に、YK
L−40は、骨マトリックスの成分に作用してYKL−40に関
連する骨関節症などの結合組織疾患を発現させた後、該
成分を分解するようである。
他の参加者および対照群と比べて、YKL−40の血清中お
よび滑液中の濃度が有意に高かった（1.5〜2.0倍）（表
ＶとVI参照）。YKL−40の濃度は、血清中に比べて滑液
中の方が約10倍であることが見出されたが、これは多分
YKL−40が局所で産生されることを反映しているのであ
ろう。軟骨は、骨関節症のひざには比較的少量存在して
いるので、滑液中に見出されたYKL−40のかなりの部分
が、滑膜細胞の過形状または滑膜細胞によるYKL−40の
分泌の増大によって、滑膜において合成されると考えら
れる。この仮定は、さらに重症の滑膜炎の患者の方が、
軽度の滑膜炎または滑膜炎なしの患者と比べて、YKL−4
0の濃度が有意に高かった（７〜16倍）という観察結果
で裏付けされている。しかし、YKL−40は、軟骨細胞に
よって滑液中に分泌されている可能性もある。その起源
の如何に拘わらず、ひざの外傷の症例とは対照的に、YK
L−40は、骨マトリックスの成分に作用してYKL−40に関
連する骨関節症などの結合組織疾患を発現させた後、該
成分を分解するようである。
実施例Ｘ アルコール肝硬変の患者および健康な肝臓組織を有する
成人由来の血清中のYKL−40濃度の検出 成人39名がこの試験に参加した。すなわち、正常な肝
機能を有する患者16名（７名の女性と９名の男性、年齢
35〜74歳）および肝臓疾患を有する患者23名（８名の女
性と15名の男性、年齢31〜75歳）である。正常な肝機能
を有する成人のうち、７名は健康であったが、７名は動
脈性高血圧症と診断され、１名は腎血管性高血圧症と診
断され、そして１名は腸性虚血と診断された。肝臓の機
能が異状な成人のうち、18名は活動性肝炎を伴ったアル
コール肝硬変であり、２名は活動性肝炎なしのアルコー
ル肝硬変であり、２名は未知原因の肝炎であり、そして
１名は脂肪変性肝炎であった。この試験の期間中、患者
はだれもアルコールを消費していなかった。
成人由来の血清中のYKL−40濃度の検出 成人39名がこの試験に参加した。すなわち、正常な肝
機能を有する患者16名（７名の女性と９名の男性、年齢
35〜74歳）および肝臓疾患を有する患者23名（８名の女
性と15名の男性、年齢31〜75歳）である。正常な肝機能
を有する成人のうち、７名は健康であったが、７名は動
脈性高血圧症と診断され、１名は腎血管性高血圧症と診
断され、そして１名は腸性虚血と診断された。肝臓の機
能が異状な成人のうち、18名は活動性肝炎を伴ったアル
コール肝硬変であり、２名は活動性肝炎なしのアルコー
ル肝硬変であり、２名は未知原因の肝炎であり、そして
１名は脂肪変性肝炎であった。この試験の期間中、患者
はだれもアルコールを消費していなかった。
一夜断食した後、患者たちは局所麻酔下で肝静脈に
（肝疾患の患者20名および肝機能が正常である患者14
名）または腎静脈に（肝疾患の患者17名および肝機能が
正常である患者13名）にカテーテルを挿入した。血液試
料は、各患者の大腿動脈と臓器静脈から入手し次いで実
施例IVに記載したようにして放射線免疫検定方で分析し
た。
（肝疾患の患者20名および肝機能が正常である患者14
名）または腎静脈に（肝疾患の患者17名および肝機能が
正常である患者13名）にカテーテルを挿入した。血液試
料は、各患者の大腿動脈と臓器静脈から入手し次いで実
施例IVに記載したようにして放射線免疫検定方で分析し
た。
対照基準として実施例IXに報告した健康成人由来のデ
ータを使用して、上記患者から収集したデータと比較し
た。統計的分析は、実施例IXに記載したのと同様にして
実施した。動静脈除去率は、Ｅ＝Ca−Cv/Ca（式中、Ca
は大腿動脈血漿中のYKL−40の免疫反応性であり、そし
てCvは腎静脈由来の血漿中のYKL−40の免疫反応性であ
る）として求めた。硬変症の患者と対照の腎臓除去率に
は有意差はなく、それぞれ0.051（範囲＝0.0076〜0.1
4）および0.028（範囲＝−0.0294〜0.3040）であった。
しかし、肝疾患の患者は、YKL−40の濃度が、肝機能が
正常の患者由来の試料中に検出したYKL−40の濃度と比
べて非常に高かった（ｐ＜0.001）。
ータを使用して、上記患者から収集したデータと比較し
た。統計的分析は、実施例IXに記載したのと同様にして
実施した。動静脈除去率は、Ｅ＝Ca−Cv/Ca（式中、Ca
は大腿動脈血漿中のYKL−40の免疫反応性であり、そし
てCvは腎静脈由来の血漿中のYKL−40の免疫反応性であ
る）として求めた。硬変症の患者と対照の腎臓除去率に
は有意差はなく、それぞれ0.051（範囲＝0.0076〜0.1
4）および0.028（範囲＝−0.0294〜0.3040）であった。
しかし、肝疾患の患者は、YKL−40の濃度が、肝機能が
正常の患者由来の試料中に検出したYKL−40の濃度と比
べて非常に高かった（ｐ＜0.001）。
肝疾患の患者由来の動脈血と静脈血中に検出された血
清YKL−40値の中央値を、肝機能が正常な患者由来の動
脈血と静脈血中に検出された血清YKL−40値の中央値と
比較した。表VIに示すように、前者の測定値は後者の測
定値の約４倍であったが（ｐは0.001未満であった）、
これはYKL−40が肝組織の退行に関連していることを強
く示している。
清YKL−40値の中央値を、肝機能が正常な患者由来の動
脈血と静脈血中に検出された血清YKL−40値の中央値と
比較した。表VIに示すように、前者の測定値は後者の測
定値の約４倍であったが（ｐは0.001未満であった）、
これはYKL−40が肝組織の退行に関連していることを強
く示している。
この発明について十分に説明したので、当該技術分野
の当業者にとって、この発明の精神および範囲から逸脱
することなく、上記の実施例と改変できるであろうこと
は明らかであろう。
の当業者にとって、この発明の精神および範囲から逸脱
することなく、上記の実施例と改変できるであろうこと
は明らかであろう。
配列の概要 配列番号:1はYKL−40タンパク質のＮ末端アミノ酸配列
である。
である。
配列番号:2はYKL−40タンパク質の内部アミノ酸配列
（「YKL−40ペプチドＡ」）である。
（「YKL−40ペプチドＡ」）である。
配列番号:3はYKL−40タンパク質の別の内部アミノ酸配
列（「YKL−40ペプチドＢ」）である。
列（「YKL−40ペプチドＢ」）である。
配列番号:4はYKL−40の遺伝子のコーディング領域のcDN
Aヌクレオチド配列である。成熟した分泌タンパク質の
開始コドンは135位のヌクレオチドから始まる。
Aヌクレオチド配列である。成熟した分泌タンパク質の
開始コドンは135位のヌクレオチドから始まる。
配列リスト （１）一般情報 （ i ）出願人 カリフォルニア大学理事会 （ii）発明の名称 哺乳類の結合組織マトリックスの
分解の指標としてのYKL−40の検定方法 （iii ）配列の数 ４ （iv）連絡住所 （Ａ）宛先 SPENSLEY HORN JUBAS ＆ LUB
ITZ （Ｂ）街 センチュリーパークイースト 18
00、５階 （Ｃ）市 ロサンゼルス （Ｄ）州 カリフォルニア （Ｅ）国 アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号 90067 （ v ）コンピュータ読み取り書式 （Ａ）メディアタイプ フロッピディスク （Ｂ）コンピュータ IBM−PCコンパチ （Ｃ）OS PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア Patentin Release ＃1.
0,Version ＃1.25 （vi）本件出願データ （Ａ）出願番号 PCT （Ｂ）出願日 1994−07−08 （Ｃ）分類 （viii）代理人情報 （Ａ） 氏名 HOWELLS,STACY L. （Ｂ）登録番号 34,842 （Ｃ）整理番号 FD 3665 （ix）通信情報 （Ａ）電話 619/455−5100 （Ｂ）FAL 619/455−5110 （２）配列情報 配列ID番号 １ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ 25アミノ酸 （Ｂ）配列の列 アミノ酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 ペプチド （vii ）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40のＮ末端配列 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ペプチド （Ｂ）存在位置 1..25 （xi）配列の記述 配列ID番号:1 Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser Gln 1 5 10 Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Xaa Phe Pro Asp Ala 15 20 Leu 25 （２）配列情報 配列ID番号 ２ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ 19アミノ酸 （Ｂ）配列の型 アミノ酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 ペプチド （vii）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40の内部ペプチドＡ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ペプチド （Ｂ）存在位置 1..19 （xi）配列の記述 配列ID番号:2 Leu Asn Thr Leu Lys Asn Arg Ash Pro Asn Leu Lys 1 5 10 Tyr Leu Leu Ser Val Gly Gly 15 （２）配列情報 配列ID番号 ３ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ ７アミノ酸 （Ｂ）配列の型 アミノ酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 ペプチド （vii）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40の内部ペプチドＢ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ペプチド （Ｂ）存在位置 1..7 （xi）配列の記述 配列ID番号:3 Leu Arg Leu Gly Ala Pro ALa 1 5 （２）配列情報 配列ID番号 ４ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ 1681塩基対 （Ｂ）配列の型 核酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 DNA（genomic） （vii）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー CDS （Ｂ）存在位置 135..1681 （xi ）配列の記述 配列ID番号:4
分解の指標としてのYKL−40の検定方法 （iii ）配列の数 ４ （iv）連絡住所 （Ａ）宛先 SPENSLEY HORN JUBAS ＆ LUB
ITZ （Ｂ）街 センチュリーパークイースト 18
00、５階 （Ｃ）市 ロサンゼルス （Ｄ）州 カリフォルニア （Ｅ）国 アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号 90067 （ v ）コンピュータ読み取り書式 （Ａ）メディアタイプ フロッピディスク （Ｂ）コンピュータ IBM−PCコンパチ （Ｃ）OS PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア Patentin Release ＃1.
0,Version ＃1.25 （vi）本件出願データ （Ａ）出願番号 PCT （Ｂ）出願日 1994−07−08 （Ｃ）分類 （viii）代理人情報 （Ａ） 氏名 HOWELLS,STACY L. （Ｂ）登録番号 34,842 （Ｃ）整理番号 FD 3665 （ix）通信情報 （Ａ）電話 619/455−5100 （Ｂ）FAL 619/455−5110 （２）配列情報 配列ID番号 １ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ 25アミノ酸 （Ｂ）配列の列 アミノ酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 ペプチド （vii ）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40のＮ末端配列 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ペプチド （Ｂ）存在位置 1..25 （xi）配列の記述 配列ID番号:1 Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser Gln 1 5 10 Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Xaa Phe Pro Asp Ala 15 20 Leu 25 （２）配列情報 配列ID番号 ２ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ 19アミノ酸 （Ｂ）配列の型 アミノ酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 ペプチド （vii）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40の内部ペプチドＡ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ペプチド （Ｂ）存在位置 1..19 （xi）配列の記述 配列ID番号:2 Leu Asn Thr Leu Lys Asn Arg Ash Pro Asn Leu Lys 1 5 10 Tyr Leu Leu Ser Val Gly Gly 15 （２）配列情報 配列ID番号 ３ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ ７アミノ酸 （Ｂ）配列の型 アミノ酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 ペプチド （vii）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40の内部ペプチドＢ （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー ペプチド （Ｂ）存在位置 1..7 （xi）配列の記述 配列ID番号:3 Leu Arg Leu Gly Ala Pro ALa 1 5 （２）配列情報 配列ID番号 ４ （ i ）配列特性 （Ａ）配列の長さ 1681塩基対 （Ｂ）配列の型 核酸 （Ｃ）鎖の数 一本鎖 （Ｄ）トポロジー 直鎖状 （ii）配列の種類 DNA（genomic） （vii）直接の起源 （Ｂ）クローン名 YKL−40 （ix）配列の特徴 （Ａ）名称／キー CDS （Ｂ）存在位置 135..1681 （xi ）配列の記述 配列ID番号:4
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 33/574 Ｄ // Ｇ０１Ｎ 33/564 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ 33/574 ＡＢＪ (72)発明者 ジョハンセン ジュリア エス. デンマーク ＤＫ―2000 コペンハーゲ ンＦ シー．エフ．リッチスベイ 99 エイ アイティーユー (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａ ｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ ７［５］（1992）ｐ．501−512 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/577 G01N 33/564 G01N 33/574
Claims (35)
- 【請求項１】診断を行うのに有意な濃度のYKL−40が哺
乳類の生体試料中に存在しているか否かを検出すること
からなる、哺乳類のYKL−40含有結合組織の分解に関連
する疾患状態の存在を確認する方法。 - 【請求項２】試料中のYKL−40の量を免疫検定法を用い
て検出する請求の範囲１記載の方法。 - 【請求項３】免疫検定方が競合免疫検定法である請求の
範囲２記載の方法。 - 【請求項４】免疫検定法が、放射性同位元素、酵素、蛍
光分子、化学発光分子、生物発光分子およびコロイド金
属からなる群から選択される検出可能な標識を利用して
YKL−40を検出する請求の範囲３記載の方法。 - 【請求項５】疾患状態が、炎症性または退行性の関節疾
患である請求の範囲１記載の方法。 - 【請求項６】疾患が肝硬変である請求の範囲１記載の方
法。 - 【請求項７】疾患状態が転移性癌である請求の範囲１記
載の方法。 - 【請求項８】疾患状態が転移性乳癌である請求の範囲１
記載の方法。 - 【請求項９】哺乳類がヒトである請求の範囲１記載の方
法。 - 【請求項１０】免疫検定方法がポリクロナール抗体を使
用してYKL−40を検出する請求の範囲２記載の方法。 - 【請求項１１】免疫検定方法がモノクローナル抗体を使
用してYKL−40を検出する請求の範囲２記載の方法。 - 【請求項１２】生体試料が、疾患状態になった組織であ
る請求の範囲１記載の方法。 - 【請求項１３】生体試料が血液、血清または血漿である
請求の範囲12記載の方法。 - 【請求項１４】YKL−40が、癌で再発した後に患者から
採取した血清の試料中に予後を行うのに有意な濃度で存
在しているのか否かを検出し測定することからなる、癌
が寛解後に再発した乳癌患者の生存期間の予後を示唆す
るデータを得る方法。 - 【請求項１５】データを得る方法が、血清試料中にYKL
−40が存在していることを、YKL−40に対して特異的な
抗体に結合された検出可能な標識に提供されるシグナル
で示す競合免疫検定法からなる請求の範囲14記載の方
法。 - 【請求項１６】検出可能な標識が、放射性同位元素、酵
素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およびコロ
イド金属からなる群から選択される請求の範囲15記載の
方法。 - 【請求項１７】抗体が、YKL−40に対して特異的に反応
性であるポリクロナール抗体である請求の範囲15記載の
方法。 - 【請求項１８】抗体が、YKL−40に対して特異的に反応
性であるモノクロナール抗体である請求の範囲15記載の
方法。 - 【請求項１９】哺乳類の生体試料中に存在するYKL−40
の量の増減を検出することからなる、哺乳類のYKL−40
含有結合組織の分解に関連する疾患状態の経過または改
善を監視する方法。 - 【請求項２０】試料中のYKL−40の量が免疫検定法を用
いて検出される請求の範囲19記載の方法。 - 【請求項２１】免疫検定法が競合免疫検定法である請求
の範囲20記載の方法。 - 【請求項２２】免疫検定法が、放射性同位元素、酵素、
蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子およびコロイド
金属からなる群から選択される検出可能な標識を、シグ
ナルとして使用してYKL−40を検出する請求の範囲20記
載の方法。 - 【請求項２３】疾患が炎症または退行性の関節疾患であ
る請求の範囲19記載の方法。 - 【請求項２４】哺乳類がヒトである請求の範囲19記載の
方法。 - 【請求項２５】免疫検定方法がポリクロナール抗体を使
用してYKL−40を検出する請求の範囲21記載の方法。 - 【請求項２６】免疫検定方法がモノクロナール抗体を使
用してYKL−40を検出する請求の範囲21記載の方法。 - 【請求項２７】生体試料が、疾患状態になった組織から
採取した体液または組織の試料である請求の範囲26記載
の方法。 - 【請求項２８】YKL−40抗体と免疫検定用試薬が入って
いる、請求の範囲１記載の方法に用いるキット。 - 【請求項２９】YKL−40抗体と免疫検定用試薬が入って
いる、請求の範囲20記載の方法に用いるキット。 - 【請求項３０】免疫検定方法がサンドイッチ免疫検定法
である請求の範囲２記載の方法。 - 【請求項３１】サンドイッチ免疫検定法が酵素結合イム
ノソルベント検定法である請求の範囲30記載の方法。 - 【請求項３２】免疫検定法がサンドイッチ免疫検定法で
ある請求の範囲14記載の方法。 - 【請求項３３】サンドイッチ免疫検定法が酵素結合イム
ノソルベント検定法である請求の範囲32記載の方法。 - 【請求項３４】免疫検定法がサンドイッチ免疫検定法で
ある請求の範囲20記載の方法。 - 【請求項３５】サンドイッチ免疫検定法が酵素結合イム
ノソルベント検定法である請求の範囲34記載の方法。
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