JP5231477B2 - 関節炎の診断および治療のためのグルコース−6−ホスフェートイソメラーゼおよびその抗体の使用、ならびに抗関節炎化合物の試験 - Google Patents
関節炎の診断および治療のためのグルコース−6−ホスフェートイソメラーゼおよびその抗体の使用、ならびに抗関節炎化合物の試験 Download PDFInfo
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Description
− 関節炎の哺乳動物、例えばK/BxNトランスジェニックマウスから血清を得ること、
− 該血清の種々のIgGフラクションを調製し、該フラクションの関節炎を誘導する能力についてそれらを試験し、最終的にこれらのフラクションに基づくサブフラクションを調製すること、
− 該フラクションのIgGを有するアフィニティークロマトグラフィーカラムを調製すること、
− 該カラムによって、同一哺乳動物の器官由来のタンパク質抽出物から、GPI様タンパク質を単離し、精製すること。
− 関節炎の哺乳動物、好ましくはK/BxNトランスジェニックマウス由来の血清から、種々のIgGフラクションまたはサブフラクションを調製する工程、
− マトリクスとして該フラクションのIgGを有するアフィニティークロマトグラフィーによって、GPI様タンパク質を単離する工程。
a)関節炎の哺乳動物の脾細胞、好ましくはK/BxNマウスの脾細胞由来のリンパ球からハイブリドーマを調製する工程、
b)HAT培地中で限界希釈条件で該ハイブリドーマを選択する工程、
c)ELISAアッセイにおいてGPIまたはGPI様タンパク質に指向する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
d)工程c)で選択されるハイブリドーマを増殖し、クローニングする工程、
e)工程d)で選択されたハイブリドーマによって産生される該抗体を組合せてまたは単独でその関節炎を転移する能力について試験する工程。
従って、本発明は、このような方法によって獲得できるモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ株に関する。実施例5に示す抗体のうち、抗体2.99および6.121が好ましい(以下の図9を参照のこと)。これらの抗体は、上記の血清または抗GPI免疫グロブリンと同じ目的で使用され得る。
[免疫グロブリンがKRN関節炎を媒介する]
本発明者らは、KRN関節炎発現に必要な遺伝因子を全て保持するがBリンパ球を欠損するマウスが疾患を免れていることを以前に示した((Kouskoffら、1996)、米国特許第5.675.060号)。KRNモデルにおいて関節炎発症が特定のB細胞産物に決定的に依存する可能性を検討するために、本発明者らは、K/BxNマウス由来の血清の導入により非関節炎マウスに疾患を誘発することを試みた。激しい関節腫脹が関節炎K/BxNドナー由来の血清を注射した動物に現れたが、非関節炎BxN対照由来の血清を受けたものには現れなかった(図1A)。疾患はK/BxN血清100μl程度で誘導することができ、再現性を示した。それは非常に迅速に誘発された(血清注射後2日以内ですでに明白な、臨床的スコアまたは足関節の厚みのいずれかにより測定した)。関節炎は、関節炎ドナー由来の血清を、正常マウス、リンパ球欠損RAGO/O宿主、またはB細胞欠損K/BxNマウス(K/BxNマウス−μMTO/O)に注射して得ることができた(図1B)。これらの結果はK/BxNマウス由来の血清成分が関節炎を与えるのに十分であることを示すが、後者の動物で見られるより悪性の(agressive)疾患はK/BxN T細胞がエフェクター相において恐らく補助的な増強の役割を果たすことを示している。
[病原性免疫グロブリンの分子ターゲット]
従って、Bリンパ球により産生されるIgはK/BxNマウスにおける関節炎発症の鍵である。次いで、本発明者らは、その分子ターゲットを定めることを試みた。始め、これらが、B細胞表面上のAg7分子に反応性であるトランスジェニックT細胞の相互作用により何らかの形で産生される、関節の特定の成分に指向する抗体であるかもしれないと想像することが可能であった(これは、B細胞の自己成分に対する正常な耐性を防止するかもしれないし、またはポリクローナルB細胞刺激および自己(ことによると重合体の)成分に反応性のIgの合成を誘導するかもしれなかった)。本発明者らは、この問題に以下により取り組んだ:
1)K/BxNマウス由来Igの導入後のRAGo/oマウスの免疫組織化学的分析。これらの分析により、関節の滑膜組織だけでなく多くの他の器官(脾臓、腎臓、肝臓、筋肉;データ示さず)の内膜(lining membrane)において導入Igの堆積が示された。
2)ウエスタンブロット分析。全タンパク質抽出物をRAGo/oマウスの足関節からおよびいくつかの他の器官から調製し(抽出物におけるIgの存在を避けるために)、変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し(SDS−PAGE)、ブロットし、K/BxNマウス由来の血清でプローブした。Ig結合は、HRP結合抗マウスIgGとのプロービングにより明らかとなった。図3に見られるように、およそ分子量60kDに単一の主要なタンパク質バンドがこれらのブロット上で検出できた。このバンドは、多数のK/BxN関節炎マウス由来の血清を用いた時に繰り返し見られたが、対照非関節炎同腹仔由来の血清では見られなかった。他のタンパク質はいくつかの血清で検出されたが一貫性がなく、それらは常に60kDバンドよりも弱かった。
[抗GPI抗体は病原性免疫グロブリンである]
抗GPI抗体はK/BxN血清の病原性の特異性全てを構成し、それらの除去がその血清の病原性能力を排除し得る。この問題に取り組むために、本発明者らは、5mgの組換えGPIまたは対照GSTタンパク質(上述のように調製)をCNBr結合セファロースに結合した。プールしたK/BxNマウス由来の血清をこれらのカラムに連続して付与した。結合タンパク質を酸性pHで溶出し、未処置マウスに導入することによって試験した(出発物質およびフロースルーフラクションのアリコートも)。図7に示すように、全ての関節炎誘発活性がGPI結合カラムに結合したフラクションで見られ、フロースルーでは見られなかった(後者が免疫グロブリンの大部分を含んでいたにもかかわらず)。これらの結果は、抗GPI抗体が実際に、関節炎K/BxNマウス由来の血清中の病原性Igであり、組換えGPIタンパク質に結合し得ることを示している。
関節炎誘発性血清または免疫グロブリンとの同時投与によって可能性のある抗関節炎製剤を試験し得るモデルが、関節炎K/BxN由来の血清の導入により提供される。
K/BxNマウスの血清中に存在する免疫グロブリンが関節炎を転移することが可能であるならば、未処置のレシピエントに疾患を転移することも可能なモノクローナル抗体(mAb)を単離することが可能なはずである。30および50日齢のK/BxNマウス由来の脾細胞を、ハイブリドーマ誘導についての標準プロトコール(de StGrothおよびScheidegger、1980)に従って融合し、96ウェルプレート中限界希釈状態のHAT培地においてハイブリドーマを選択した。組換えGPIを結合抗原としてそして抗マウスIgGを発色試薬として用いて培養上清をELISAアッセイで試験することによって、GPIに反応性の免疫グロブリン産生に関してハイブリッドをスクリーニングした。増殖、限界希釈によるクローニング、およびハイブリドーマ株の安定性試験のためにいくつかポジティブなウェルを選択した。抗GPI IgGを産生する11個の安定なハイブリドーマ株をそのようにして得た(下の表1を参照)。
Claims (4)
- 関節炎がGPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体の注入によって誘導されている非ヒト関節炎動物に組成物を投与して関節炎の経過への効果を評価することによって、該組成物の抗関節炎能力を決定する方法。
- 以下の工程を包含する請求項1に記載の方法:
i)既知用量のGPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体を第一の非関節炎マウスに投与し、それにより関節炎を誘導する工程であって、該マウスはまた、GPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体の前、一緒に、もしくは後のいずれかで投与された、試験される組成物を受けている、工程、
ii)該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を検出する工程、および
iii)該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を、同一のGPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体を受けているが、該組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過と比較する工程。 - 以下の工程を包含する請求項1に記載の方法:
i)既知用量のGPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体を第一の非関節炎マウスに投与し、それにより関節炎を誘導する工程であって、該マウスはまた、GPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体の前、一緒に、もしくは後のいずれかで投与された、試験される組成物を受けている、工程、
ii)該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を検出する工程、および
iii)該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を、同一のGPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体を受けているが、該組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度と比較する工程。 - GPIまたはGPI様タンパク質に対する抗体がモノクローナル抗体またはその組合せである請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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