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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Antikörpern gegen Glucose-6-Phosphat-Isomerase-Protein zur Diagnose
von Arthritis und die Verwendung des Proteins zur Behandlung von
Arthritis.
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Rheumatoide
Arthritis (RA) ist eine häufige
und Behinderungen hervorrufende Autoimmunerkrankung (Feldmann et
al., 1996). Sie ist eine chronische, progressive Erkrankung der
Gelenke, welche durch Leukozyteninvasion der Synovialauskleidung
und Hyperplasie der darin befindlichen Synoviozyten gekennzeichnet
ist. Die daraus folgende Überproduktion
von Zytokinen und anderen löslichen
Mediatoren führt
zu Knorpelzerstörung,
Knochenerosion und ungeordneter Ummodellierung von Gelenkstrukturen.
Die Ätiologie
und Pathogenese der RA bleiben kontrovers. Es ist nicht bekannt,
ob die Erkrankung durch eine unbeschränkte Entzündungsreaktion gegen ein mikrobielles
Antigen (Ag), eine unangemessene Autoimmunantwort gegen einen Selbst-Bestandteil
oder beides initiiert wird. Es ist über eine wichtige Rolle für T-Zellen
(Panayi et al., 1992), B-Zellen (Zvaifler, 1973) und andere Leukozyten,
wie dendritische Zellen, Makrophagen und Neutrophile (Thomas und
Lipsky, 1996), gestritten und diskutiert worden. Das Fehlen eines
Konsenses spiegelt zwei Faktoren wieder. RA ist ein heterogenes
Syndrom, wobei verschiedene Patienten ein stark variierendes Alter
beim Ausbruch, stark variierende Krankheitsverläufe, genetische Profile und
Reaktionen auf therapeutische Maßnahmen zeigen. Zusätzlich hat
es einen Mangel an kleinen Tiermodellen für RA, insbesondere an jenen,
bei denen die Krankheit spontan ausbricht, gegeben.
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Unlängst haben
wir ein neues transgenes Mäusemodell
für Arthritis
erzeugt, das eine Erkrankung mit vielen der Merkmale von rheumatoider
Arthritis bei Menschen spontan entwickelt ((Kouskoff et al., 1996), U.S.-Patent
5,675,060). Alle KRN T-Zell-Rezeptor (TCR)-transgenen (tg) Mäuse mit
dem genetischen C57BI/6 × NOD-Hintergrund
(im folgenden abgekürzt
als K/B × N-Mäuse) entwickeln
eine Gelenkserkrankung, welche im Alter von drei bis vier Wochen
beginnt und sich schnell entwickelt, bis die Mobilität des Tiers
schwer beeinträchtigt
ist; wie bei Patienten verläuft
die Krankheit chronisch, progressiv, symmetrisch und weist einen
proximalen nach distalen Gradienten der Schwere auf. Die Mäuse-Erkrankung zeigt
alle der hauptsächlichen
histologischen Merkmale der humanen Erkrankung: Leukozyteninvasion,
Synovitis, Pannus-Bildung, Knorpel- und Knochenzerstörung, ungeordnete
Ummodellierung. Das Mäuse-Modell
zeigt wie die Patienten mehrere immunologische Abnormalitäten, einschließlich B-Zell-Hyperaktivität, welche
sich als eine Zunahme der Anzahl von B-Zellen, Hypergammaglobulinämie und
Autoantikörperproduktion
manifestiert.
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Bei
K/B × N-Mäusen wird
die Erkrankung durch eine kreuzreaktive Erkennung von von NOD abgeleiteten
Ag7-Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes
durch den KRN-TCR initiiert. Dementsprechend wird bei K/B × N-Tieren
eine Situation einer systemischen Autoreaktivität erzeugt, was die Frage aufwirft,
wie sich eine Gelenk-spezifische Autoimmunerkrankung in Gegenwart
von systemischer Autoreaktivität
entwickelt. Wir haben früher
darüber
berichtet, dass T-Lymphozyten für
die Entwicklung von Arthritis erforderlich sind, da ihre Blockade
von T-Lymphozyten eine Erkrankung verhindert, obwohl sie bei den
späteren
Stadien der Erkrankung verzichtbar zu sein scheinen. B-Lymphozyten sind
ebenfalls kritisch (Kouskoff et al., 1996).
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Im
Rahmen der Erfindung finden wir, dass B-Zellen für spontane Arthritis erforderlich
sind, da sie pathogene Immunglobuline produzieren, die gegen ein
Ziel gerichtet sind, welches wir als Glucose-6-phosphat-Isomerase (EC 5.3.1.9) identifizieren.
Wir zeigen, dass rekombinante Glucose-6-phosphat-Isomerase bei diagnostischen Tests von
Arthritis bei Mäusen
verwendet werden kann und verwendet werden kann, um pathogene Immunglobuline
zu adsorbieren.
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Über Autoantikörper ist
zuvor in Situationen einer induzierten Arthritis in Tiermodellen
berichtet worden, wenn eine Erkrankung durch Immunisierung mit Knorpelbestandteilen,
wie Typ II-Kollagen, induziert wird. Es war zuvor nicht festgestellt
worden, dass Antikörper
gegen ubiquitär
exprimierte Proteine arthritogen sein können.
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Autoantikörper werden
auch im Serum von RA-Patienten gefunden und haben einen gewissen
diagnostischen Wert. Rheumafaktor (RF; Ab gegen den Fc-Abschnitt
von IgG) ist als ein Kennzeichen dieser Erkrankung angesehen worden;
er fehlt jedoch bei ungefähr
30% der RA-Patienten und ist bei Individuen mit anderen Autoimmunerkrankungen
(Mannik, 1992; Rudolphi et al., 1997) oder in Situationen einer
chronischen Immunstimulation vorhanden. Abs gegen Knorpel- oder
Epidermis-Bestandteile sind bei RA-Patienten ebenfalls nachgewiesen
worden, die beispielsweise gegen Typ II-Kollagen (cII) oder Filaggrin
gerichtet sind, aber diese zeigen wieder im Allgemeinen eine begrenzte
Korrelation mit Krankheitsparametern (Rudolphi et al., 1997; Claque
und Moore, 1984; Sebbag et al., 1995). Conrad, K., et al. (Biochem.
Genet., 1987, 25 (2–10), 739–54) beschreiben
monoklonale Antikörper,
die gegen GPI gerichtet sind.
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Die
Erfindung betrifft Antikörper
gegen Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI).
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Diese
Antikörper
können
polyklonal oder monoklonal sein und die Technologien, die für deren
Herstellung verwendet werden, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannt.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des GPI-Proteins und von
Antikörpern
dagegen für
die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Arthritis
und für
die Diagnose von Arthritis in vitro.
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Erfindungsgemäße Antikörper unterscheiden
sich von den bekannten arthritogenen Antikörpern, die im Stand der Technik
beschrieben worden sind, die gegen Knorpelbestandteile, wie ein
Typ II-Kollagen,
gerichtet sind. Die Antikörper
der Erfindung sind hauptsächlich
gegen Proteine, die in vielen nicht-artikulären Geweben exprimiert werden,
aber in das Serum freigesetzt werden, gerichtet.
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Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Arthritis,
welches den Nachweis von Autoantikörpern gegen GPI-Protein in
der Probe von Plasma oder Serum eines Patienten umfasst.
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Das
Verfahren zum Testen auf das Vorhandensein oder der Menge von Antikörpern gegen
GPI-Protein, welche
in einer Probe vorhanden sind, umfasst das Binden der Proteine an
die Antikörper
in der Probe und das Nachweisen von an die Proteine gebundenen Antikörpern.
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Die
Verfahren zum Nachweis von Antikörpern
im Plasma oder Serum sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt; es können beispielsweise
ELISA- oder RIA-Tests verwendet werden. Es ist möglich, ein mit GPI beschichtetes
Substrat, beispielsweise eine Assayplatte, zu verwenden und dann
das Vorhandensein von an das GPI gebundenen Antikörpern mit
geeigneten markierten Antikörpern
nachzuweisen. Unter den Markierungen sind jene, die bevorzugt sind,
radioaktive Isotope, Verbindungen, welche ein Isotop enthalten,
Enzyme, insbesondere Enzyme, die in der Lage sind, mit Chromogenen,
Fluorogenen oder lumineszierenden Verbindungen zu reagieren (beispielsweise
eine Peroxidase oder eine alkalische Phosphatase), Chromophore,
chromogene Verbindungen, Fluorogene oder lumineszierende Verbindungen,
Basenanaloga und Liganden, wie Biotin.
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Gemäß der Erfindung
kann das GPI-Protein das natürliche
Protein selbst, ein rekombinantes Protein, synthetisches Protein
oder nur das rekombinante Epitop des Proteins sein. So betrifft
die Erfindung auch einen Kit zum Ausführen der Diagnose von Antikörpern gegen
GPI-Protein, umfassend ein diagnostisches Mittel, bestehend aus
einem Protein, welches GPI oder ein Epitop davon, welches in der
Lage ist, mit einem Autoantikörper
des Plasmas oder des Serums zu wechselwirken, ist, und einen zweiten
Antikörper,
welcher in der Lage ist, an den Autoantikörper zu binden, wobei der zweite
Antikörper
für einen
Nachweis markiert ist.
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In
einer anderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung die Verwendung von GPI-Protein, welches in der
Lage ist, mit Autoantikörpern
zu wechselwirken, um die Autoantikörper für eine Behandlung oder Verhütung von
Arthritis zu hemmen oder zu entfernen.
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Die
Erfindung betrifft auch die Expression von GPI-Protein in vivo durch
die Verwendung eines Vektors, welcher Elemente, welche für die Expression
der GPI in vivo ausreichend sind, umfasst. Der Vektor kann von viraler
Herkunft sein, kann ein Plasmid sein oder kann rein synthetische
oder nackte DNA sein, wie in VICAL technology beschrieben. Eine
Expression der Proteine wird GPI-Protein bereitstellen, um arthritogene
Antikörper
zu adsorbieren (siehe die Beispiele der Beschreibung).
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Die
Wirksamkeit von potentiellen antiarthritischen Zusammensetzungen
kann ausgewertet werden, indem die Auswirkung der Zusammensetzungen
auf bei normalen Mäusen
durch Injektion von Serum aus K/B × N-Mäusen oder von daraus abgeleiteten
Immunglobulinen oder von anti-GPI-Antikörpern induzierte Arthritis bestimmt
wird. So ausgewertete Zusammensetzungen umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf chemische Verbindungen, biologische Materialien, wie Antikörper, Polypeptide,
entzündungshemmende
Mittel, Hormone, Tolerogene, die die Bindung von anti-GPI-Antikörpern an
ihre Ziele oder die pathologischen Folgen dieser Bindung hemmen.
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Dies
kann erfolgen durch: i) Verabreichung einer bekannten Dosis von
arthritogenem Serum oder Immunglobulinen an eine erste nicht-arthritische
Maus, wobei die Maus auch die zu testende arthritogene Zusammensetzung
erhält,
die entweder vor, zusammen mit oder nach dem arthritogenen Serum
oder den Immunglobulinen verabreicht wird; ii) Nachweisen des Zeitverlaufs
der Entzündung
und Gelenkzerstörung
in der ersten Maus; und iii) Vergleichen des Zeitverlaufs der Entzündung und
Gelenkzerstörung
in der ersten Maus mit dem Zeitverlauf der Entzündung und Gelenkzerstörung in
einer zweiten Maus des gleichen Genotyps, welche das gleiche arthritogene
Serum oder die gleichen arthritogenen Immunglobuline empfangen hat,
die aber nicht der antiarthritischen Zusammensetzung ausgesetzt
worden ist.
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Eine
andere Möglichkeit
für Schritt
ii) besteht darin, das Ausmaß der
Entzündung,
Gelenkzerstörung und
Gliedmaßendeformation
in der ersten Maus nachzuweisen; und für Schritt iii), das Ausmaß der Entzündung, Gelenkzerstörung und
Gliedmaßendeformation
in der ersten Maus mit dem Ausmaß der Entzündung, Gelenkzerstörung und
Gliedmaßendeformation
in einer zweiten Maus des gleichen Genotyps, welche das gleiche
arthritogene Serum oder die gleichen arthritogenen Immunglobuline
empfangen hat, die aber nicht der antiarthritischen Zusammensetzung
ausgesetzt worden ist, zu vergleichen.
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In
diesem Verfahren können
die arthritogenen Immunglobuline monoklonale Antikörper oder
Kombinationen davon, speziell Antikörper, die nachfolgend beschrieben
werden, sein.
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Es
ist auch möglich,
Moleküle
zu testen, die in der Lage sind, die Produktion von GPI-Protein
zu modulieren, um Arthritis zu behandeln, wobei das Molekül beispielsweise
aus Antikörpern,
die nicht-pathogen sind,
bestehen kann.
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Es
ist auch möglich,
eine mit GPI-Protein beschichtete Oberfläche für die Behandlung eines Serums in
einem extrakorporalen Kreislauf, um diesem die Mengen an pathologischen
Antikörpern
zu entziehen, zu verwenden.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung
von monoklonalen Antikörpern, die
Arthritis übertragen
können,
umfassend die Schritte, die bestehen aus:
- a)
Herstellen von Hybridomen aus Lymphozyten von Splenozyten arthritischer
Säuger,
vorzugsweise aus Splenozyten von K/B × N-Mäusen,
- b) Selektieren der Hybridome unter Grenzwert-Verdünnungsbedingungen
in HAT-Medium,
- c) Durchmustern von Hybridomen, die Antikörper produzieren, welche gegen
GPI-Protein gerichtet sind, in einem ELISA-Assay,
- d) Expansion und Klonierung der bei Schritt c) selektierten
Hybridome,
- e) Testen der Antikörper,
die durch selektierte Hybridome in Schritt d) erzeugt werden, in
Kombination oder allein bezüglich
ihrer Fähigkeit,
Arthritis zu übertragen.
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Das
Testen von Schritt e) kann erzielt werden durch i): Verabreichen
einer bekannten Dosis der Antikörper
an eine normale Maus; ii) Nachweisen des Beginns von Entzündung, Gelenkzerstörung und
Gliedmaßendeformation
in der Maus.
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Es
versteht sich, dass die obigen Verfahrensschritte mit wohlbekannten
Techniken, welche zu diesem Fachgebiet gehören, erzielt werden können und
nicht auf irgendeine bestimmte Vorgehensweise beschränkt sind.
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So
ist die Erfindung auf monoklonale Antikörper, die durch ein solches
Verfahren erhalten werden können,
und auf Hybridomlinien, die diese Antikörper produzieren, gerichtet.
Unter den in Beispiel 5 geschilderten Antikörpern sind die Antikörper 2.99
und 6.121 bevorzugt (siehe 9 unten).
Diese Antikörper
können
zu den gleichen Zwecken wie das Serum oder die anti-GPI-Immunglobuline,
die oben beschrieben worden sind, verwendet werden.
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Einige
zusätzliche
Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden ersichtlich werden
aus den folgenden Beispielen, die erläutert werden unter Bezugnahme
auf die Figuren, in welchen:
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1.
Serum aus K/B × N-Mäusen kann
Arthritis übertragen.
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- A: Pfoten von normalen Mäusen, denen 72 h zuvor 150 μl Serum aus
einer arthritischen K/B × N-Maus
oder aus einem nicht-arthritischen Kontroll (Ktrl.)-Wurfgeschwistertier
injiziert worden sind. Es ist die Schwellung und Rötung bei
der Maus, der arthritisches Serum injiziert worden ist, festzustellen.
Arthritis kann durch die Messung der Fesseldicke oder Ermittlung
des klinischen Indexes (rechte Felder) objektiviert werden; der klinische
Score ist definiert als: 0, normal; 1, zweifelhaft; 2, zwei Pfoten
befallen; 3, drei Pfoten befallen; 4, alle Gliedmaßen befallen.
- B: Bei allen Empfängern
unabhängig
davon, ob transgen oder nicht, ist eine durch Serumtransfer induzierte Erkrankung
vorhanden, sie ist aber bei Empfängern,
die autoreaktive T-Zellen aufweisen, aber aufgrund eines Mangels
von B-Zellen keine Arthritis entwickeln können (K/B × N-μM%),
intensiver.
- C: Nachlassen der Arthritis, abgelesen als klinischer Index,
nach einem kurzen Verlauf einer K/B × N-Serum-Verabreichung (leere Kreise),
aber Persistenz nach wiederholter Injektion (ausgefüllte Kreise).
- D: Arthritogene Aktivität
der Serum-IgG-Fraktion. Linkes Feld: RAG%-Mäusen wurden ähnliche
Menge (bezogen auf die Ausgangsvolumina) von Serum aus arthritischen
K/B × N-Mäusen (Sterne),
von Durchfluss (Kreuze) oder der von einer Protein G-Säule eluierten
Fraktion (ausgefüllte
Kreise) injiziert. Rechtes Feld: die doppelte Menge von IgG aus
nicht-TCR-tg-Wurfgeschwistern war nicht in der Lage, Arthritis zu
induzieren.
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2. Serum
aus K/B × N-Mäusen kann
Arthritis übertragen.
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Knie-Schnitte
aus einer typischen K/B × N-Maus
(links) oder einer normalen Maus 10 Tage nach zwei Injektionen von
200 μl Serum
aus einem arthritischen K/B × N-Tier
(rechts). Es ist in beiden Fällen
die dicker gewordene Synovial-Auskleidung, die massive darunterliegende
inflammatorische Infiltration, die sich über den Knorpel ausdehnt und
mit dessen Zerstörung
beginnt, und das Vorhandensein von polymorphkernigen Zellen im Gelenkhohlraum
festzustellen. Hämatoxylin-und-Eosin-(H
+ E)-Anfärbung,
10x-Objektiv.
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3. Ein 60
kD-Protein ist das Hauptziel von K/B × N-Autoantikörpern.
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Gesamt-Proteinextrakte
(NP-40-Extraktion) aus Fessel (A), Milz (S) oder Niere (K) wurden
auf einem SDS-PAGE laufen gelassen, durch Elektroblotting transferiert
und mit Serum aus einer arthritischen K/B × N-Maus oder einem Kontroll-Wurfgeschwistertier
als Sonde inkubiert. Die Position der hervorstechenden 60 kD-Bande
ist angegeben.
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4. Das 60
kD-Protein-Ziel von K/B × N-Serum
ist Glucose-6-phosphat-Isomerase.
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Das
60 kD-Protein aus Nierenextrakten wurde auf Immunadsorbentien, die
mit K/B × N-Immunglobulinen hergestellt
worden waren, immungereinigt. Nach Verdau mit Trypsin wurden Peptide
durch HPLC gereinigt und mehrere durch automatisierten Edman-Abbau
sequenziert. Die drei erhaltenen Peptidsequenzen gehören zu Glucose-6-phosphat-Isomerase
und sind unterstrichen. Das Molekulargewicht eines vierten Peptids wurde
durch Massenspektrometrie bestimmt und fällt perfekt mit der Masse eines
tryptischen Fragments von GPI zusammen (Unterstreichung mittels
Wellenlinie), was diese Identifizierung weiter bestätigt.
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5. Arthritisches
Serum bindet rekombinante GPI.
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Es
wurde ein Western-Blot ausgeführt
wie in 3 mit der Ausnahme, dass das aufgeladene Protein in
E. coli (als ein Fusionsprotein mit GST) produzierte rekombinante
GPI war. Die Blots wurden mit Serum aus einer arthritischen K/B × N- oder
einer Kontrollmaus als Sonde inkubiert.
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6. ELISA-Assay
weist anti-GPI-Antikörper
in Seren aus arthritischen Mäusen,
nicht aber in Kontrollen nach.
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In
diesem Enzymimmunassay wurde wie oben hergestellte rekombinante
GPI verwendet, um Vertiefungen von ELISA-Platten zu beschichten.
Diese wurden verwendet, um auf anti-GPI-IgG in Seren aus arthritischen
oder Kontroll-Mäusen
zu testen. Die hier gezeigten Werte wurden mit Serumverdünnungen
von 1/16000 erhalten, aber positive Signale konnten noch mit Verdünnungen
sogar bis zu 1/1000000 erhalten werden. Die einzige negative arthritische
Maus in dem Assay war ein Tier, das an exakt dem gleichen Tag, an
dem das Serum abgenommen wurde, arthritisch geworden war.
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7.
Serum aus K/B × N-Mäusen kann
Arthritis übertragen.
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- A: Rekombinantes GPI oder rekombinantes Kontrollprotein – GST allein –, hergestellt
wie oben, wurde an einen festen Träger gebunden und als ein Immunadsorbens
verwendet, um anti-GPI-Antikörper
aus K/B × N-Serum
zu entfernen. Das gesamte anti-GPI-IgG befand sich, wie erwartet,
in der gebundenen Fraktion. Die Fähigkeit, Arthritis zu übertragen,
wurde nur in der gebundenen Fraktion gefunden und aus der Fraktion,
die durch die Säule
hindurchfloss, eliminiert.
- B: Ein repräsentatives
Experiment, in welchem normalen Mäusen verschiedene Fraktionen
aus dem in A. gezeigten Reinigungsschema injiziert wurden. Arthritis
wurde ausgewertet und hinsichtlich des Scores bewertet, wie oben.
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8. Transfer
von K/B × N-Serum
kann das therapeutische Potential einer Behandlung mit monoklonalen Antikörpern testen.
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Naiven,
4 Wochen alten Mäusen
des Stamms C57B1/6 wurden an den Tagen 0 und 3 200 μl gepooltes Serum
aus K/B × N-Mäusen injiziert.
Den Mäusen
wurde auch an den Tagen –2, –1, +1,
+5 und +8 der Test-Antikörper
BB5.1, der den C5-Komplement-Faktor blockiert, oder nur Träger injiziert.
Der Beginn der Arthritis wurde verfolgt, indem die Fesseldicke an
den folgenden Tagen gemessen wurde. Mit monoklonalem Antikörper behandelte
Mäuse waren
vor Arthritis geschützt,
während
jene, denen nur Träger
injiziert worden war, die Erkrankung aufwiesen.
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9. Monoklonale
anti-GPI-Antikörper
induzieren Arthritis, wenn sie naiven Mäusen gemeinsam injiziert werden.
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Naiven,
4 Wochen alten Mäusen
des Stamms Balb/c wurden an den Tagen 0 und 3 1 mg gereinigte IgG
aus den anti-GPI-mAbs 6.121 und 2.99, gelöst in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung,
oder 1 mg von jedem injiziert. Der Beginn der Arthritis wurde verfolgt,
indem die Fesseldicke an den folgenden Tagen gemessen wurde. Mit
den beiden monoklonalen anti-GPI-Antikörpern in Kombination behandelte
Mäuse zeigten
Arthritis, nicht aber jene, denen einer der beiden mAb allein injiziert
worden war.
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BEISPIEL 1
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Immunglobuline vermitteln
KRN-Arthritis
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Wir
haben zuvor gezeigt ((Kouskoff et al., 1996), U.S.-Pat. 5.675.060),
dass Mäuse,
die alle genetischen Elemente, die für das Auftreten von KRN-Arthritis
benötigt
werden, tragen, aber hinsichtlich B-Lymphozyten defizient sind,
frei von der Erkrankung sind. Um die Möglichkeit zu erforschen, dass
die Entwicklung von Arthritis in dem KRN-Modell in kritischer Weise
von einem bestimmten B-Zell-Produkt abhängt, versuchten wird, eine
Erkrankung in nicht-arthritischen Mäusen durch Transfer von Serum
aus K/B × N-Mäusen hervorzurufen.
Bei den Tieren, denen Serum aus arthritischen K/B × N-Spendern
injiziert worden war, traten schwere Gelenkschwellungen auf, aber
nicht bei jenen, die Serum aus nicht-arthritischen B × N-Kontrollen erhalten hatten
(1A). Eine Erkrankung konnte mit lediglich 100 μl K/B × N-Serum induziert werden
und trat reproduzierbar auf. Sie wurde sehr schnell hervorgerufen,
gemessen entweder anhand des klinischen Score oder der Fesseldicke,
und war bereits innerhalb von zwei Tagen nach der Seruminjektion
evident. Arthritis konnte nach dem Injizieren von Seren aus arthritischen
Spendern in normale Mäuse,
Lymphozyten-defiziente RAG%-Wirte oder B-Zell-defiziente K/B × N-Mäuse (K/B × N-Mäuse-μMT%) erhalten werden (1B). Diese
Ergebnisse zeigen, dass Serumbestandteile aus K/B × N-Mäusen ausreichend
sind, um Arthritis zu verleihen, obwohl die aggressivere Erkrankung,
die bei den letztgenannten Tieren festgestellt wird, anzeigt, dass
K/B × N-T-Zellen wahrscheinlich
eine zusätzliche
verstärkende
Rolle in der Effektorphase spielen.
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Die
durch Serumtransfer hervorgerufene Arthritis weist alle histologischen
Merkmale der Erkrankung bei regulären K/B × N-Mäusen auf, einschließlich einer
Invasion von Entzündungszellen,
Hyperplasie der Synoviozyten, Pannus-Bildung und Knorpelzerstörung (2A und B).
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Die
durch Seruminjektion induzierte Arthritis ist vorübergehend.
Bei Mäusen,
die ein einzelnes Paar von Injektionen erhalten hatten, begann die
Gelenkentzündung
nach ungefähr
15 Tagen abzuklingen (1C); nach 30 Tagen erschienen
einige der Gelenke relativ normal, sogar bei den Tieren, die zu
Beginn vollständig
arthritisch gewesen waren. Das Vorübergehen der Erkrankung konnte
durch wiederholte Injektionen von Serum aus arthritischen Mäusen überwunden
werden (1C). Dass dies sogar für RAG%-Empfänger
zutraf, legt nahe, dass die Instabilität der Serumverbindung die Erklärung für die vorübergehende
Natur der Erkrankung ist.
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Der
arthritogene Serumfaktor ist ein durch B-Zellen produziertes Immunglobulin
(Ig): nach einer Fraktionierung von Serum aus K/B × N-Mäusen in
IgG- und nicht-IgG-Komponenten ist nur die IgG-Fraktion in der Lage,
bei RAG%-Wirten Arthritis hervorzurufen; deren Wirkkraft ist ähnlich zu
jener von vollständigem
Serum (bezogen auf das Ausgangsvolumen) (1D), wie
dies die histologischen Merkmale der Erkrankung, die diese induzierte,
sind (Daten nicht gezeigt).
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BEISPIEL 2
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Molekulares Ziel der pathogenen
Immunglobuline
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Dementsprechend
ist ein durch B-Lymphozyten produziertes Ig entscheidend für die Entwicklung
von Arthritis in K/B × N-Mäusen. Wir
haben dann versucht, deren molekulare Ziele zu definieren. Zu Beginn
könnte man
sich vorgestellt haben, dass diese gegen spezielle Komponenten der
Gelenke gerichtete Antikörper
sein könnten,
die auf irgendeine Weise durch die Wechselwirkung von transgenen
T-Zellen mit Reaktivität
gegenüber
dem Ag7-Molekül
auf der Oberfläche
von B-Zellen erzeugt worden sind; dies könnte die normale Toleranz von
B-Zellen gegenüber
Selbst-Bestandteilen verhindern oder eine polyklonale B-Zell-Stimulierung
und die Synthese von gegen (vielleicht polymere) Selbst-Bestandteile
reaktiven Ig induzieren. Wir haben uns dieser Frage angenommen:
- 1) durch immunhistochemische Analyse von RAG%-Mäusen nach
Transfer von Ig aus K/B × N-Mäusen. Diese
Analysen zeigten eine Ablagerung von transferierten Ig nicht nur
in dem Synovialgewebe der Gelenke, sondern auch in auskleidenden
Membranen von vielen anderen Organen (Milz, Niere, Leber, Muskel; Daten
nicht gezeigt).
- 2) durch Western-Blot-Analyse: Gesamtproteinextrakte wurden
aus dem Fesselgelenk und aus mehreren anderen Organen von RAG%-Mäusen
(um das Vorhandensein von Ig in dem Extrakt zu vermeiden) hergestellt,
einer Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE)
unterworfen, geblottet und mit Serum aus K/B × N-Mäusen als Sonde inkubiert. Die
IgG-Bindung wurde sichtbar gemacht durch Inkubation mit HRP-konjugiertem
anti-Maus-IgG als Sonde. Wie auf 3 ersehen
werden kann, konnte eine einzelne vorherrschende Proteinbande auf
diesen Blots bei ungefähr
60 kD MW nachgewiesen werden. Diese Bande wurde wiederholt festgestellt,
wenn Seren aus einer Anzahl von arthritischen K/B × N-Mäusen verwendet
wurden, aber nicht bei Seren von nicht-arthritischen Kontroll-Wurtgeschwistertieren. Es
wurden mit einigen der Seren andere Proteine nachgewiesen, aber
inkonsistent und sie waren stets schwächer als die 60 kD-Bande.
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Wir
haben dann versucht, dieses 60 kD-Protein zu identifizieren. Zu
diesem Zweck wurde IgG aus einem großen Pool von K/B × N-Seren
durch Affinitätschromatographie
an ProteinG-Säulen
gereinigt. Dieses gereinigte Ig (1,5 mg) wurde kovalent an CNBr-aktivierte
Sepharose gebunden. Diese Matrix wurde dann als ein Immunadsorbens
verwendet, auf welches 50 mg NP-40-Extrakt aus Nieren von RAG%-Mäusen
aufgeladen wurden. Die Säule
wurde umfassend gewaschen und gebundene Proteine bei saurem pH eluiert.
Sie wurden durch SDS-PAGE und Coomassie-Anfärbung analysiert. Wie aufgrund
der oben beschriebenen Ergebnisse erwartet, wurde eine dominante
Bande von 60 kD festgestellt. Diese Bande wurde ausgeschnitten,
das Protein in der Gelscheibe durch Trypsin verdaut, wie in (Rosenfeld
et al., 1992) beschrieben, und die resultierenden Peptide durch
Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt. Es wurden mehrere Peptide identifiziert.
Drei von diesen wurden dann durch automatisierten Edman-Abbau an
einem Applied Biosystems 470A-Instrument sequenziert. Die Sequenzen
wurden mit öffentlichen
Datenbanken unter Verwendung des BLAST-Programms an der Swissprot-Datenbank
verglichen. Es wurde festgestellt, dass alle drei zu dem Protein
Glucose-6-phosphat-Isomerase (aka Phosphohexose-Isomerase; EC 5.3.1.9; Swissprot-Datenbank-Nr.
P06745; Sequenz-Aufnahmenummer 1230741; im Folgenden abgekürzt als
GPI) gehören.
Ihre Positionen sind in 4 gezeigt. Es wurde auch auf
der Grundlage einer Massenspektrometrie-Analyse, welche genau mit
dem aus der Sequenz vorhergesagten Molekulargewicht übereinstimmte,
festgestellt, dass ein anderes der erhaltenen Peptide zu GPI gehörte (4).
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Das
Molekulargewicht von GPI (62636 kD) stimmt innerhalb der Genauigkeit
der MW-Abschätzung durch
PAGE sehr stark überein
mit dem aus den Western-Blots vorhergesagten MW des Ziels des K/B × N-Serums.
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GPI
ist ein essentielles Enzym des Glycolyseweges. Es ist ein Enzym,
das in im Wesentlichen allen Geweben, ob normalen Geweben oder Tumorgeweben,
mit gewissen quantitativen Schwankungen ab den frühesten Stadien
der Embryogenese bis spät
im Leben der Tiere exprimiert wird (West et al., 1990; Hallbook
et al., 1989; Warner et al., 1985). Es ist normalerweise ein zytoplasmatisches
Enzym, aber lösliches
GPI kann im Serum gefunden werden; es wird bei Tumorpatienten (verschiedene
Organe) mengenmäßig erhöht gefunden, aber
nicht in einer Weise, die dieses zu einem verlässlichen Marker machen (siehe
beispielsweise (Neri et al., 1983; Schwemmer et al., 1985; Paulick
et al., 1987; Gomm et al., 1988; Gurney et al., 1986)). GPI ist
auch unabhängig
als „Neuroleukin", „Maturation
factor" oder „Autocrine
Motility Factor",
sekretierten Faktoren von oftmals begrenzter Wirkkraft als neurotrophes
Mittel, oder als die Zellwanderung oder Tumorzelldifferenzierung fördernde
Mittel gereinigt worden (Gurney et al., 1986; Faik et al., 1988;
Niinaka et al., 1998; Xu et al., 1996). Genetische Defizienzen bei
GPI führen
zu hämolytischen
Anämiesyndromen
(siehe beispielsweise (Kanno et al., 1996; Baronciani et al, 1996)).
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Um
zu bestätigen,
dass GPI das Protein ist, das durch die in K/B × N-Serum vorhandenen Igs erkannt wird,
produzierten wir in E. coli rekombinantes GPI. Die kodierende Sequenz
von Mäuse-GPI
wurde durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert und das Produkt
in das Plasmid pGEx-4T-3 (Pharmacia) kloniert. Das rekombinante
Protein, ein Fusionsprodukt mit Glutathion-S-transferase, wurde
durch Affinitätschromatographie
an einer Glutathion-Sepharose-4B-Säule gereinigt. Das Produkt
wurde auf SDS-PAGE charakterisiert und zeigte die erwartete Größe (Daten
nicht gezeigt). Das Gel wurde geblottet und Streifen wurden mit
Seren aus K/B × N-
oder nicht-transgenen Wurfgeschwister-Kontrollen als Sonden inkubiert.
Wie in 5 ersehen werden kann, reagierten alle K/B × N-Seren
stark, während
Kontrollseren negativ waren, was bestätigt, dass das GPI-Protein
das molekulare Ziel von anti-60 kD-Antikörpern in K/B × N-Serum
ist.
-
Das
rekombinante Protein wurde auch in Enzymimmunassays (ELISA) verwendet,
um Reaktivität
gegen GPI in Seren von K/B × N-Mäusen unterschiedlichen
Alters nachzuweisen. Wie zuvor beschrieben (Kouskoff et al., 1996),
tritt KRN-Arthritis in einem Alter von 28–32 Tagen auf. Wie in 6 gezeigt,
wies der Assay signifikante Reaktivität oberhalb des Hintergrunds
bis zu Verdünnungen
von 1/20000 in Seren aus K/B × N-Mäusen nach.
Bei Kontroll-Wurfgeschwistertieren wurde keine derartige Reaktivität festgestellt.
Der Assay kann folglich als ein guter diagnostischer Test für Arthritis
bei diesen Mäusen
dienen.
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BEISPIEL 3
-
Anti-GPI-Antikörper sind
die pathogenen Immunglobuline
-
Bilden
anti-GPI-Antikörper
die gesamten pathogenen Spezifitäten
von K/B × N-Serum
und kann ihre Entfernung das pathogene Potential des Serums eliminieren.
Um diese Frage anzusprechen, koppelten wir 5 mg rekombinantes GPI
oder Kontroll-GST-Protein, hergestellt wie oben, an CNBr-konjugierte Sepharose.
Gepoolte Seren aus K/B × N-Mäusen wurden
nacheinander auf diese Säulen
aufgetragen. Die gebundenen Proteine wurden bei saurem pH eluiert
und durch Transfer in naive Mäuse
zusammen mit einem Aliquot des Ausgangsmaterials und von Durchflussfraktionen
getestet. Wie in 7 gezeigt, wurde
die gesamte arthritogene Aktivität
in der an die GPI-konjugierte Säule
gebundenen Fraktion und keine in dem Durchfluss, sogar obwohl der
Letztgenannte die Hauptmenge des Immunglobulins enthielt, gefunden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass anti-GPI-Antikörper tatsächlich das pathogene Ig im
Serum von arthritischen K/B × N-Mäusen ist
und dass es mit rekombinantem GPI-Protein adsorbiert werden kann.
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Aus
diesen Daten schließen
wir, dass in den transgenen Mäusen
produzierte anti-GPI-Antikörper
Arthritis hervorrufen. Wir haben festgestellt (unveröffentlichte
Daten), dass T-Zellen, die den KRN- Rezeptor exprimieren, durch Antigen-präsentierende
Zellen, die gegenüber
dem GPI-Antigen exponiert worden waren, spezifisch stimuliert werden.
Diese T-Zellen stimulieren wiederum anti-GPI-Immunglobulin produzierende B-Zellen,
welche GPI effektiv internalisieren und dementsprechend Hilfe von
T-Zellen leichter als nicht-spezifische B-Zellen erhalten (Lanzavecchia,
1985). Es wird folglich vorgeschlagen, dass selbstreaktive T-Zellen
gegen GPI oder verwandte zirkulierende Proteine, die in begrenzten
Mengen im Blutkreislauf vorhanden und dementsprechend nicht in der
Lage sind, eine hemmende Toleranz des Immunsystems zu induzieren, ähnliche arthritogene
Antikörper
unter humanen Bedingungen, wie RA, induzieren könnten.
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BEISPIEL 4
-
Der
Transfer von Serum aus arthritischen K/B × N bietet ein Modell, in welchem
potentielle antiarthritische Formulierungen durch gleichzeitige
Verabreichung mit dem arthritogenen Serum oder den arthritogenen Immunglobulinen
getestet werden können.
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Als
ein Beweis des Prinzips haben wir die Fähigkeit des monoklonalen anti-C5-Antikörpers, mit
der Arthritogenese in dem K/B × N-Modell
zu interferieren, getestet. Wir wählten dieses Reagens aufgrund
von früheren
Beweisen, welche Komplementkomponenten und insbesondere C5 mit der
Erzeugung von Gelenkläsionen
in anderen Mäuse-Modellen
von Arthritis und bei humanen RA-Patienten in Verbindung brachten
(Watson et al. 1987; Wang et al., 1995). Mäusen wurde arthritogenes Serum
aus K/B × N-Mäusen und
zum gleichen Zeitpunkt der monoklonale anti-C5-Antikörper BB5.1,
von dem bekannt ist, dass er C5-Aktivität blockiert
(Frei et al., 1987), injiziert. Wie aus 8 ersehen
werden kann, waren Mäuse,
denen der monoklonale anti-C5-Antikörper injiziert worden war,
vor der Erkrankung geschützt.
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BEISPIEL 5
-
Wenn
in dem Serum von K/B × N-Mäusen vorhandene
Immunglobuline in der Lage sind, Arthritis zu übertragen, sollte es möglich sein,
monoklonale Antikörper
(mAbs) zu isolieren, die ebenfalls in der Lage sind, die Erkrankung
auf naive Empfänger
zu übertragen.
Splenozyten aus 30 und 50 Tage alten K/B × N-Mäusen wurden gemäß Standardprotokollen
für die
Ableitung von Hybridomen (de St. Groth und Scheidegger, 1980) fusioniert
und Hybridome in HAT-Medium unter Grenzwert-Verdünnungs-Bedingungen in Platten mit 96 Vertiefungen
selektiert. Hybride wurden hinsichtlich der Produktion von gegenüber GPI
reaktiven Immunglobulinen durchmustert (gescreent), indem Kulturüberstände in einem
ELISA-Assay mit rekombinantem GPI als ein gebundenes Antigen und
anti-Mäuse-IgG
als ein Entwicklungsmittel getestet wurden. Mehrere positive Vertiefungen
wurden für
eine Expansion, Klonierung durch Grenzwert-Verdünnung und Testung auf Stabilität der Hybridomlinien
ausgewählt.
So wurden elf stabile Hybridomlinien, die anti-GPI-IgG produzieren,
erhalten (siehe Tabelle 1 unten).
-
Tabelle
1: Monoklonale anti-GPI-Antikörper
-
-
Die
Fähigkeit
dieser monoklonalen Antikörper,
die Erkrankung zu übertragen,
wurde durch Protein-G-Reinigung
von mg-Mengen des durch diese Hybridome produzierten IgG und intravenöse Injektion
in naive Balb/c-Empfängertiere
getestet. Wie in 9 ersehen werden kann, rief
die gekoppelte Injektion von anti-GPI-Immunglobulin aus den 6.121-
und 2.99-Hybridomzellen eine Arthritis in den Empfängern hervor,
aber keiner der Antikörper
war in der Lage, die Krankheit zu induzieren, wenn er allein injiziert
wurde. Unter diesen Antikörpern
funktionieren einige, wie die 2.99- und 6.121-Antikörper, während andere
dies nicht tun. Jedoch ermöglicht
der Schritt e) des Verfahrens zur Isolierung von Antikörpern, welche
in der Lage sind, Arthritis zu übertragen,
gemäß der Erfindung,
die Funktionierenden zu selektieren.
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