WO2005112985A2 - Mittel und verfahren zur diagnose, prophylaxe und therapie von bindegewebserkrankungen - Google Patents

Mittel und verfahren zur diagnose, prophylaxe und therapie von bindegewebserkrankungen Download PDF

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WO2005112985A2
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Wolfgang Lorenz
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders

Definitions

  • the present invention relates to compositions, pharmaceutical preparations containing them and test kits for the diagnosis of connective tissue diseases; this also includes the connective tissue in parenchymatous organs and vascular structures. Furthermore, the present invention relates to the diagnosis, prophylaxis and or treatment of connective tissue diseases using the composition. Suitable specific binding partners of the composition are also provided for diagnosis and prophylaxis / therapy.
  • rheumatoid factors play an important role, the term rheumatoid factor being a historical term.
  • rheumatoid factors are autoantibodies against gamma globulins, whereby the analysis of the respective rheumatoid factor IgG, IgM and Ig As is of different clinical relevance. They are predominantly anti-isotypic immunoglobulins, i.e. antibodies directed against the constant regions (Fc) of immunoglobulin molecules.
  • RF-IgM is relevant for rheumatoid arthritis, SLE, Sjögren's syndrome, MCTD and other clinical pictures. Accordingly, these parameters are also not specific for rheumatoid diseases.
  • the RF-IgA value is important in clinically noticeable patients with negative RF-IgM.
  • RF-IgG plays a pathophysiological role in later stages of the disease.
  • rheumatoid factors play a role pathogenetically, especially in the expression of extracellular manifestations of rheumatoid arthritis.
  • patients with rheumatoid vasculitis usually have higher rheumatoid factor titers than patients with only articular manifestations.
  • Immune complexes consisting of rheumatoid factors and IgG molecules in the cell walls of pulmonary vessels as well as in the alveoli were also detected in lung manifestations.
  • inflammation values such as CRP
  • the blood count are used to assess disease activity and the determination of uric acid in connection with gout.
  • Rheumatic diseases have a better chance of treatment if they are diagnosed early and clearly.
  • a number of different treatment options for the therapy of rheumatoid arthritis are available. Not every joint inflammation is equally quick and the same aggressive. The therapy must therefore be tailored to the individual patient. Targeted and especially early treatment is of great importance for the success of treatment.
  • Rheumatological research has shown that treatment of diseases with a severe course is particularly successful within the first few years and can stop irreparable joint disorders.
  • Diagnostics that provide indications of a possible cause of the diseases, which may can be avoided or reduced by metaphylaxis / secondary prevention, is therefore of primary importance. This is where the pathogenetic concept based on the requirements of the substances and processes to be protected comes into play.
  • the collagenous tissue is generally built up in the following steps:
  • Fiber-forming cells such as fibrocytes, chondrocytes, osteocytes, reticular cells and other cells specialized thereon, produce connective tissue structures through exocytosis of trihelical, rope-like fiber proteins or their precursors.
  • the synthesis process is shown below using the example of chondrocytes and their specific products, but can be transferred to other fiber-forming cells, taking into account the respective variabilities of the various known collagens.
  • a 15 to 50 amino acid (AS) long N-terminal section which is used later to form the N -terminal propeptide.
  • AS amino acid
  • This section has a higher variability among the different collagens and is rich in the amino acids cysteine, resp. in the cystine form Cys-SS-Cys for loops and pocket-forming longitudinal crosslinks, especially for the collagen I - III, which make up a large part of the total mass of all Fase ⁇ roteeine.
  • this section again contains a high proportion of cysteine / cystine
  • there is a special motif of two resp. three cysteine AS close to each other for example, the sequence GlyProCysCysGly) at the (N-terminal) end of the C-propeptide - i.e. close to the transition point between telopeptide and C-terminal propeptide - characteristic and of great importance:
  • the cross-linking of the three AS chains begins here.
  • the three individual cardelas begin to strand at this point through the formation of covalent ones Cys-SS-Cys bindings of the cardels with each other, with double or triple cross-links.
  • the formation and localization of this structure called "cystine knot" is precisely determined from the primary structure of the AS chains of the individual cardels.
  • the cystine node is the evolutionary solution for the task of fixing the relative displaceability of the three cardels in the longitudinal axis to one another. As a result, the three cardels can wrap around each other. This stranding runs spontaneously from the cystine node towards the N-terminal end (and to a small extent also into the C-terminal propeptide). It is only possible due to the uniform repetitiveness of the Gly-X-Y groups, which come together in a rigid, staggered grid of the cardels. This grid synchronization runs through the entire middle rope section, which thus forms the telopeptide, right down to the N-terminal section, which is initially stranded, but then presents itself as an untwisted end due to the dissolution of the repetitiveness. Even if the three arms of the section - now called the N-terminal propeptide - remain free, the spatial structure of the amino acids lying on these arms with the binding epitopes emanating from them is fixed.
  • the cystine knot realized on the C-terminal propeptide thus has a remote effect on the spatial structure of the opposite end, the free cardiac arms of the N-terminal propeptide.
  • This raster synchronization of the free ends of the propeptides, which is forced by the cystine node, is retained even if the propeptides are cut off from procollagen to tropocollagen in the course of processing, at least as long as the cut of the responsible endopeptidases (metalloproteinases) occurs at the physiologically correct location.
  • stranded procollagen fiber pieces with a length of approx. 300 nm are transported to the cell surface and further processed there.
  • MMP matrix metalloproteinase enzymes
  • propeptides the above-mentioned ends of the procollagen fibers, which are referred to as propeptides, are separated and the respective “cut” fiber piece is released into the matrix as tropocollagen.
  • the fiber piece conditioned in this way is then specifically incorporated into the respective collagen tissue (linear, grid-shaped, net-like, felt-like, etc.).
  • Inflammatory or degenerative diseases of the connective tissue structures formed from Fase ⁇ roteins whether they represent their own organs, such as ligaments, tendons, joints, fascia, etc., or that they serve as scaffolding structures in parenchymatous organs, can be divided into different groups.
  • rheumatoid diseases there are no autoantibodies typical of an autoimmune disease; Primarily inflammatory and painful symptoms with no recognizable background dominate the clinic. The primary cause of these diseases is unknown; After a recurrent course, you can move to the above Full frame of a rheumatic disease so that it is disputed in the literature whether the latter diseases may only be preliminary stages of the former. It is not known which additional complications must occur in order for a rheumatoid disease to develop into the full picture of a rheumatic autoimmune disease. In any case, a longer and progressive course is to be regarded as an unfavorable requirement.
  • the present invention was therefore based on the object of specifying new means and methods for the diagnosis, prophylaxis and therapy of connective tissue diseases and diseases of the musculoskeletal system.
  • composition comprising: i) at least one substance capable of binding to a PAMP receptor; and ii) at least one trihelical Fase ⁇ rotein, a fragment or a variant thereof.
  • PAMP receptors comprise receptors of the innate immune system that recognize typical molecular structures for parasites, especially microorganisms.
  • PAMP receptor pathogen-associated molecular patterns
  • PRR pattern recognition receptor
  • PAMP receptors include toll-like receptors.
  • the expression also includes non-toll-like, cell membrane-based PAMP receptors such as phagocytic receptors.
  • the scavenger receptors, in particular SR-A and MARCO, the macrophage mannose receptor, the B-glucan receptor and peptidoglycan recognition proteins (PGRP) may be mentioned here as examples.
  • the expression also includes intracellular PAMP receptors such as protein kinase R, oligoadenylate synthase and molecules of the NOD family.
  • intracellular PAMP receptors such as protein kinase R, oligoadenylate synthase and molecules of the NOD family.
  • soluble PAMP receptors includes pentraxins such as e.g. CRP, serum amyloid A, collectine, lipid transferases such as the lipid-binding protein (LBP) and soluble variants of the aforementioned PGRP are mentioned.
  • the PAMP receptors are preferably of human origin.
  • the amino acid sequences are available from the generally accessible sequence databases such as Genbank and SwissProt.
  • scavenger receptors There are cellular PAMP receptors that are dissolved in body fluids. Cellular receptors either serve for signal transduction into the cell, eg CD-14 receptor, or have no known intracellular signal connection for triggering a reaction. The same applies to soluble forms of PAMP ligands that have no direct contact with cells.
  • the function of the receptors without intracellular signal transduction connection consists in the binding of vagabonding MO or fragments of MO; accordingly, they are referred to as scavenger receptors.
  • “Scavenger receptor” ( SR) here included SR-A including SR-A I and SR-A II, and MARCO. Furthermore, SR includes SR-A-like SR.
  • SR-CLI SR with C- Type lectin I
  • SR-CLII SR with C- Type lectin I
  • CL-Pl collectin from placenta receptor I
  • LOX-I lectin-like oxidized LDL receptor I
  • dSR-CI Densophila SR-CI Scavenger receptor SR-A, in particular SR-AI.
  • Peiser et al. In Current Opinion in Immunology 2002, 14: 123-128.
  • PAMPs include bacterial and mycobacterial PAMPs and PAMPs derived from fungi
  • PAMP derived from fungi are, for example, fungus-specific peptidoglycans.
  • PAMP derived from mycobacteria are mycolic acid and mycolic acid ester.
  • lipoteichoic acid lipopolysaccharide (LPS)
  • bacterial DNA bacterial cell fragments
  • SR which is a PAMP receptor
  • the PAMP receptor preferably SR for the binding assay -AI is.
  • the term “trihelical phase phrotein” encompasses collagen, procollagen, tropocollagen, elastin, fibrillin, fibronectin, scavenger receptors and other collagen-like constituents.
  • the expression includes the synthesis precursors of the aforementioned.
  • collagens are initially referred to as After the hydroxylation of L-proline and L-lysine residues and after glycosylation in the endoplasmic reticulum or in the Golgi apparatus, where they come together to form three chains, they are excreted into the extracellular space At the ends of the chains, so-called propeptides or those separated at a non-typical interface are split off, and the tropocollagen is formed, which assembles into fibrils by oxidation of amino groups in the L-lysine side chains to form aldehyde groups and their aldol and aldimine formation with aldehyde or amino groups of adjacent chains these are linked together. (Networking).
  • fragments insofar as they are proteins, preferably means fragments with a minimum length of 10, particularly preferably 20, amino acids. If they are nucleic acids, the fragments have at least 20 nucleotides, preferably 50 nucleotides.
  • variants basically encompasses all modifications of a given sequence, muteins which differ at the amino acid level by addition, substitution, deletion, insertion or inversion of at least one amino acid from the given peptide sequence being preferred.
  • the mutation particularly preferably comprises 1 to 5 amino acids , in particular 1 to 3 amino acids.
  • conjugates encompasses di-, oligo-, and polymerizations, whereby both homo- and hetero-di-, oligo-, and polymerizations are encompassed.
  • the coupling here can be carried out on a carrier molecule, such as, for example, polyethylene glycol or others Carrier molecules known in the prior art are
  • carrier molecules such as, for example, polyethylene glycol or others
  • conjugates also includes naturally occurring conjugates, such as, for example, post-translational modifications, such as, for example, hydroxylations of the side chain.
  • Lipopolysaccharides contain a very strictly preserved amino sugar-2-X-phosphate-lipid complex called Lipid (A), which is the actual membrane part.
  • Lipid (A) constituting the bacterial membrane is followed by an area essentially consisting of specific sugar with sometimes other phosphates as core antigen (Core A).
  • the core antigen is followed by the very variable and very differently long sugar chains, called surface antigen (Surface-A), which can differ greatly from bacterial species, but also within one species from strain to strain.
  • surface antigen surface antigen
  • the present invention is based on the following surprising findings by the inventors:
  • LPS or endotoxins as noxae i.e. as a pathogenic cause for connective tissue diseases of patients who were in buildings with microbial infestation. It is therefore possible for the first time to differentiate between a microbial-related connective tissue disease and a non-microbial-related connective tissue disease.
  • the diagnostic approach of the methods in question is the detection of a reduced repair and regeneration capacity for fibrillar structures by an exogenous noxa (PAMP, definition see below).
  • PAMP receptors especially scavenger receptors
  • scavenger receptors are among other things the binding of endotoxins for removal from the bloodstream.
  • LPS-binding epitopes of the scavenger receptors have a high degree of homology to analog structures at the ends of the procollagen molecules.
  • the spatial structures of SR-AI and SR-AII and procollagen are shown schematically in Figures 1 and 2.
  • the N- and / or C-terminal propeptides in various fragmentation lengths possibly including some or all of the length of the telopeptide or modifications of these structures, are suitable as near-natural and thus low-antigenic ligands.
  • the systemic cleaning system is overloaded with PAMP's, which is provided by scavenger receptors, e.g. in the case of septic infections, antibiotic therapy with bactericidal antibiotics, or as in the present case due to exogenous endotoxin contamination, the PAMPs, especially LPS, are circulated and these can bind to the next comparatively avoid structure.
  • PAMP's which is provided by scavenger receptors
  • scavenger receptors e.g. in the case of septic infections, antibiotic therapy with bactericidal antibiotics, or as in the present case due to exogenous endotoxin contamination
  • Fig. 1 shows the spatial structures of SR-AI and SR-AII.
  • Fig. 2 shows the spatial structure of procollagen.
  • the invention thus relates to a composition
  • a composition comprising: i) at least one substance capable of binding to a PAMP receptor; and ii) at least one trihelical Fase ⁇ rotein, a fragment or a variant thereof.
  • LPS lipopolysaccharide
  • LTA lipoteichoic acid
  • PGN wall-specific proteoglycans
  • CpG non-
  • Fragments, variants or conjugates of the substance capable of binding to a PAMP receptor are also preferred, the fragments, variants or conjugates thereof, at least 50% of the binding capacity of LPS from E. coli to the scavenger receptor SR-A I. Die Binding of the LPS to the scavenger receptor is determined as described above.
  • the fragments, variants or conjugates particularly preferably have a binding capacity of at least 80%, in particular at least 90%, of the binding ability of LPS to the scavenger receptor.
  • the substance capable of binding to a PAMP receptor is particularly preferably a lipolysaccharide (LPS), fragments or variants thereof, the fragments or variants having a phosphorylated N-acetylglucosamine dimer, preferably containing a complete lipid A complex.
  • LPS lipolysaccharide
  • A mediates the binding of LPS to the macrophage receptor via this structural element to the CD14 receptor LBP complex.
  • the lipopolysaccharide is preferably the lipopolysaccharide of the genera e.g. Salmonella, Shigella, E. coli, Pseudomonas, Neisseria, Klebsieila and Haemophilus.
  • the PAMPs derived from microorganisms originate from bacteria of the order Actinomycetales and fungi of the genera Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Eurotium, Penicillium, Wallemia, Chaetomium, Mucor, or Scopulariopsis.
  • the trihelical Fase ⁇ rotein (component (ii) of the composition) is selected from collagen, procollagen, tropocollagen, elastin, fibrillin, fibronectin, scavenger receptors or other collagen components, synthesis precursors, fragments, variants or conjugates of the above components.
  • the collagen comprises types I to XIV, with types I, II, III, V and IX being preferred.
  • Elastin is the main component of the elastic fibers of the connective tissue, especially in organs with high elasticity, such as blood vessels, lungs, skin, tendons and uterus. Elastin differs from similar collagens in its higher valine and leucine content, its lower arginine and hydroxyproline content and its lack of lysine residues.
  • the above proteins are preferably of human origin, however animal proteins are also included in the invention.
  • the trihelical phase phrotein is preferably procollagen, fragments or variants thereof.
  • the fragments or variants of procollagen preferably have at least 50%, particularly preferably at least 80%, in particular at least 90% of the binding capacity of human procollagen to LPS from E. coli.
  • the binding ability can be carried out using a generally known binding assay.
  • the variants of procollagen are preferably at least 60% homologous, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, in particular at least 95% homologous at the amino acid level to human procollagen.
  • the homology can be determined using standard programs known to those skilled in the art (e.g. FASTA, BLAST) using standard settings.
  • the procollagen fragment preferably has at least 10, particularly preferably 20, in particular 50, amino acids of procollagen.
  • the variant of procollagen is preferably a mutein which differs from procollagen by the addition, substitution, deletion, insertion or inversion of at least one amino acid.
  • the mutations preferably comprise 1 to 5 amino acids, in particular 1 to 3 amino acids.
  • the substitution is particularly preferably a conservative substitution in which an amino acid is replaced by another amino acid which belongs to the same physico-chemical group.
  • fragments and variants can be produced by chemical methods or recombinantly.
  • Procollagen has a stranding of the three peptide chains about 10 to 30 amino acid residues before the end. The point of transition from the stranded structure to the free poor is of particular importance. At this transition point a very distinctive amino acid motif for covalent bonds is responsible.
  • a structure is formed in which each chain with each chain is bonded to one another via Cys-SS-Cys. This coordination structure made of cysteine building blocks is called a cysteine node.
  • the trihelical phase phrotein, the fragment or the variant thereof therefore preferably comprises a sequence suitable for forming a cysteine node, so as to provide binding sites for the binding of the substance which is capable of binding to a PAMP receptor.
  • the sequence suitable for forming a cysteine node is preferably the sequence GlyProCysCysGly (SEQ ID NO: 1).
  • the fragment or variant of the trihelical Fase ⁇ roteins therefore has the N- and / or C-terminal end of a trihelical Fase ⁇ roteins and optionally a part of the telomer.
  • the substance capable of binding to a PAMP receptor is a lipopolysaccharide and the trihelical fiber protein is collagen, procollagen or tropocollagen, preferably procollagen, fragments or variants thereof.
  • the composition further contains chondrocytes, fibrocytes, osteocytes, reticulo-endothelial cells, endothelial cells and / or components thereof.
  • the aforementioned cells are capable of producing collagen. Chondrocytes and their components are preferred.
  • Preferred components are the cell membrane or fragments thereof.
  • the cell nucleus, Golgi apparatus, endoplasmic reticulum and mitochondria can be components of the cells.
  • components (i) and (ii) can be linked to one another non-covalently or covalently. If not already present, components (i) and (ii) of the composition can be covalently bound by crosslinking using known methods, such as e.g. can be achieved by carbodiimides.
  • composition Preparation of the composition according to the invention specified, the method comprising contacting component (i) with component (ii) and optionally cleaning and isolating the composition.
  • compo Component (i) and component (ii) can be used both in the naturally occurring form and can also be produced synthetically. Synthetic methods for this are known to the person skilled in the art.
  • the components can be brought into contact in liquid form or one of the two components can be bound to a carrier.
  • Methods for purifying or isolating the composition include centrifugation, gradient fractionation, chromatographic methods, one- or two-dimensional gel electrophoresis.
  • the method is carried out as in vz ' tro method, which comprises the steps: a) providing a bacterial or fungal eluate containing a component (i); b) providing a growth-stimulated chondrocyte culture; c) bringing the bacterial or fungal eluate into contact with the chondrocyte culture; and d) optionally purifying the composition.
  • the mushroom eluate is preferably an eluate obtained from Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Eurotium, Penicillium, Wallemia, Chaetomium, Mucor or Scopulariopsis.
  • the bacterial eluate is preferably an eluate obtained from Actonomycetales, Salmonella, Shigella, E. coli, Pseudomonas, Neisseria, Klebsieila, and Haemophilus.
  • a growth-stimulated chondrocyte culture is preferably as described by Shakibaei et al., Biochem. J. (1999), 342, 615-623.
  • the knot tissue is mechanically crushed, incubated and cleaned in Ham's F-12 medium.
  • the chondrocytes are then suspended in growth medium.
  • the growth medium consists of Ham's F-12 and Dulbecco's modified medium according to Eagle (50%: 50%). 10% fetal calf slurry, 25 ⁇ g / ml ascorbic acid and 50 ⁇ g / ml gentamicin are added to this medium.
  • the purification can include methods known to those skilled in the art, chromatographic methods, centrifugation, ultrafiltration and gel electrophoresis.
  • a preferred embodiment for the production consists in coupling the component (i) to a column matrix and subsequently passing a detergent-lysed chrondrocyte lysate over this column prepared in this way. After incubation of the chondrocyte lysate with the coupled component (i), the composition can subsequently be eluted after washing the column.
  • the elution conditions should preferably be chosen so that the composition does not denature.
  • a pharmaceutical composition which contains the composition set out above and at least one pharmacologically acceptable carrier.
  • Pharmacologically acceptable carriers are known to the person skilled in the field of galenics.
  • the pharmaceutical compositions are preferably suitable as a vaccine in order to elicit an immune reaction of the person against at least one component of the composition for prophylaxis against the development of an autoimmune reaction.
  • the vaccine formulation may further contain suitable carrier molecules in the prior art in order to increase the immunogenicity of the composition.
  • the vaccine formulation can preferably be administered subcutaneously, intravenously or intramuscularly.
  • the pharmaceutical composition may generally be in liquid form or in the form of an aerosol with the appropriate use of aerosol stabilizing compounds.
  • connective tissue diseases include diseases of the musculoskeletal system, but also of other diseases known to be associated with connective tissue, such as, for example, vasculitis. den, glomerulonephritis, endocarditis (with and without valve involvement), dermatitis and dermatomyositis.
  • the connective tissue diseases are preferably selected from arthrosis, soft tissue rheumatism, fibromyalgia, rheumatic diseases or rheumatic autoimmune reactions.
  • a test kit for the diagnosis of connective tissue diseases which contains the composition according to the invention.
  • the test kit is particularly suitable for the detection of antibodies which the body produces in particular a complex of endotoxin and procollagen in response to the composition formed under natural conditions.
  • the antibody titer against the composition formed under natural conditions is an indicator of whether the complaints of the connective tissue and the musculoskeletal system are due to exposure to the substance capable of binding to a PAMP receptor, in particular endotoxins.
  • a comparison with the titer on autoantibodies against normal collagen shows whether there is a preliminary stage of the incipient rheumatic disease or whether the rheumatic disease is already fully developed.
  • the former would be indicated by a clear titer on the naturally formed composition, with an additional weak titer on the body's own collagen possibly being present. In the further case there is a titer on the naturally formed composition and a high titer on the body's own collagen.
  • the test kits according to the invention are accordingly suitable for detecting an antibody.
  • the test kit can furthermore contain the buffer substances known in the prior art which are suitable for use of the test kit in the determination and diagnostic method.
  • the body fluid for examination by the test kit is preferably selected from blood or blood products including serum.
  • Methods which are advantageous for determination purposes are immunoassays, ELISA, RIA, membrane-bound test strips, receptor binding tests or biosensory determinations, the implementation of which is known to the person skilled in the art.
  • the composition would be immobilized on a microtiter plate. in the Test bind the specific antibodies and are then converted into a signal by correspondingly labeled autoantibodies using known methods.
  • the present invention furthermore provides reagents which bind to the composition according to the invention, preferably are specific for this.
  • specific reagents are antibodies, antibody fragments, for example Fv, F (ab) or F (ab) 2 fragments or antibody derivatives.
  • the Antikö ⁇ er, Antikö ⁇ erfragmente, for example Fv, F (ab) or F (ab) 2 fragments or Antikö ⁇ erderivate can be of monoclonal or polyclonal origin.
  • specific antibodies are available in which experimental animals, such as mice or rabbits, are immunized with the composition according to the invention or at least component (i) or component (ii), which are preferably coupled to suitable high-molecular carrier molecules.
  • Immunization can be facilitated by adding suitable adjuvants known in the art.
  • Monoclonal antibodies are usually obtainable by fusing spleen cells, which have been removed from an immunized mouse, with tumor cells and selecting the resulting hybridomas. Those hybridomas that efficiently secrete specific antibodies can be determined by searching for the supernatant.
  • antibodies can be produced recombinantly; in the production of recombinant antibodies, the mRNA is isolated from hybridoma cells or B lymphocytes, which acts as the basis for the synthesis of the corresponding cDNA and is amplified by PCR.
  • the antibody After ligation into a suitable vector and the introduction of a suitable host cell culture, the antibody can be obtained from the cell culture supernatants or the cell lysates. Recombinant antibodies allow a "humanization" of the antibody and are therefore less immunogenic.
  • the methods in this regard are known in the prior art.
  • Antibody derivatives comprise conjugates of antibodies with markers suitable for detection, for example for use in scintigraphy.
  • the present invention furthermore provides a composition comprising a first binding partner which binds to component (i), preferably specific for this, and / or a second binding partner which binds to component (ii), preferably specific for this ,
  • the composition is preferably a pharmaceutical composition.
  • the first and second binding partner is preferably an antibody.
  • component (i) is an endotoxin, preferably LPS
  • LAL Further binding partners of endotoxin, preferably LPS, are albumin, transferrin, HDL, LDL, apolipoproteins, C-reactive protein, CRl, CR3, CD14, scavenger receptors, CD18, gangliosides, lectin-like receptors, polysaccharide receptors, bactericidal / permeability increasing protein (BPI), cationic antimicrobial proteins (CAP), and LPS-binding protein (LBP), as well as soluble variants of the factors mentioned above.
  • component (ii) is specified as a further binding partner for component (i).
  • Component (ii) is preferably procollagen, tropocollagen, collagen, synthetic precursors, fragments or variants thereof.
  • the component is procollagen, fragments and variants thereof.
  • the fragments and variants of procollagen are defined as above.
  • the pharmaceutical composition can contain a pharmacologically acceptable carrier. Suitable carriers are known in the prior art.
  • the pharmaceutical compositions are preferably suitable for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration.
  • the substance capable of binding to a PAMP receptor, in particular endotoxin is the noxa for the death of the collagen-producing chondrocytes, the substance binding to the chondrocytes via the trihelical phase phrotein.
  • the pharmaceutical composition can therefore on the one hand directly neutralize the substance capable of binding to a PAMP receptor before it binds to the chondrocytes.
  • the pharmaceutical composition can remove already formed toxic complexes from the bloodstream.
  • Suitable concentrations of binding partner in the pharmaceutical composition can preferably be in the range from 1 ⁇ g / ml to 10 mg / ml.
  • the pharmaceutical composition is suitable for the treatment of connective tissue diseases, including diseases of the musculoskeletal system.
  • the connective tissue disease is preferably osteoarthritis, soft tissue rheumatism, fibromyalgia or rheumatic disease.
  • a test kit for diagnosing connective tissue diseases containing the antibody according to the invention and / or the above-mentioned composition.
  • the test kit can also contain buffer substances known from the prior art which are suitable for use of the test kit in determination and diagnostic methods.
  • the test kit can be used to determine the naturally formed composition, in particular a complex containing endotoxin and procol layers and / or the substance in the body fluid capable of binding to a PAMP receptor, in particular an endotoxin.
  • the body fluid is preferably selected from blood or blood products including serum.
  • the detection can be carried out using immunoassays, ELISA, RIA, membrane-bound test strips, receptor binding tests or biosensory determinations, the implementation of which is known to the person skilled in the art.
  • a method for the diagnosis of connective tissue diseases comprising detecting the composition by bringing it into contact with the antibody or with the composition containing a first binding partner which binds component (i), is preferably specific to it, and / or a second binding partner which binds to component (ii), is preferably specific for this.
  • component (ii) for neutralizing endotoxins such as LPS for the prophylaxis of an autoimmune reaction is also proposed according to the invention. given.
  • the administration of component (ii) leads to binding and thus neutralization of the endotoxins present in the patient's body fluid.
  • Component (ii) is preferably selected from procollagen, tropocollagen, collagen, synthetic precursors, fragments or variants thereof, particularly preferably procollagen, fragments or variants.
  • the fragments or variants are defined as above.
  • Microbially populated building materials were taken from the basement of a residential building. To produce the eluate, 150 g of this material and 60 ml of PBS were suspended and stirred at 200 rpm for 30 minutes. The sample was then switched off for 5 minutes so that the solid components could sediment. The liquid part was then centrifuged (at 4000 g) and then filtered with a 0.2 ⁇ m cellulose acetate filter. The liquid obtained in this way was tested for sterility by cultivation on nutrient media. This sterile eluate was added at a dilution of 1: 100 chondrocyte cultures.
  • the primary chondrocyte cultures used here were prepared in accordance with Shakibaei et al., Biochem. J. (1999), 342, 615-623; Shakibaei et al., J. Biol. Chem (2001), 276, 13289-13294.
  • Kno ⁇ elgewebe was mechanically crushed, incubated and cleaned in Ham's F-12 medium. The pieces of cartilage were then dissolved with 1% pronase (2 hours at 37 ° C.) and then with 0.2% collagenase (4 hours at 37 ° C.). Here, the extracellular matrix is dissolved while the chondrocytes have not been attacked. Both enzymes were dissolved in Hank's solution with 5% (v / v) fetal calf suspension.
  • the chondrocytes were then suspended in growth medium.
  • the growth medium consisted of Ham's F-12 and DMEM (3: 1) (v / v)). 10% (v / v) fetal calf semen, 25 ⁇ g / ml ascorbic acid and 50 ⁇ g / ml gentamicin were added to this medium.
  • the chondrocytes were separated by repeated pipetting.
  • the cells (cell density: 2xl0 6 / 10 ⁇ l) were cultivated in alginate beads (Shakibaei and de Souza, Cell Biol. Int. (1997), 21, 75-86). After two weeks, some cells had continuously grown out of the alginate beads and adhered to the petri dishes.
  • the cells of the first passage were removed with 0.05% (v / v) trypsin / 1.0 mM EDTA and sown again in culture bottles.
  • the confluent monolayer was passaged every three days.
  • the cells from the monolayer passage were introduced into high density cultures. High density cultures were prepared as detailed in Zimmermann et al., Cell Differ. Dev. (1990), 11-22. Briefly, the cells were washed twice in growth medium and sedimented by centrifugation (600 rpm for 10 minutes).
  • polymyxin B (Sigma, P1004; polymyxin B sulfate salt,> 6000 USP units / mg) was also added to the sample eluate.
  • Polymyxin B specifically binds endotoxins.
  • Various amounts of polymyxin B were added until only very small amounts of endotoxins were finally detectable using LAL tests (LAL test, Pyrogent, BioWhittaker, Inc., MD, USA).
  • LAL tests LAL test, Pyrogent, BioWhittaker, Inc., MD, USA.
  • the chondrocyte exposure experiments were then repeated. It was shown that the chondrocytes and the extracellular matrix were damaged in correlation to the LPS concentration in the eluate.
  • the enzyme production of collagenase and matrix metalloproteinase was inversely proportional to the endotoxin content.
  • composition according to the invention can be used as a marker for the medical diagnosis of connective tissue diseases in humans and animals. In this function it can also be used for therapy control. Also hygienic tests, for example of the living and working environment with regard to bacterial or mold colonization and in In this context, contamination with endotoxins and, if necessary, measures to eliminate them play an important role in the context of therapy concepts.
  • the antigens described are preferably used as markers in customary diagnostic methods, such as immunoassays, blotting methods, biosensor methods or comparable methods.
  • customary diagnostic methods such as immunoassays, blotting methods, biosensor methods or comparable methods.
  • the assay is carried out using appropriate blocking and coating protection methods, as are well known in the art, using dilute sera or plasma samples in the assay. Autoantibodies that are present in the appropriate titer in specifically affected rheumatic patients bind to the immobilized antigen.
  • the signal is generated according to methods known in the art with enzyme-labeled (often horseradish peroxidase), anti-human IgG (possibly also IgM or IgA) antibodies from rabbits, sheep or goats.
  • enzyme-labeled often horseradish peroxidase
  • anti-human IgG possibly also IgM or IgA
  • the final signal generation takes place via the enzymatic formation of a chromogen.
  • a commonly used substrate is the tetramethylbenzidine substrate.
  • the evaluation is carried out at 450 nm using an ELISA photometer after stopping the reaction with dilute sulfuric acid.
  • the concentration or the titer of the specifically directed autoantibodies in the individual calibration sera is to be set by producing suitable dilutions in such a way that a suitable standard curve is achieved.
  • the cut-off value for discrimination between normal and pathological values is set by measuring and evaluating sera or plasma collectives from specifically ill patients and control subjects. The cut-off value is calculated on the basis of these measurements by statistical evaluation.
  • the diagnostic method described is indicated for rheumatic diseases which are associated with inco-endotoxins.
  • Increased titers of specific autoantibodies indicate rheumatic diseases which can often not be determined by laboratory tests used to date, such as measuring the known rheumatoid factor.
  • the diagnosis therefore records other specifically ill patients and thereby improves and supplements the established laboratory diagnosis alone.
  • a hygienic analysis of the living and working environment is possible, which eliminates eliciting factors, in particular endotoxins or the causes for the existence of these endotoxins.
  • test can be used to monitor therapy.
  • a treatment on the other hand to check the elimination of the possible causes discussed, ie endotoxin pollution of the environment.
  • the composition itself in particular the endotoxin or the endotoxin-procollagen complex, can also be detected in the serum.
  • detection of the autoantibodies is preferred.
  • the antigen itself can be detected in a conventional method such as in an immunoassay.
  • the antigen is preferably detected in a sandwich ELISA.
  • the basis is two, preferably different, antibodies which are obtained by immunization with the composition, preferably on endotoxin-procollagen complex, by methods which are known in the prior art.
  • an ELISA which can be used as a preferred method, one of the two antibodies is used in a preferred method for coating, while the other is coupled to a marker enzyme. The coupling methods are known from the prior art.
  • This method can be used as an alternative or in addition to the autoantibody determination.
  • veterinary tests are also possible. Relevant structures or antigens from cell cultures can also be detected using the invention described here.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die wenigstens eine zur Bindung an einen Pathogen associated molecular patterns (PAMP)-Rezeptor fähige Substanz; und wenigstens ein trihelikales Faserprotein, ein Fragment oder eine Variante davon enthalten. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist das trihelikale Faserprotein Prokollagen, Fragmente oder Varianten davon. Ferner werden diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen zur Prophylaxe/Therapie sowie diese enthaltende Test-Kits zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen bereitgestellt. Weiterhin werden spezifische Bindungspartner und deren Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Prophylaxe/Therapie und in Test-Kits zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen bereitgestellt.

Description

Mittel und Verfahren zur Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Bindegewebserkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, diese enthaltende pharmazeutische Präparationen sowie Test-Kits zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen; hierzu gehört auch das Bindegewebe in parenchymatösen Organen und Gefäßstrukturen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Diagnostik, Prophylaxe und oder Behandlung von Bindegewebserkrankungen unter Verwen- düng der Zusammensetzung. Weiterhin werden zur Diagnose und Prophylaxe/Therapie geeignete spezifische Bindungspartner der Zusammensetzung bereitgestellt.
Die klinische Labordiagnostik stellt einen wesentlichen Bestandteil der rheumato- logischen Diagnostik dar. Eine wichtige Rolle spielen die so genannten Rheumafaktoren, wobei der Begriff Rheumafaktor ein historischer Begriff ist. Bei diesen Rheumafaktoren handelt es sich um Autoantikörper gegen Gammaglobuline, wobei die Analytik der jeweiligen Rheumafaktor- IgG, -IgM und Ig As von unterschiedlicher klinischer Relevanz ist. Es handelt sich überwiegend um anti- isotypische Immunglobuline, d.h. um Antikörper, die gegen die konstanten Regionen (Fc) von Immunglobulin-Molekülen gerichtet sind. RF-IgM ist, in Abhängigkeit zur Titerhöhe relevant für rheumatoide Arthritis, SLE, Sjögren Syndrom, MCTD und weitere Krankheitsbilder. Dementsprechend sind diese Parameter auch nicht spezifisch für rheumatoide Erkrankungen. Der RF-IgA-Wert hat eine Bedeutung bei klinisch auffälligen Patienten mit negativem RF-IgM. RF-IgG spielt eine pathophysiologische Rolle in späteren Krankheitsstadien.
Eine direkte Ableitung einer rheumatischen Erkrankung aus diesen Laborwerten ist nicht möglich, da diese auch bei Schwangerschaft, Asthma, einigen entzündli- chen Erkrankungen, Heφes oder Grippe erhöht sein können. 6-8% der Gesunden und 10% in hohem Alter haben einen Rheumafaktor. Dies ist auch der Grund, warum Rheumafaktoren nicht den pathologischen Stellenwert haben, wie beispielsweise Anti-ds-DNA-AK bei der Diagnostik des SLE. Trotzdem stellt der Nachweis dieser Autoantiköφer ein wesentliches diagnostisches Kriterium dar. Zudem kommt ihnen auch eine prognostische Bedeutung zu, da Rheumafaktorpositive Polyarthriden zumeist einen progredienteren Verlauf als Rheumafaktornegative Erkrankungsformen nehmen. Anscheinend spielen die Rheumafaktoren pathogenetisch insbesondere bei der Ausprägung von extrazellulären Manifestati- onen der rheumatischen Arthritis eine Rolle. Patienten mit auch rheumatoider Vaskulitis weisen jedenfalls zumeist höhere Rheuma-Faktoren-Titer auf, als Patienten mit nur artikularen Manifestationen. Auch konnten bei Lungen- Manifestationen Immunkomplexe aus Rheumafaktoren und IgG-Molekülen in den Zellwänden pulmonaler Gefäße sowie auch in den Alveolen nachgewiesen wer- den.
In der Labordiagnostik für rheumatische Erkrankungen werden noch Entzündungswerte wie CRP, das Blutbild zur Beurteilung der Krankheitsaktivität und die Bestimmung der Harnsäure im Zusammenhang mit Gicht herangezogen.
Die pathogenetisch auslösenden Ursachen einer rheumatischen Erkrankung sind mit allen bisher bekannten Methoden nicht zu erfassen.
Dementsprechend werden von den genannten Untersuchungen viele rheumatisch Erkrankte nicht erfasst. Andererseits werden auch viele sonstige Erkrankte, insbesondere Autoimmunerkrankte miterfasst, die nicht rheumatisch erkrankt sind.
Rheumatische Erkrankungen haben eine verbesserte Chance zur Behandlung, wenn sie frühzeitig und eindeutig diagnostiziert werden. Eine Reihe unterschiedli- eher Behandlungsmöglichkeiten zur Therapie der rheumatischen Arthritis stehen zur Verfügung. Nicht jede Gelenkentzündung verläuft gleich schnell und gleich aggressiv. Die Therapie ist deshalb individuell auf den einzelnen Patienten abzustimmen. Von großer Bedeutung für den Behandlungserfolg ist eine gezielte und ganz besonders eine frühzeitige Behandlung. Die rheumatologische Forschung hat gezeigt, dass bei Erkrankungen mit schwerem Verlauf die Behandlung innerhalb der ersten Jahre besonders erfolgreich ist und irreparable Gelenkstörungen aufhalten kann.
Eine Diagnostik, die Hinweise auf eine mögliche Ursache der Erkrankungen liefert, die sich damit u.U. durch Metaphylaxe/Sekundäφrävention vermeiden oder vermindern lässt, ist mithin von erstrangiger Bedeutung. Hier setzt das nach den Ansprüchen der zu schützenden Stoffe und Verfahren Zugrunde liegende patho- genetische Konzept an.
Aus diesem Grund ist eine frühzeitige und eindeutige Diagnostik für einen Thera- pieerfolg von besonderem Interesse. In früheren Jahren wurde die rheumatoide Arthritis häufig erst in einem fortgeschrittenen Stadium erkannt, in dem bereits irreversible makroskopische Schäden der Strukturen aufgetreten waren. Mittlerweile weiß man, dass die Erkrankung innerhalb der ersten beiden Jahre nach Auftreten der ersten Symptome besonders schnell fortschreitet. Je früher eine wir- kungsvolle Therapie beginnt, umso größer ist die Chance, den Entzündungspro- zess zu beeinflussen und die Zerstörung von Knoφeln und Gelenken aufzuhalten. Deshalb ist eine frühzeitige und eindeutige Diagnose besonders wichtig.
Der Aufbau des kollagenen Gewebes erfolgt allgemein in folgenden Schritten:
Faserbildende Zellen, wie Fibrozyten, Chondrozyten, Osteozyten, Retikuläre Zellen und andere hierauf spezialisierte Zellen, produzieren bindegewebige Strukturen durch Exozytose von trihelikalen, seilartigen Faseφroteinen bzw. deren Vorstufen. Der Syntheseablauf wird im Folgenden am Beispiel der Chondrozyten und deren spezifischen Produkten dargestellt, ist aber unter der Berücksichtigung der jeweiligen Variabilitäten der verschiedenen bekannten Kollagene auf andere faserbildende Zellen übertragbar.
Im Golgi-Apparat dieser Zellen werden zunächst unabhängig voneinander drei Aminosäureketten (nachfolgend als Kardele bezeichnet) synthetisiert die sich durch folgende characteristische Abschnitte auszeichnen: • Einem 15 bis 50 Aminosäuren (AS) langen N-terminalen Abschnitt, wel- eher später zur Bildung des N-terminalen Propeptids beiträgt. Dieser Abschnitt weist unter den verschiedenen Kollagenen eine höhere Variabilität auf und ist reich an den Aminosäuren Cystein, bezw. in der Cystin Form Cys-S-S-Cys bei Schleifen und Taschen bildenden Längsvernetzungen, insbesondere bei den einen großen Teil der Gesamtmasse aller Faseφrote- ine ausmachenden Kollagenen I - III. • Im weiteren folgt ein durch hohe Regelmäßigkeit geprägter Abschnitt der repetetiv die Sequenz (Gly, X, Y) n enthält und ca. 1050 AS umfaßt. Unter X wird fast ausschließlich die Aminosäure Prolin oder Leucin gefunden; im Zuge der weiteren intrazellulären Prozessierung werden diese fakultativ posttranslational in Hydroxprolin bezw. Hydroxylysin umgewandelt. Diese Hydroxyaminosäuren dienen im Folgenden der Quervernetzung der Kardele nach Verseilung und weiter der Vernetzung der verseilten Fasersegmente untereinander. Die mit Y gekennzeichnete Position ist durch gewebespezifische, variable Aminosäuren besetzt. • Anschließend folgt ein dem N-terminalen Ende analoges und vergleichbar langes Propeptid. Abgesehen davon, dass auch dieser Abschnitt insgesamt wieder einen hohen Anteil an Cystein / Cystin einhält, ist ein spezielles Motiv von zwei bezw. drei Cystein AS dicht nebeneinander (zum Beispiel die Sequenz GlyProCysCysGly) am (N-terminalen) Ende des C- Propeptids - also dicht an der Übergangsstelle zwischen Telopeptid und C-terminalen Propeptid - characteristisch und von großer Bedeutung: Hier beginnt die Vernetzung der drei AS Ketten.
Nach gleichsinniger paralleler Ausrichtung der drei AS-Ketten (wobei die N- terminalen Enden gemeinsam an einer Seite liegen und ebenso die C-terminalen Enden gemeinsam an der anderen Seite liegen) beginnt an dieser Stelle die Verseilung der drei einzelnen Kardele durch die Ausbildung von kovalenten Cys-S-S- Cys Bindungen der Kardele untereinander, und zwar mit zweifachen oder dreifachen Quervernetzungen. Die Ausbildung und Lokalisation dieser „Cystin-Knoten" genannten Struktur ist aus der Primärstruktur der AS-Ketten der einzelnen Kardele exakt festgelegt.
Der Cystinknoten ist die evolutionäre Lösung für die Aufgabe, die relative Ver- schieblichkeit der drei Kardele in der Längsachse zueinander zu fixieren. In der Folge können sich die drei Kardele ineinander Umschlingen. Diese Verseilung verläuft spontan vom Cystinknoten ausgehend in Richtung zum N-terminalen Ende (und in geringem Umfang z.T auch in das C-terminale Propeptid). Sie ist nur möglich durch die gleichmäßigen Repetivität der Gly-X-Y Gruppen, die so in ein starres, jeweils versetztes Raster der Kardele zueinander kommen. Diese Raster- Synchronisation verläuft durch den ganzen mittleren Seilabschnitt, der somit das Telopeptid bildet, bis hinein in den N-terminalen Abschnitt, der anfänglich noch verseilt ist, sich dann aber wegen der Auflösung der Repetivität als unverseiltes Ende darstellt. Auch wenn die drei Arme des - nun N-terminales Propeptid - genannten Abschnitts jeweils frei bleiben, so ist doch die räumliche Struktur der auf diesen Armen liegenden Aminosäuren mit den von ihnen ausgehenden Bindung- sepitopen zueinander festgelegt.
Der auf dem C-terminalen Propeptid realisierte Cystinknoten hat also eine Fernwirkung auf die Raumstruktur des entgegengesetzten Endes, den freien Kardelen Armen des N-terminalen Propeptids. Diese durch den Cystinknoten erzwungene Rastersynchronisation der freien Enden der Propeptide bleibt erhalten, auch wenn die Propeptide im Rahmen der Prozessierung vom Prokollagen zum Tropokolla- gen abgeschnitten werden, jedenfalls solange der Schnitt der jeweils zuständigen Endopeptidasen (Metalloproteinasen) an der physiologisch korrekten Stelle auftritt.
Somit ist nicht nur die exakte Tertiärstruktur des C-terminalen Propeptids, auf dem der Cysteinknoten lokalisiert ist, definiert, sondern dieses gilt in gleicher Weise für das N-terminale Propeptid, auch wenn an diesem Fragment die die Rastersynchronisation auslösende Struktur - eben der Cysteinknoten - nicht mehr nachweisbar ist.
Nach Bereitstellung der intrazellulären, verseilten Prokollagen - Faserstücke mit einer Länge von ca. 300 nm werden diese auf die Zelloberfläche transportiert und dort weiter prozessiert.
Zum Aufbau von Kollagengewebe werden mittels Matrix-Metalloproteinase- Enzymen (MMP), z.B. MMP3, die oben erwähnten, als Propeptide bezeichneten Enden der Prokollagenfasern abgetrennt und das jeweils „zugeschnittene" Faserstück als Tropokollagen in die Matrix abgegeben. Das auf diese Weise konditio- nierte Faserstück wird im weiteren spezifisch in das jeweilige kollagene Gewebe eingebaut (linear, rasterförmig, netzartig, filzartig etc).
Entzündliche oder degenerative Erkrankungen der aus Faseφroteinen gebildeten Bindegewebsstrukturen, sei es dass diese eigene Organe darstellen, wie Bänder, Sehnen, Gelenke, Faszien, etc., oder dass sie in parenchymatösen Organen als Gerüststrukturen dienen, sind in verschiedene Gruppen einzuteilen.
Bei den rheumatischen Erkrankungen im engeren Sinne kommt es, nach einer anfänglich klinisch häufig wenig auffälligen Phase zur Ausbildung von Autoanti- köφern gegen die Bindegewebsstrukturen selbst - oder mit diesen unmittelbar assoziierten Geweben. Es folgen entzündliche Schübe, die die weitere Bildung von Autoantiköφern unterhalten.
Bei der zweiten Gruppe, den rheumatoiden Erkrankungen, fehlen die für eine Au- toimmunerkrankung typischen Autoantiköφer; primär entzündliche und schmerzhafte Symptome ohne erkennbaren Hintergrund beherrschen die Klinik. Die primäre Ursache dieser Erkrankungen ist unbekannt; sie können nach rezidivieren- dem Verlauf in das o.g. Vollbild einer rheumatischen Erkrankung übergehen, so dass in der Literatur strittig ist, ob letztere Erkrankungen unter Umständen nur Vorstufen der Ersteren darstellen. Es ist nicht bekannt, welche zusätzlichen Komplikationen auftreten müssen, damit sich aus einer rheumatoiden Erkrankung das Vollbild einer rheumatischen Autoimmunerkrankung entwickelt, auf jeden Fall ist ein längerer und progredienter Verlauf als ungünstige Voraussetzung anzusehen. Es wird diskutiert, dass es durch die anhaltenden Entzündungen in der Folge als Fehlleistung des Immunsystems zuletzt zur Bildung von Autoantiköφern gegen eigene, nicht pathologisch veränderte Strukturen kommt, weil die im Laufe der Zeit exprimierten Antiköφer ihre spezifische Selektivität zur Unterscheidung zwischen selbst und nicht-selbst einbüßen.
Andererseits gibt es eine als primäre Arthrose bezeichnete Gruppe von Erkrankungen bindegewebiger Strukturen, insbesondere der Gelenke und Sehnen, die weder mit entzündlichen Schüben beginnen, noch durch das Auftreten der für eine Autoimmunerkrankung typischen Autoantiköφer gekennzeichnet sind. Für diese Erkrankungen ist ein langfristiger Untergang der faserbildenden Zellen, z.B. der Chondrozyten gesichert, ohne dass deren Ursache bekannt ist.
Diese Erkrankungen werden ursächlich dem Verschleiß (durch unphysiologische Belastung) zugeordnet, jedoch ist zu vermuten, dass weniger die übermäßige Abnutzung der Strukturen im Vordergrund steht, sondern vielmehr eine reduzierte Regenerationskapazität vorherrscht. Das klinische Bild wird beherrscht durch ei- nen langsamen, über Jahre / Jahrzehnte laufenden unerklärten Schwund der bin- degewebigen Funktionsgewebe, insbesondere des Knoφels.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, neue Mittel und Verfahren zur Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von Bindegewebserkrankungen und Erkrankungen des Bewegungsapparates anzugeben.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend: i) wenigstens eine zur Bindung an einen PAMP -Rezeptor fähige Substanz; und ii) wenigstens ein trihelikales Faseφrotein, ein Fragment oder eine Variante davon .
Weitere Lösungen ergeben sich aus dem Gegenstand der Ansprüche.
Im Folgenden werden einige Begriffe erläutert, um klarzustellen, wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Anmeldung verstanden werden soll.
PAMP - Rezeptoren umfassen Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die für Parasiten, speziell Mikroorganismen, typische molekulare Strukturen erkennen. Die pathogen associated molecular patterns (= PAMP) sind charakteristische Strukturen von Mikroorganismen, die eine hohe genetische und phänotypische Stabilität innerhalb größerer Gruppen von Mikroorganismen (=Pilze, Bakterien und Protozoen) zeigen. Dies weist auf eine für die betroffenen Mikroorganismen (= MO) unverzichtbare Struktureinheit hin, die nicht ohne gravierenden evolutionären Nachteil geändert werden kann. Diese speziellen molekularen Muster erweisen sich gerade deshalb als für den Wirtsorganismus bedeutsam aus, der er selbst in seinem Strukturinventar nicht auf diese Merkmale angewiesen ist, und daher sich diese molekularen Muster als sicheres Erkennungskriterium für köφer- fremde MO eignen.
Der Ausdruck „Pathogen-associated molecular patterns (PAMP)-Rezeptor" wird synonym zu dem Ausdruck „Pattern Recognition Receptor (PRR)-Rezeptor" verstanden. Zur Übersicht wird auf den Artikel von Medzhitov und Janeway, Current Opinion Immunol (1997), 9, 4-9 verwiesen. Erfindungsgemäß umfassen PAMP- Rezeptoren Toll-like Rezeptoren. Weiterhin umfasst der Ausdruck Nicht-Toll- like, zellmembranständige PAMP-Rezeptoren wie phagozytische Rezeptoren. Hier seien beispielhaft die Scavenger-Rezeptoren, insbesondere SR-A und MARCO, der Makrophagen Mannose-Rezeptor, der B-Glucan-Rezeptor und Pep- tidoglycan-recognition proteins (PGRP) genannt. Ferner umfasst der Ausdruck intrazelluläre PAMP-Rezeptoren wie Proteinkinase R, Oligoadenylat-Synthase und Moleküle der NOD-Familie. Außerdem umfasst der Ausdruck lösliche PAMP-Rezeptoren Pentraxine wie z.B. CRP, Serum Amyloid A, Collectine, Li- pid-Transferasen wie das Lipid-bindende Protein (LBP) und lösliche Varianten der vorstehend genannten PGRP erwähnt. Vorzugsweise sind die PAMP- Rezeptoren humanen Ursprungs. Die Aminosäuresequenzen sind aus den allgemein zugänglichen Sequenzdatenbanken wie Genbank und SwissProt erhältlich.
Es gibt zellständige und in Köperflüssigkeiten gelöste PAMP-Rezeptoren. Zellständige Rezeptoren dienen entweder der Signal transduktion in die Zelle, z.B. CD- 14 Rezeptor, oder haben, keinen bekannten intrazellulären Signalanschluß zur Auslösung einer Reaktion. Gleiches gilt auch für lösliche Formen von PAMP- Liganden, die keinen direkten Kontakt zu Zellen haben. Die Funktion der Rezeptoren ohne intrazellulären Signal-Transduktions-Anschluß (zellständig oder löslich) besteht in der Bindung von vagabundierenden MO oder Fragmenten von MO; dementsprechend werden sie als Scavenger-Rezeptoren (Scavenger = Ausputzer) bezeichnet. „Scavenger-Rezeptor" (= SR) umfassten hierbei SR-A einschließlich SR-A I und SR-A II, und MARCO. Ferner werden von SR umfasst SR-A-artige SR. Diese umfassen SR-CLI (SR mit C-Typ Lectin I), SR-CLII, CL-Pl (=Collektin aus Plazenta-Rezeptor I), LOX-I (=Lectin-artiger oxidierter LDL-Rezeptor I), dSR-CI (Drosophila SR-CI). Vorzugsweise ist der Scavenger-Rezeptor SR-A, insbesondere SR-AI. Ferner wird in Bezug auf die Scavenger-Rezeptoren auf den Übersichtsartikel Peiser et al., in Current Opinion in Immunology 2002, 14:123-128 Bezug genommen.
„Zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanzen" umfassen erfindungsgemäß sämtliche im Stand der Technik bekannten PAMPs. Zur Übersicht siehe Artikel von Medzhitov und Janeway, Current Opinion Immunol. (1997), 9, 4-9. PAMPs umfassen bakterielle und mykobakterielle PAMPs und von Pilzen stammende PAMPs. Zu den PAMPs gehören z.B. Lipopolysaccharide (=LPS, auch Endotoxine genannt), Lipoteichonsäure (= LTA) und ihre Varianten, wandspezifische Proteoglykane (= PGN), für Mikroorganismen spezifische, nicht- methylierte DNA-Abschnitte (CpG), Lipoproteine und N-formylierte Peptide wie F-Met-Leu-Phe und bakterielle Proteine. Von Pilzen stammende PAMP sind z.B. Pilz-spezifische Peptidoglykane. Von Mykobakterien stammende PAMP sind Mycolsäure und Mycolsäureester.
Die Bindung von Lipoteichonsäure, Lipopolysaccharid (LPS), bakterieller DNA, Bakterienzellfragmenten an SR, der einen PAMP-Rezeptor darstellt, ist aus Peiser et al., vorstehend bekannt.
Weitere zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanzen können durch einfaches Durchführen eines Bindungsassays erhalten werden, wie er beispielsweise in Dünne et al., PNAS 91 (1994), 1863-1867 beschrieben ist, wobei für den Bindungsassay der PAMP-Rezeptor vorzugsweise SR-AI ist. Der Begriff „trihelikales Faseφrotein" umfasst erfindungsgemäß Kollagen, Prokollagen, Tropokollagen, Elastin, Fibrillin, Fibronectin, Scavenger-Rezeptoren und weitere kollagenartige Bestandteile. Ferner umfasst der Ausdruck die Synthesevorstufen der vorgenannten. Wie allgemein bekannt und oben beschrieben, werden Kollagene zunächst als Prokollagen-Alphaketten synthetisiert. Diese werden nach Hydroxylierung von L-Prolin- und L-Lysin-Resten sowie nach Glykosy- lierung im endoplasmatischen Retikulum bzw. im Golgi-Apparat, wobei sie zu je drei Ketten zusammentreten, in den extrazellulären Raum ausgeschieden. Dort werden von den Enden der Ketten sog. Propeptide oder solche, die an einer nicht- typischen Schnittstelle abgetrennt wurden, abgespalten, und es entsteht das Tropokollagen, das sich zu Fibrillen zusammenlagert. Durch Oxidation von Ami- nogruppen der L-Lysin-Seitenketten zu Aldehyd-Gruppen und deren Aldol- und Aldimin-Bildung mit Aldehyd- bzw. Aminogruppen benachbarter Ketten werden diese miteinander verknüpft. (Vernetzung).
Der Ausdruck „Fragmente" bedeutet, sofern es sich um Proteine handelt, vorzugsweise Fragmente mit einer Mindestlänge von 10, besonders bevorzugt 20 Aminosäuren. Sofern es sich um Nukleinsäuren handelt, haben die Fragmente wenigstens 20 Nukleotide, vorzugsweise 50 Nukleotide.
Der Ausdruck „Varianten" umfasst grundsätzlich sämtliche Modifikationen einer gegebenen Sequenz, wobei Muteine bevorzugt sind, die sich auf Aminosäureebene durch Addition, Substitution, Deletion, Insertion oder Inversion wenigstens einer Aminosäure von der gegebenen Peptidsequenz unterscheiden. Besonders bevorzugt umfasst die Mutation 1 bis 5 Aminosäuren, insbesondere 1 bis 3 Aminosäuren.
Der Ausdruck „Konjugate" umfasst Di-, Oligo-, und Polymerisierungen, wobei sowohl Homo- als auch Hetero Di-, Oligo-, und Polymerisierungen umfasst wer- den. Die Kopplung kann hierbei an ein Trägermolekül, wie beispielsweise Poly- ethylenglykol oder weitere im Stand der Technik bekannte Trägermoleküle erfol- gen. Ferner werden vom Begriff Konjugate auch natürlicherweise vorkommende Konjugate, wie beispielsweise posttranslationale Modifikationen, wie beispielsweise Hydroxylierungen der Seitenkette umfasst.
Lipopolysaccharide (LPS) enthalten einen sehr streng konservierten Aminozu- cker-2-X-Phosphat-Lipidkomplex der Lipid (A) genannt wird, und der der eigentliche Membranteil ist. Im Endotoxin-Molekül folgt auf das - die Bakterien- Membran konstituierende Lipid (A) ein im wesentlichen aus spezifischem Zucker mit manchmal weiteren Phosphaten als Kern-Antigen (Core-A) bezeichneter Be- reich. An das Kern-Antigen folgen die als Oberflächen- Antigen (Surface-A) bezeichneten, sehr variablen und sehr unterschiedlich langen Zuckerketten, die sich von Bakterienspecies, aber auch innerhalb einer Spezies von Stamm zu Stamm sehr unterscheiden können. Erfindungsgemäß werden sowohl die mono- als auch die bi-phosphorylierte Form des Lipid (A) umfasst.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den folgenden überraschenden Feststellungen der Erfinder:
Es konnte in zahlreichen Fällen beobachtet werden, dass Personen, die sich in Gebäuden aufhalten, in denen es bestimmte Feuchtigkeitsschäden gibt, die einhergehen mit einem mikrobiellen Befall, auffällig oft unter Schmerzen im Bereich der Gelenke, sogenannte rheumatoide Beschwerden, leiden. Diese Beschwerden stehen in der Regel in zeitlichem Zusammenhang mit dem Aufenthalt im Gebäude, d.h. bei Abwesenheit klingen die Beschwerden ab und bei erneutem Aufent- halt im entsprechenden Gebäude treten sie in relativ kurzer Zeit wieder auf. Je häufiger die Betroffenen exponiert wurden, desto schneller kommen die Beschwerden bei Exposition und desto langsamer klingen sie ab nach Beseitigung der Exposition.
Genauere Untersuchungen zeigten, dass zunächst im Anfangsstadium meist nicht die Gelenke im engeren anatomischen Sinne schmerzten, sondern gelenknahe Weichteilstrukturen. Das Auftreten der Schmerzen war hierbei streng korreliert mit einer vorangegangenen biomechanischen Belastung. Die Beobachtungen zeigten, dass es genau die Stellen höchster querschnittsbezogener Beanspruchungen sind, die den Patienten am nächsten Tage schmerzten.
Bei der Untersuchung zahlreicher entsprechender Gebäude konnte nachgewiesen werden, dass die Bindegewebserkrankungen mit einem charakteristischen mikro- biellen Befallsmuster in Baumaterialien korrelierten.
Durch in tro-Experimente konnte nachgewiesen werden, dass bakterielle Endotoxine (= LPS), extrahiert aus feuchten Baumaterialien, im Bereich von Feuchtigkeitsschäden, menschliches Knoφelgewebe zerstören. Bei dieser Zerstörung werden die Chondrozyten und die extrazelluläre Matrix zerstört und es ist ein starker Anstieg der Mengen an MMP-Enzymen in der Gewebekultur feststellbar. Es war ferner nachweisbar, dass die Wirkung der Endotoxine auf das Gewebe eine klare Dosis- Wirkungsbeziehung zeigt, d.h. je höher die Konzentration an Endotoxinen war, um so größer war auch die Zerstörung der Chondrozyten, die für die Kollagensynthese verantwortlich sind.
Somit konnten erstmals LPS, bzw. Endotoxine als Noxe, d.h. als krankheitserregende Ursache für Bindegewebserkrankungen von Patienten festgestellt werden, die sich in Gebäuden mit mikrobiellem Befall aufhielten. Es ist daher erstmals eine Unterscheidung zwischen einer mikrobiell-bedingten Bindegewebserkran- kung und einer nicht mikrobiell-bedingten Bindegewebserkrankung möglich.
Diagnostischer Ansatz der hier in Rede stehenden Verfahren ist der Nachweis einer reduzierten Reparatur- und Regenerationskapazität für fibrilläre Strukturen durch eine exogene Noxe (PAMP, Definition siehe unten).
Die Aufgabe von PAMP-Rezeptoren, insbesondere von Scavenger-Rezeptoren ist u.a. die Bindung von Endotoxinen zur Entfernung aus dem Blutkreislauf. Die Er- finder der vorliegenden Erfindung haben ferner festgestellt, dass die LPS- bindenden Epitope der Scavenger-Rezeptoren eine hohe Homologie zu analogen Strukturen an den Enden der Prokollagen-Moleküle aufweisen. Die räumlichen Strukturen von SR-AI und SR-AII und Prokollagen sind in den Figuren 1 und 2 schematisch dargestellt. Hierdurch bieten sich insbesondere die N- und/oder C- terminalen Propeptide in verschiedenen Fragmentationslängen ggf. unter Einbeziehung eines Teils oder der gesamten Länge des Telopeptids beziehungsweise Modifikationen dieser Strukturen als naturnahe und damit gering antigene Liganden an.
Bei einer Überlastung des systemischen Reinigungssystems mit PAMP's, das durch Scavenger-Rezeptoren bereitgestellt wird, wie z.B. bei septischen Infekten, antibiotischer Therapie mit bakteriziden Antibiotika, oder wie im vorliegenden Fall durch exogene Endotoxinbelastung, kommt es zu einer Verfrachtung der PAMP's, speziell LPS, im Kreislauf und diese können an die nächste vergleichsweise avide Struktur binden. Dieses ist das frisch gebildete, noch nicht zu Tropo- kollagen prozessierte Prokollagen auf stimulierten faseφrotein-bildenden Zellen, z.B. Chondrozyten.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konnten am Beispiel der wachstumsangeregten Chondrozyten zeigen, dass eine vollständige Blockierung der Kollagensynthese durch Endotoxin durch eine übermäßige Aktivierung der an der Prozessierung beteiligten Metalloproteinasen zu einem Schaden an schon vorhandenen Faserstrukturen und letztlich zu einem Absterben der faserbildenden Zellen führt. Es ist anzunehmen, dass die nicht erfolgte Prozessierung zu Prokollagen die Zelle veranlasst, im großen Umfang weiter Prokollagen auf der Oberfläche bereitzustellen und Metalloproteinasen zur Prozessierung zur Verfügung zu stellen. Eine ü- bermäßige, nicht mehr nur lokal wirkende Synthese von MMP's führt zu einer großräumigen Zerstörung von Fasern und Zellen; bei umfangreichen Zerstörungen in der Folge zur klinisch apparenten Entzündung und Schmerz. Fig. 1 zeigt die räumlichen Strukturen von SR-AI und SR-AII. Fig. 2 zeigt die räumliche Struktur von Prokollagen.
Fig. 3 (a) bis (c) zeigen zerstörte Chondrozyten nach Zugabe von in Beispiel 1 beschriebenem Eluat. Fig. 4 (a) bis (b) zeigen gesunde Chondrozyten.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Zusammensetzung enthaltend: i) wenigstens eine zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Sub- stanz; und ii) wenigstens ein trihelikales Faseφrotein, ein Fragment oder eine Variante davon.
Vorzugsweise ist die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ein bakterielles, mykobakterielles oder von Pilzen stammendes PAMP, vorzugsweise ist das PAMP ein Lipopolysaccharid (=LPS, auch Endotoxin genannt), Lipoteichonsäure (= LTA) und ihre Varianten, wandspezifische Proteoglykane (= PGN), für Mikroorganismen spezifische, nicht-methylierte DNA-Abschnitte (CpG), Li- poproteine und N-formylierte Peptide wie F-Met-Leu-Phe und bakterielle Protei- ne. Femer ist bevorzugt, dass das von Pilzen stammende PAMP ein Pilz- spezifisches Peptidoglykan ist. Weiterhin bevorzugt ist das PAMP von Mykobak- terien stammende Mycolsäure oder Mycolsäureester. Besonders bevorzugt ist das PAMP Lipopolysaccharid.
Femer sind Fragmente, Varianten oder Konjugate der zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähigen Substanz bevorzugt, wobei die Fragmente, Varianten oder Konjugate davon, wenigstens 50% der Bindungsfähigkeit von LPS aus E. coli an den Scavenger-Rezeptor SR-A I. Die Bindung des LPS an den Scavenger-Rezeptor wird, wie vorstehend beschrieben, bestimmt. Besonders bevorzugt haben die Fragmente, Varianten oder Konjugate eine Bindungsfähigkeit von we- nigstens 80%, insbesondere wenigstens 90% der Bindungsfähigkeit von LPS an den Scavenger-Rezeptor.
Besonders bevorzugt ist die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Sub- stanz ein Lipolysaccharid (LPS), Fragmente oder Varianten davon, wobei die Fragmente oder Varianten ein phosphoryliertes N-Acetylglucosamin-Dimer aufweisen, vorzugsweise einen vollständigen Lipid-A-Komplex enthalten. Es ist bekannt, dass Lipid (A) über dieses Strukturelement an den CD14-Rezeptor LBP- Komplex die Bindung von LPS an den Makrophagen-Rezeptor vermittelt. Vor- zugsweise ist das Lipopolysaccharid das Lipopolysaccharid der Gattungen z.B. Salmonella, Shigella, E. coli, Pseudomonas, Neisseria, Klebsieila und Haemophi- lus.
Besonders bevorzugt ist femer, dass die von Mikroorganismen stammenden PAMP's aus Bakterien der Ordnung Actinomycetales und Pilzen der Gattungen Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Eurotium, Penicillium, Wallemia, Chaetomi- um, Mucor, oder Scopulariopsis stammt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das trihelikale Faseφrotein (Komponente (ii) der Zusammensetzung) ausgewählt aus Kollagen, Prokollagen, Tropokollagen, Elastin, Fibrillin, Fibronectin, Scavenger-Rezeptoren oder anderen kollagenen Bestandteilen, Synthesevorstufen, Fragmente, Varianten oder Konjugate der vorstehenden Komponenten.
Das Kollagen umfasst erfindungsgemäß die Typen I bis XIV, wobei die Typen I, II, III, V und IX bevorzugt sind. Elastin ist der Hauptbestandteil der elastischen Fasern des Bindegewebes, vor allem in Organen mit hoher Elastizität, wie Blutgefäßen, Lunge, Haut, Sehnen und Uterus. Elastin unterscheidet sich von den ähnlichen Kollagenen durch den höheren Gehalt an Valin und Leucin, durch den nied- rigeren Arginin- und Hydroxyprolingehalt und das Fehlen von Lysinresten. Die vorstehend genannten Proteine sind vorzugsweise humanen Ursprungs, jedoch sind auch tierische Proteine von der Erfindung mitumfasst. Vorzugsweise ist das trihelikale Faseφrotein Prokollagen, Fragmente oder Varianten davon. Die Fragmente oder Varianten von Prokollagen weisen hierbei vorzugsweise wenigstens 50 %, besonders bevorzugt wenigstens 80 %, insbesondere wenigstens 90 % der Bindungsfähigkeit von humanem Prokollagen an LPS von E. coli auf. Die Bindungsfähigkeit kann hierbei mit einem allgemein bekannten Bindungsassay durchgeführt werden.
Die Varianten von Prokollagen sind vorzugsweise wenigstens 60 % homolog, bevorzugt wenigstens 80 %, besonders bevorzugt wenigstens 90 %, insbesondere wenigstens 95 % homolog auf Aminosäureebene zu humanem Prokollagen. Die Bestimmung der Homologie kann hierbei unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standard-Progarammen (z.B. FASTA, BLAST) unter Verwendung von Standard-Einstellungen erfolgen.
Das Fragment von Prokollagen weist bevorzugt mindestens 10, besonders bevorzugt 20, insbesondere 50 Aminosäuren von Prokollagen auf. Die Variante von Prokollagen ist vorzugsweise ein Mutein, das sich durch die Addition, Substitution, Deletion, Insertion oder Inversion wenigstens einer Aminosäure von Prokolla- gen unterscheidet. Bevorzugt umfassen die Mutationen 1 bis 5 Aminosäuren, insbesondere 1 bis 3 Aminosäuren. Besonders bevorzugt ist die Substitution eine konservative Substitution, bei der eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, die zur gleichen physiko-chemischen Gruppe gehört.
Allgemein können die Fragmente und Varianten durch chemische Verfahren oder rekombinant hergestellt werden.
Prokollagen weist eine Verseilung der drei Peptidketten ca. 10 bis 30 Aminosäurereste vor dem jeweiligen Ende auf. Die Stelle des Übergangs von der verseilten Struktur zu den freien Armen ist von besonderer Bedeutung. An dieser Übergangsstelle ist ein sehr markantes Aminosäuremotiv für kovalente Bindungen ver- antwortlich. Durch den zweifachen bzw. dreifachen Einbau der Aminosäure- Cystein in genau definierten Abständen auf jeder der drei Peptidketten wird eine Struktur ausgebildet, bei der jede Kette mit jeder Kette über Cys-S-S-Cys bindungsstarr miteinander verbunden wird. Diese Koordinationsstruktur aus Cystein- Bausteinen wird Cystein-Knoten genannt.
Vorzugsweise umfasst daher das trihelikale Faseφrotein, das Fragment oder die Variante davon eine zur Ausbildung eines Cystein-Knotens geeignete Sequenz, um so Bindungsstellen für die Bindung der Substanz, die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähig ist bereit, bereitzustellen. Bevorzugt ist die zur Ausbildung eines Cystein-Knotens geeignete Sequenz die Sequenz GlyProCysCysGly (SEQ ID NO: 1).
Für die im Rahmen der Erfindung diskutierenden Varianten des Prokollagens, seiner Folge- und Spaltprodukte ist festzuhalten, dass die Evolution des Cysteinknotens nur eine der denkbaren Lösungen der Aufgabe der Rastersynchronisation darstellt. Für biosynthetisch darzustellende, relevante Abschnitte des Prokollagens und Varianten seiner Propeptide ist festzuhalten, dass die Aufgabe der Rastersynchronisation, die für die Erhaltung der im folgenden genutzten Affinität der Propeptide zu PAMP's wesentlich ist, auch durch andere raumkoordinierende Maßnahmen zwischen den drei Kardelen der AS-Stränge zu lösen ist.
Die gilt für insbesondere für Nutzung der Bindungsfähigkeit eines N-terminalen Fragments des Prokollagens. Neben der naheliegenden Variante der ganz oder teilweisen Verkürzung des telopeptidischen Abschnitts in einem biotechnologische exprimierten Produkt, wodurch der Cystinknoten weiter N-terminal verlagert würde, können auch anders (als durch kovalente Cys-S-S-Cys) ausgebildete Bindungen zwischen den AS der drei Kardele genutzt werden, solange die räumliche Koordination der freien, zusammen das Bindungsepitop für PAMP's bildenden Enden der drei Kardele erhalten bleibt. Diese Technik, ohne Nutzung des natürli- chen Cysteinknotens oder eines funktioneilen Equivalents, ist auch auf die C- terminale Seite anwendbar.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist daher das Fragment oder die Variante des trihelikalen Faseφroteins das N- und/oder C-terminalen Ende eines trihelikalen Faseφroteins und gegebenenfalls einen Teil des Telomers.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausfύhrungsform ist die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ein Lipopolysaccharid und das trihelikale Faseφrotein ist Kollagen, Prokollagen oder Tropokollagen, vorzugsweise Prokollagen, Fragmente oder Varianten davon.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Zusammensetzung femer Chondrozyten, Fibrozyten, Osteozyten, retikulo- endotheliale Zellen, Endothelzellen und/oder Bestandteile davon. Die vorgenannten Zellen sind zur Herstellung von Kollagen befähigt. Bevorzugt sind hierbei Chondrozyten und deren Bestandteile. Bevorzugte Bestandteile sind hierbei die Zellmembran oder Fragmente davon. Bestandteile der Zellen können erfindungsgemäß der Zellkern, Golgi-Apparat, Endoplasmatisches Retikulum, und Mito- chondrien sein.
In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können die Komponenten (i) und (ii) nicht-kovalent oder kovalent miteinander verbunden sein. Eine kovalente Bindung der Komponenten (i) und (ii) der Zusammensetzung kann, sofern diese nicht bereits vorliegt, durch Quervemetzung mit Hilfe bekannter Verfahren, wie z.B. durch Carbodiimide erreicht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung angegeben, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Komponente (i) mit der Komponente (ii) und ggf. das Aufreinigen und Isolieren der Zusammensetzung umfasst. Die Kompo- nente (i) als auch die Komponente (ii) können sowohl in der natürlicherweise vorkommenden Form verwendet werden, als auch synthetisch hergestellt werden. Syntheseverfahren hierzu sind dem Fachmann bekannt. Das Inkontaktbringen der Komponenten kann hierbei in flüssiger Form erfolgen oder eine der beiden Kom- ponenten kann hierbei an einen Träger gebunden sein.
Verfahren zum Aufreinigen oder Isolieren der Zusammensetzung umfassen hierbei Zentrifugation, Gradientenfraktionierung, chromatographische Verfahren, ein- bzw. zweidimensionale Gelelektrophorese.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Verfahren als in vz'tro-Verfahren durchgeführt, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines eine Komponente (i) enthaltenden Bakterien- oder Pilz- Eluates; b) Bereitstellen einer wachstumsangeregten Chondrozytenkultur; c) Inkontaktbringen des Bakterien- oder Pilz-Eluates mit der Chondrozytenkultur; und d) gegebenenfalls Aufreinigen der Zusammensetzung.
Das Pilz-Eluat ist vorzugsweise ein Eluat gewonnen aus Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Eurotium, Penicillium, Wallemia, Chaetomium, Mucor oder Sco- pulariopsis. Das Bakterien-Eluat ist vorzugsweise ein Eluat gewonnen aus Acti- nomycetales, Salmonella, Shigella, E. coli, Pseudomonas, Neisseria, Klebsieila, und Haemophilus. Eine wachstumsangeregte Chondrozytenkultur wird vorzugs- weise wie von Shakibaei et al., Biochem. J. (1999), 342, 615-623 beschrieben, erhalten. Hierbei wird das Knoφelgewebe mechanisch zerkleinert, inkubiert und gereinigt in Ham's F-12 Medium. Die Chondrozyten werden anschließend in Wachstumsmedium suspendiert. Das Wachstumsmedium besteht aus Ham's F-12 und Dulbecco's modifiziertem Medium nach Eagle (50%:50%). Diesem Medium werden 10% fötales Kälbersemm, 25 μg/ml Ascorbinsäure und 50 μg/ml Genta- micin beigegeben. Wie vorstehend ausgeführt, kann das Aufreinigen dem Fachmann bekannte Verfahren, chromatographische Verfahren, Zentrifugation, Ultrafiltration und Gel- Elektrophorese umfassen. Eine bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung be- steht darin, die Komponente (i) an eine Säulenmatrix zu koppeln und nachfolgend ein Detergenz-lysiertes Chrondrozyten-Lysat über diese so präparierte Säule zu geben. Nach Inkubation des Chondrozyten-Lysates mit der gekoppelten Komponente (i) kann nachfolgend nach Waschen der Säule die Zusammensetzung eluiert werden. Die Elutionsbedingungen sind hierbei vorzugsweise so zu wählen, dass die Zusammensetzung nicht denaturiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die die vorstehend ausgeführte Zusammensetzung und wenigstens einen pharmakologisch verträglichen Träger enthält. Pharmakologisch verträgliche Träger sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Galenik bekannt. Bevorzugt ist die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Vakzin geeignet, um eine Immunreaktion der Person gegen wenigstens eine Komponente der Zusammensetzung zur Prophylaxe gegen die Ausbildung einer Autoimmun-Reaktion hervorzurufen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann die Vakzin-Formuliemng femer im Stand der Technik geeignete Carrier- Moleküle enthalten, um die Immunogenität der Zusammensetzung zu erhöhen. Die Vakzinformulierung kann vorzugsweise subkutan, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann allgemein in flüssiger Form oder in Form eines Aerosols unter geeigneter Verwendung Aerosol-stabilisierender Verbindungen vorliegen.
Somit wird erfindungsgemäß die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere als Vakzin zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Bindegewebserkrankungen bereitgestellt. Bindegewebserkrankungen umfassen erfin- dungsgemäß Erkrankungen des Bewegungsapparates, aber auch anderer bekanntermaßen bindegewebig vermittelter Erkrankungen wie zum Beispiel Vaskuliti- den, Glomerulonephritiden, Endokarditis (mit und ohne Klappenbeteiligung), Dermatitis und Dermatomyositis. Vorzugsweise sind die Bindegewebserkrankungen ausgewählt aus Arthrose, Weichteilrheuma, Fibromyalgie, rheumatischen Erkrankungen oder rheumatischer Autoimmunreaktion.
Gemäß einer weiteren Ausfύhrungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Test-Kit zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen bereitgestellt, der die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält. Der Test-Kit ist insbesondere geeignet zum Nachweis von Antiköφern, die der Köφer als Reaktion auf die, unter natürlichen Bedingungen gebildete Zusammensetzung insbesondere einen Komplex aus Endotoxin und Prokollagen erzeugt. Der Antiköφer Titer gegen die unter natürlichen Bedingungen gebildete Zusammensetzung ist hierbei ein Indikator dafür, ob die Beschwerden des Bindegewebes und des Bewegungsapparates auf die Exposition durch die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz, insbesondere Endotoxine zurückzuführen sind. Ein Vergleich mit dem Titer auf Autoantiköφer gegen normales Kollagen zeigt, ob eine Vorstufe der beginnenden rheumatischen Erkrankung vorliegt oder bereits die rheumatische Erkrankung voll entwickelt ist. Ersteres würde angezeigt durch einen deutlichen Titer auf die natürlich gebildete Zusammensetzung, wobei ggf. ein zusätzlicher schwacher Titer auf köφereigenes Kollagen vorliegt. Im weiteren Fall ist ein Titer auf die natürlicherweise gebildete Zusammensetzung und ein hoher Titer auf köφereigenes Kollagen festzustellen. Die erfindungsgemäßen Test-Kits sind demgemäss zum Nachweisen eines Antiköφers geeignet. Der Test-Kit kann femer die im Stand der Technik bekannten Puffersubstanzen enthalten, die zur Verwendung des Test- Kits im Bestimmungs- und diagnostischen Verfahren geeignet sind. Vorzugsweise ist die Köφerflüssigkeit zur Untersuchung durch den Test-Kit aus Blut bzw. Blutprodukten einschließlich Serum ausgewählt. Für Bestimmungszwecke vorteilhafte Verfahren sind hierbei Immuno-Assays, ELISA, RIA, membrangebundene Teststreifen, Rezeptorbindungstests oder biosensorische Bestimmungen, deren Durch- führung dem Fachmann bekannt ist. In einem ELISA-Nachweis würde beispielsweise die Zusammensetzung auf einer Mikrotiteφlatte immobilisiert werden. Im Test binden die spezifischen Antiköφer und werden dann durch entsprechend markierte Autoantiköφer durch bekannte Verfahren in ein Signal umgesetzt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Reagenzien bereit, die an die erfin- dungsgemäße Zusammensetzung binden, vorzugsweise spezifisch für diese sind. Ein Beispiel solcher spezifischer Reagenzien sind Antiköφer, Antiköφerfrag- mente, z.B. Fv-, F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente oder Antiköφerderivate. Die Antiköφer, Antiköφerfragmente, z.B. Fv-, F(ab) oder F(ab)2-Fragmente oder Antiköφerderivate können monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs sein. Allge- mein sind spezifische Antiköφer erhältlich, in dem Versuchstiere, wie z.B. Mäuse oder Kaninchen mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder wenigstens der Komponente (i) bzw. Komponente (ii), die vorzugsweise an geeignete hochmolekulare Trägermoleküle gekoppelt sind, immunisiert werden. Das Immunisieren kann hierbei durch den Zusatz geeigneter Adjuvanzien erleichtert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Monoklonale Antiköφer sind üblicherweise durch Fusionieren von Milzzellen, die aus einer immunisierten Maus entnommen wurden, mit Tumorzellen und Selektionieren der dabei entstehenden Hybridome erhältlich. Diejenige Hybridome, die effizient spezifische Antiköφer sezemieren, können hierbei durch Absuchen des Überstandes bestimmt werden. Alternativ können Antiköφer rekombinant hergestellt werden; bei der Herstellung rekombi- nater Antiköφer wird die mRNA aus Hybridomazellen oder B-Lymphozyten isoliert, die als Grundlage für die Synthese der entsprechenden cDNA fungiert und über PCR amplifiziert wird. Nach der Ligation in einen geeigneten Vektor und der Einführung einer geeigneten Wirtszellkultur lässt sich der Antiköφer aus den Zellkulturüberständen oder den Zell-Lysaten gewinnen. Rekombinante Antikörper erlauben eine „Humanisierung" des Antiköφers und sind dadurch weniger immu- nogen. Die diesbezüglichen Verfahren sind im Stand der Technik bekannt. Antiköφerderivate umfassen Konjugate von Antiköφern mit zur Detektion geeigneten Markem, beispielsweise zur Verwendung in der Szintigraphie. Die vorliegende Erfindung stellt femer eine Zusammensetzung bereit, enthaltend einen ersten Bindungspartner, der an die Komponente (i) bindet, vorzugsweise für diese spezifisch ist, und/oder einen zweiten Bindungspartner, der an die Komponente (ii) bindet, vorzugsweise für diese spezifisch ist. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung. Der erste und zweite Bindungspartner ist vorzugsweise ein Antiköφer. Ein weiteres Beispiel für die Ausführungsform, dass die Komponente (i) ein Endotoxin, vorzugsweise LPS darstellt, ist der Bindungspartner LAL. Weitere Bindungspartner von Endotoxin, vorzugsweise LPS, sind Albumin, Transferrin, HDL, LDL, Apolipoproteine, C- reaktives Protein, CRl, CR3, CD14, Scavenger-Rezeptoren, CD18, Ganglioside, Lectin-ähnliche Rezeptoren, Polysaccharid-Rezeptoren, bactericidal/permeability increasing protein (BPI), cationic antimicrobial proteins (CAP), und LPS- bindendes Protein (LBP), sowie lösliche Varianten der vorstehend genannten Faktoren. Als weitere Bindungspartner für Komponente (i) wird erfindungsgemäß Komponente (ii) angegeben. Die Komponente (ii) ist hierbei vorzugsweise Prokollagen, Tropokollagen, Kollagen, Synthesevorstufen, Fragmente oder Varianten davon. Insbesondere ist die Komponente Prokollagen, Fragmente und Varianten davon. Die Fragmente und Varianten von Prokollagen sind hierbei wie vorstehend definiert. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann neben dem ersten Bin- dungspartner und/oder zweiten Bindungspartner einen pharmakologisch verträglichen Träger enthalten. Geeignete Träger sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugt sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung geeignet. Wie vorstehend ausgeführt, stellt die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz, insbesondere Endotoxin, die Noxe für das Absterben der kollagenproduzierenden Chondrozyten dar, wobei die Substanz über das trihelikale Faseφrotein an den Chondrozyten bindet. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann daher einerseits direkt die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz neutralisieren, bevor diese an den Chondrozyten bindet. Andererseits kann die pharmazeutische Zusammen- setzung bereits entstandene toxische Komplexe aus dem Blutkreislauf beseitigen. Geeignete Konzentrationen an Bindungspartner in der pharmazeutischen Zusammensetzung können bevorzugt hierbei im Bereich von 1 μg/ml bis 10 mg/ml sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist geeignet zur Behandlung von Bindegewebserkrankungen einschließlich Erkrankungen des Bewegungsapparates. Vor- zugsweise ist die Bindegewebserkrankung Arthrose, Weichteilrheuma, Fibromy- algie oder rheumatische Erkrankung.
Erfindungsgemäß wird femer ein Test-Kit zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen enthaltend den erfindungsgemäßen Antiköφer und/oder die vorste- hend genannte Zusammensetzung bereitgestellt. Der Test-Kit kann femer dem Stand der Technik bekannte Puffersubstanzen enthalten, die zur Verwendung des Test-Kits in Bestimmungs- und diagnostischen Verfahren geeignet sind. Der Test- Kit kann verwendet werden zur Bestimmung der natürlicherweise gebildeten Zusammensetzung, insbesondere einen Komplex enthaltend Endotoxin und Prokol- lagen und/oder der in der Köφerflüssigkeit befindlichen zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähigen Substanz, insbesondere einem Endotoxin. Vorzugsweise ist die Köφerflüssigkeit aus Blut bzw. Blutprodukten einschließlich Serum ausgewählt. Der Nachweis kann unter Verwendung von Immuno-Assays, ELISA, RIA, membran-gebundenen Teststreifen, Rezeptorbindungstests oder biosensori- sehen Bestimmungen, deren Durchführungen dem Fachmann bekannt sind, ausgeführt werden.
Demgemäss wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen umfassend das Nachweisen der Zusammensetzung durch In- kontaktbringen mit dem Antiköφer oder mit der Zusammensetzung enthaltend einen ersten Bindungspartner, der die Komponente (i) bindet, vorzugsweise für diese spezifisch ist, und/oder einen zweiten Bindungspartner, der an die Komponente (ii) bindet, vorzugsweise für diese spezifisch ist.
Femer wird erfindungsgemäß die Verwendung der Komponente (ii) zur Neutralisierung von Endotoxinen wie LPS zur Prophylaxe einer Autoimmunreaktion an- gegeben. Die Verabreichung der Komponente (ii) führt zur Bindung und damit zur Neutralisation der in der Köφerflüssigkeit des Patienten befindlichen Endotoxine. Komponente (ii) ist vorzugsweise ausgewählt aus Prokollagen, Tropokolla- gen, Kollagen, Synthesevorstufen, Fragmente oder Varianten davon, besonders bevorzugt Prokollagen, Fragmente oder Varianten. Die Fragmente oder Varianten sind hierbei wie vorstehend definiert.
Es ist beabsichtigt, mit den nachfolgenden Beispielen die Erfindung zu erläutern, diese jedoch in keiner Weise einzuschränken. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls umfasst sind.
Beispiele
Beispiel 1
Bestimmung der wirksamen Noxe in Bakterien-Eluaten aus mikrobiell besiedeltem Baumaterial.
Es wurden aus dem Keller eines Wohnhauses mikrobiell besiedeltes Baumaterial entnommen. Zur Eluat-Herstellung wurden 150 g dieses Materials und 60 ml PBS suspendiert und 30 Minuten bei 200 U/min gerührt. Danach wurde die Probe 5 Minuten abgestellt, damit die festen Bestandteile sedimentieren konnten. Sodann wurde der flüssige Teil zentrifugiert (bei 4000 g) und dann mit einem 0,2 μm Cel- luloseacetatfilter gefiltert. Die auf diese Weise gewonnene Flüssigkeit wurde mittels Kultivierung auf Nährböden auf Sterilität getestet. Dieses sterile Eluat wurde mit einer Verdünnung von 1 :100 Chondrocyten-Kulturen zugesetzt.
Die hierbei verwendeten primären Chondrozyten-Kulturen wurden präpariert ge- maß Shakibaei et al., Biochem. J. (1999), 342, 615-623; Shakibaei et al., J. Biol. Chem (2001), 276, 13289-13294. Knoφelgewebe wurde mechanisch zerkleinert, inkubiert und gereinigt in Ham's F-12 Medium. Die Knoφelgewebestückchen wurden anschließend mit 1% Pronase (2 Stunden bei 37°C) und dann mit 0,2% Kollagenase (4 Stunden bei 37°C) aufgelöst. Hierbei wird die extrazelluläre Matrix aufgelöst, während die Chondrozyten nicht angegriffen werden wurden. Beide Enzyme wurden in Hanks Lösung mit 5% (v/v) fötalem Kälbersemm gelöst.
Die Chondrozyten wurden anschließend in Wachstumsmedium suspendiert. Das Wachstumsmedium bestand aus Ham's F-12 und DMEM (3:1) (v/v)). Diesem Medium wurden 10% (v/v) fötales Kälbersemm, 25 μg/ml Ascorbinsäure und 50 μg/ml Gentamicin hinzugefügt. Die Chondrozyten wurden durch wiederholtes Pipettieren voneinander getrennt. Die Zellen (Zelldichte: 2xl06/10μl) wurden in Alginate-Kügelchen (Shakibaei und de Souza, Cell Biol. Int. (1997), 21, 75-86), kultiviert. Nach zwei Wochen waren einige Zellen kontinuierlich aus den Alginate-Kügelchen herausgewachsen und an die Petrischalen adhäriert. Nach drei Tagen, als die Zellen konfluent gewachsen waren, wurden die Zellen der ersten Passage mit 0,05% (v/v) Trypsin/1,0 mM EDTA entfernt und in Kulturflaschen wieder ausgesät. Alle drei Tage wurde die konfluente Monoschicht passagiert. Die Zellen aus der Monolayer-Passage wurden in Kulturen hoher Dichte eingeführt. Die Kulturen hoher Dichte wurden hergestellt, wie im Detail von Zimmermann et al., Cell Differ. Dev. (1990), 11-22 beschrieben. Kurz gefasst wurden die Zellen zweimal in Wachstumsmedium gewaschen und durch Zentrifugation (600 U/min über 10 Minuten) sedimentiert. Ein oder zwei Tropfen einer dichten Zellsuspensi- on (l,5xl06Zellen/10 μl) wurden auf einen Membranfilter aufgebracht (Porendurchmesser 0,2 μm, Sartorius, Göttingen, Deutschland) auf der Oberfläche eines Edelstahlgitters im Zwischenbereich zwischen Medium und Luft in einer Petri- schale. Alle drei Tage wurde das Medium gewechselt. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Diesem Medium wurde das Eluat zugesetzt. Nach drei Tagen und sieben Tagen wurde das Knoφelgewebe mikroskopisch untersucht. Hierzu wurden Schnitte angefertigt. Fig. 3 (a) bis (c) zeigen die Zerstörung der Chondrozyten nach Zugabe des Eluates. Fig. 4 (a) und (b) zeigen zum Vergleich gesunde Chondozyten. Es war klar zu erkennen, dass sowohl die extrazelluläre Matrix als auch die Chondrozyten selbst, größtenteils aufgelöst waren. Weitere Untersuchungen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Western Blot zeigten, dass gleichzeitig mit der Gewebezerstömng eine deutliche Zunahme von Enzymen der G ppe der Matrixmetalloproteinasen einhergeht.
Femer wurde dem Proben-Eluat 1 x 1 mg/ml, 1 x 10 mg/ml bzw. 1 x 100 mg/ml Polymyxin B (Sigma, P1004; Polymyxin B Sulfat Salz, >6000 USP Einheiten/mg) zugesetzt. Polymyxin B bindet spezifisch Endotoxine. Es wurden verschiedene Mengen Polymyxin B zugesetzt, bis schließlich mittels LAL-Tests (LAL-Test, Pyrogent, BioWhittaker, Inc., MD, USA) nur noch sehr geringe Mengen an Endotoxinen nachweisbar waren. Sodann wurden die Chondrozyten- Expositionsversuche wiederholt. Es zeigte sich, dass in Korrelation zur LPS- Konzentration im Eluat die Chondrozyten und die extrazelluläre Matrix geschädigt wurden. Die Enzymproduktion von Kollagenase und Matrixmetalloproteinase war hierbei umgekehrt proportional zum Endotoxingehalt.
Beispiel 2:
Anwendungen von Nachweisverfahren zur Detektion von Antiköφern, die gegen die erfindungsgemäße Zusammensetzung gerichtet sind, zur Diagnostik.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann als Marker zur medizinischen Diagnostik von Bindegewebserkrankungen an Mensch und Tier angewendet werden. Er kann in dieser Funktion auch zur Therapiekontrolle angewendet werden. Auch hygienische Untersuchungen beispielsweise des Wohn- und Arbeitsumfeldes im Hinblick auf bakterielle Besiedelung oder Schimmelpilzbesiedelung und in diesem Zusammenhang die Kontamination mit Endotoxinen sowie im Bedarfsfall Maßnahmen zu deren Beseitigung spielen im Rahmen von Therapiekonzepten eine wichtige Rolle.
Der Einsatz der beschriebenen Antigene als Marker erfolgt vorzugsweise im üblichen diagnostischen Verfahren, wie Immuno-Assays, Blotting-Verfahren, biosen- sorischen Verfahren oder vergleichbaren Verfahren. Dadurch, dass das antigene Markermolekül oder dessen Modifikationen (beispielsweise Modifikationen zur Verbesserung der Beschichtungseffizienz) in entsprechenden Bindungstests, bei- spielsweise Immuno-Assays eingesetzt wurden. Es kann direkt adsoφtiv an die Oberflächen geeigneter hochadsorbierender Mikrotiter-Platten gebunden werden. Nach entsprechenden Verfahren zur Blockierung und zum Coating-Schutz, wie sie im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, erfolgt der Assay, wobei verdünnte Seren oder Plasmaproben im Assay eingesetzt werden. Autoantiköφer, die bei spezifisch betroffenen rheumatischen Patienten in entsprechendem Titer vorhanden sind, binden an das immobilisierte Antigen. Die Signalerzeugung erfolgt nach dem Stand der Technik bekannten Methoden mit Enzym markierten (häufig Meerrettichperoxidase), Antihuman-IgG (ggf. auch IgM oder IgA)-Antiköφem aus Kaninchen, Schaf oder Ziege. Die endgültige Signalerzeugung findet über die enzymatische Bildung eines Chromogens statt. Ein häufig verwendetes Substrat ist das Tetramethylbenzidin-Substrat. Die Auswertung erfolgt bei 450 nm einem ELISA-Photometer nach Abstoppen der Reaktion mit verdünnter Schwefelsäure.
Zur Kalibrierung werden spezifische und hochtitrige Autoantiköφer eines Patien- tensemms (spezifisch erkrankter Patient) oder eines Pools von mehreren Patienten-Seren verwendet. Die Konzentration bzw. der Titer der spezifisch gerichteten Autoantiköφer in den einzelnen Kalibrations-Seren ist durch die Herstellung geeigneter Verdünnungen so einzustellen, dass eine geeignete Standardkurve erzielt wird. Die Einstellung des Cut-Off- Wertes zur Diskriminierung zwischen normalen und pathologischen Werten erfolgt durch Messung und Auswertung von Seren- oder Plasmakollektiven von spezifisch erkrankten Patienten und Kontrollprobanden. Der Cut-Off- Wert wird auf der Basis dieser Messungen durch statistische Aus- wertung berechnet. Das beschriebene diagnostische Verfahren ist bei rheumatischen Erkrankungen, die mit inkoφorierten Endotoxinen im Zusammenhang stehen, indiziert. Erhöhte Titer an spezifischen Autoantiköφern indizieren rheumatische Erkrankungen, die häufig durch bisher verwendete Laboruntersuchungen, wie beispielweise der Messung des bekannten Rheumafaktors, nicht erfasst wer- den können. Die Diagnostik erfasst demnach weitere spezifisch erkrankte Patienten und verbessert und ergänzt alleine dadurch die etablierte Labor-Diagnostik. Des weiteren ist nach erfolgter positiver Diagnose eine hygienische Analytik des Wohn- und Arbeitsumfeldes möglich, die eine Eliminierung auslösender Faktoren, insbesondere Endotoxine bzw. die Ursachen für die Existenz dieser Endoto- xine beseitigt.
Der Test kann in diesem Zusammenhang zur Therapiekontrolle eingesetzt werden. Einerseits zur Kontrolle einer Behandlung, andererseits zur Kontrolle der erörterten Beseitigung der möglichen Ursachen, also Endotoxin-Belastungen des Umfel- des.
Beispiel 3:
Anwendungen von Nachweisverfahren des Markers und dessen Modifikationen zur Diagnostik.
Neben den Autoantiköφern kann auch die Zusammensetzung selbst, insbesondere das Endotoxin oder der Endotoxin-Prokollagen-Komplex im Serum nachgewiesen werden. Der Nachweis der Autoantiköφer ist jedoch bevorzugt. Das Antigen selbst kann in einem üblichen Verfahren wie in einem Immuno- Assay nachgewiesen werden. Darüber wird das Antigen vorzugsweise in einem Sandwich-ELISA nachgewiesen. Gmndlage sind zwei, vorzugsweise verschiedene Antiköφer, die durch Immunisiemng mit der Zusammensetzung, vorzugsweise an Endotoxin-Prokollagen-Komplex nach Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen werden. In einem ELISA, der als eine bevorzugte Methode zur Anwendung kommen kann, wird einer der beiden Antiköφer in einem bevorzugten Verfahren zur Beschichtung verwendet, während der andere mit einem Markerenzym gekoppelt wird. Die Kopplungsmethoden sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Dieses Verfahren kann alternativ oder ergänzend zur Autoantiköφerbestimmung eingesetzt werden. Ebenso, wie in Beispiel 3, sind auch veterinärmedizinische Untersuchungen möglich. Auch relevante Strukturen bzw. Antigene aus Zellkultu- ren lassen sich mit der hier beschriebenen Erfindung nachweisen.

Claims

Patentansprüche
1. Zusammensetzung enthaltend: (i) wenigstens eine zur Bindung an einen Pathogen associated molecular patterns (PAMP) -Rezeptor fähige Substanz; und (ii) wenigstens ein trihelikales Faseφrotein, ein Fragment oder eine Variante davon.
2. Zusammensetzung gemäß Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ein bakterielles, myko- bakterielles oder von Pilzen stammendes PAMP ist.
3. Zusammensetzung gemäß Anspmch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ausgewählt ist aus Lipopolysacchariden (LPS), Lipoteichonsäure, wandspezifischen Proteogly- kane, Bakterienzellfragmenten, für Mikroorganismen spezifische, nicht- methylierte DNA-Abschnitte, Lipoproteine, N-formylierte Peptide, pilzspezifische Peptidoglykane, Mycolsäure oder Mycolsäureester, Fragmente, Varianten oder Konjugate davon, wobei die Fragmente, Varianten oder Konjugate davon, wenigstens 50 % der Bindungsfähigkeit von LPS aus E. coli an den Scavenger-Rezeptor SR-AI aufweisen.
4. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ein Lipopolysaccharid (LPS), ein Fragment oder eine Variante davon ist, wobei das Fragment oder die Variante ein phosphoryliertes N-acetylglucosamin- Dimer, vorzugsweise einen Lipid-A-Komplex enthält.
5. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, dass das PAMP das Lipopolysaccharid (LPS) aus den Bakterien Salmonella, Shigella, E. coli, Pseudomonas, Neisseria, Klebsieila oder Hae- mophilus ist.
6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, dass das PAMP aus Actinomycetales, Aspergillus, Botrytis, Cla- dosporium, Eurotium, Penicillum, Wallemia, Chaetomium, Mucor, oder Sco- pulariopsis stammt.
7. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- zeichnet, dass das trihelikale Faseφrotein ausgewählt ist aus Kollagen, Prokollagen, Tropokollagen, Elastin, Fibrillin, Fibronectin, Scavengerrezeptoren oder anderen kollagenen Bestandteilen, Synthesevorstufen, Fragmente oder Konjugate der vorstehenden Komponenten.
8. Zusammensetzung gemäß Anspmch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen aus Kollagen Typ I, II, III, V und IX ausgewählt ist.
9. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das trihelikale Faseφrotein Prokollagen, Fragmente oder Vari- anten davon bedeutet.
10. Zusammensetzung gemäß Anspmch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment oder die Variante wenigstens 50 % der Bindungsfähigkeit von humanem Prokollagen an LPS aus E. coli und/oder wenigstens 60 % homolog zur Aminosäuresequenz von humanem Prokollagen ist.
11. Zusammensetzung gemäß Anspmch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Variante ein Mutein ist, das sich durch die Addition, Substitution, Deleti- on, Insertion oder Inversion wenigstens einer Aminosäure, vorzugsweise von höchstens 5 Aminosäuren von der Aminosäuresequenz von humanem Prokollagen unterscheidet.
12. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment oder die Variante des trihelikalen Faseφroteins eine zur Ausbildung eines Cysteinknotens geeignete Sequenz, vorzugsweise die Sequenz GlyProCysCysGly (SEQ ID NO: 1), aufweisen.
13. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennn- zeichnet, dass das Fragment oder die Variante des trihelikalen Faseφroteins das N- und/oder C-terminale Ende und gegebenenfalls einen Teil des Telo- mers des trihelikalen Faseφroteins enthalten.
14. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ein bakterielles Endotoxin, vorzugsweise LPS und das trihelikale Faseφrotein Tropokollagen, Prokollagen oder Kollagen I, II, III, V oder IX ist.
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung femer Chondrozyten, Fibrozyten, Oste- ozyten, retikulo-endotheliale Zellen, Endothelzellen, vorzugsweise Chondro- zyten, oder Bestandteile davon enthält.
16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile (i) und (ii) nicht-kovalent miteinander verbunden sind.
17. Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 umfassend das Inkontaktbringen der Komponente (i) mit der der Komponente (ii) und gegebenenfalls Aufreinigen oder Isolieren der Zusammensetzung.
18. In vitro Verfahren gemäß Anspmch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines eine Komponente (i) nach einem der Ansprüche 1 bis 16 enthaltenden Bakterien- oder Pilz-Eluates; b) Bereitstellen einer wachstumsangeregten Chondrozytenkultur; c) Inkontaktbringen des Bakterien- oder Pilz-Eluates mit der Chondrozytenkultur; und d) gegebenenfalls Aufreinigen der Zusammensetzung.
19. In vitro Verfahren gemäß Anspmch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Pilz-Eluat aus Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Eurotium, Penicillum, Wallemia, Chaetomium, Mucor, oder Scopulariopsis stammt.
20. In vitro Verfahren gemäß Anspmch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterieneluat aus Actinomycetales, Salmonella, Shigella, E. coli, Pseudomo- nas, Neisseria, Klebsiella oder Haemophilus stammt.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufreinigen das Durchführen eines chromatographischen Verfahrens, einer Zentrifugation, Ultrafiltration oder Gel-Elektrophorese umfasst.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und wenigstens einen pharmakologisch ver- fraglichen Träger, vorzugsweise als Vakzin.
23. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Bindegewebserkrankungen oder Erkrankungen des Bewegungsapparates, vorzugsweise Arthrose, Weichteil- rheuma, Fibromyalgie, rheumatische Erkrankungen oder rheumatische Autoimmunreaktion.
24. Test-Kit zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen enthaltend die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
25. Verfahren zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen umfassend das Nachweisen von Autoantiköφern durch Inkontaktbringen mit einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 und Nachweisen der Bindung.
26. Reagenz, das an wenigstens eine Komponente der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bindet, vorzugsweise für die Zusammensetzung spezifisch ist.
27. Reagenz gemäß Anspmch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz ein Antiköφer ist, vorzugsweise ein monoklonaler oder polyklonaler Antiköφer.
28. Reagenz gemäß Anspmch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper mit einem zur Detektion geeigneten Marker konjugiert ist.
29. Zusammensetzung enthaltend einen ersten Bindungspartner, der an die Komponente (i) bindet, und/oder einen zweiten Bindungspartner, der an die Komponente (ii) bindet.
30. Zusammensetzung gemäß Anspmch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Bindungspartner für die Komponente (i) und der zweite Bindungspartner für die Komponente (ii) spezifisch ist, vorzugsweise ist der erste und der zweite Bindungspartner ein Antiköφer.
31. Zusammensetzung gemäß Anspmch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Bindungspartner ausgewählt ist aus LAL, Transferrin, HDL, LDL, Apolipoproteine, C-reaktives Protein, CRl, CR3, CD14, Scavenger- Rezeptoren, CD 18, Ganglioside, Lectin-ähnliche Rezeptoren, Polysaccharid- Rezeptoren, bactericidal/permeability increasing protein (BPI), cationic anti- microbial proteins (CAP), und LPS-bindendes Protein (LBP), sowie lösliche Varianten der genannten Faktoren.
32. Zusammensetzung gemäß Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Bindungspartner ausgewählt ist aus Komponente (ii) nach einem der Ansprüche 1 bis 16, vorzugsweise Prokollagen, Tropokollagen, Kollagen, Synthesevorstufen, Fragmente oder Varianten davon.
33. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 32 und einen pharmakologisch verträglichen Träger.
34. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 32 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Bindegewebserkrankungen oder Erkrankungen des Bewegungsapparates, vorzugsweise Arthrose, Weichteilrheuma, Fibromyalgie, rheumatischer Erkrankungen und rheumatischer Autoimmunreaktion.
35. Test-Kit zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen enthaltend das Reagenz nach einem der Ansprüche 26 bis 28 und/oder die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 32.
36. Verfahren zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen umfassend das Nachweisen der Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 durch Inkontaktbringen mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 32, vorzugsweise in Blut oder Serum und Nachweisen der Bindung.
37. Verwendung der Komponente (ii) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Neutralisierung von Endotoxinen in Individuen, vorzugsweise zur Prophylaxe einer Autoimmunreaktion.
38. Verwendung gemäß Anspmch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (ii) ausgewählt ist aus Kollagen, Prokollagen, Tropokollagen, Synthesevorstufen, Fragmenten oder Varianten davon.
39. Verwendung gemäß Ansprach 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung zur Prophylaxe von Bindegewebserkrankungen oder Erkrankungen des Bewegungsapparates, vorzugsweise Arthrose, Weichteilrheuma, Fibromyalgie, rheumatischer Erkrankungen und rheumatischer Autoimmunreaktion durchgeführt wird.
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