DE69728760T2

DE69728760T2 - Rezeptor für nicht-derivatisiertes, wasser-lösliches beta-(1,3)-glucan

Info

Publication number: DE69728760T2
Application number: DE69728760T
Authority: DE
Inventors: Eric Wakshull; M. William MACKIN; Janet Zimmermann
Original assignee: Alpha Beta Technology Inc
Current assignee: Biopolymer Engineering Inc
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2005-03-31
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: KR20000065194A; US6110692A; ES2223079T3; AU718650B2; EP0900379B1; DE69728760D1; ATE265046T1; JP3920349B2; JP2000512004A; CA2253257A1; AU3117197A; EP0900379A1; KR100561660B1; WO1997041439A1; CA2253257C; US6630310B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (auch als PGG-Glucan oder Betafectin^® bekannt) ist ein neues und einzigartiges lösliches β-Glucan, das durch ein patentrechtliches Verfahren geschützt ist. Die biologische Aktivität dieses Moleküls ist deutlich unterscheidbar von partikulären oder anderen löslichen β-Glucanen. Zahlreiche Laboratorien haben über die direkte Induktion von Stoffwechselprodukten der Arachidonsäure (Czop et al., J. Immunol. 141(9): 3170–3176 (1988)), Zytokinen (Abel und Cszop, Intl. J. Immunopharmacol. 14(8): 1363–1373 (1992); Doita et al., J. Leuk. Biol. 14(2): 173–183 (1991)) und oxidativen Brüchen (Cain et al., Complement 4: 75–88 (1987); Gallin et al., Int. J. Immunopharmacol. 14(2): 173–183 (1992)) durch sowohl partikuläre als auch lösliche Formen von β-Glucanen berichtet. Im Gegensatz dazu aktiviert nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan nicht direkt Leukozytenfunktionen, wie die oxidative Bruchaktivität (Mackin et al., FASEB J. 8: A216 (1994)), Zytokinsekretion (Putsiaka et al., Blood 82: 3695–3700 (1993)) oder Vermehrung (Wakshull et al., J. Cell. Biochem. suppl. 18A22 (1994)). Anstatt dessen aktiviert nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan Zellen durch sekundäre Stimuli (Mackin et al., (1994); Brunke-Reese und Mackin, FASEB J. 8: A488 (1994); und Wakshull et al. (1994)).
Die biologische Aktivität von β-Glucanen wird durch spezifische Rezeptoren, die sich auf Zielzellen befinden, vermittelt. Verschiedene Untersuchungsgruppen haben Rezeptoren beschrieben, die partikuläre β-Glucanpräprate binden. Zum Beispiel sind Rezeptoren für partikuläre β-Glucane (z. B. Zymosan-ähnliche Teilchen) von Czop und Kollegen (Czop und Kay, J. Exp. Med. 173: 1511–1520 (1991); Szabo et al., J. Biol. Chem. 270: 2145–2151 (1995)) und Goldmann (Immunology 63(2): 319324 (1988); Exp. Cell. Res. 174(2): 481–490 (1988)) beschrieben worden. Vom Leukozyten-Komplementrezeptor 3 (CR3, auch als MAC 1 oder CD11b/CD18 bekannt) wurde gezeigt, daß er die Fähigkeit aufweist, sowohl Teilchen als auch lösliche β-Glucane sowie Polysaccharide zu binden (Thornton et al., J. Immunol. 156: 1235–1246 (1996)). von einem löslichen aminierten β-Glucanpräparat wurde gezeigt, daß es murine peritoneale Makrophagen bindet (Konopski et al., Biochim. Biophys. Acta 1221: 61–65 (1994)), und von einem phosphorylierten β-Glucanderivat wurde berichtet, daß es Monozytenzellinien bindet (Muller et al., J. Immunol. 156: 3418–3425 (1996)). Die Fähigkeit von Lachsmakrophagen (Engstad und Robertsen, Dev. Comp. Immunol. 18(5): 397–408 (1994)) und hirnmikrolialen Zellen (Muller et al., Res. Immunol. 145: 267–275 (1994)) β-Glucanteilchen zu phagozytieren, vermutlich durch ein Rezeptor-vermitteltes Verfahren, wurde ebenfalls beschrieben.
Leider hat jede Gruppe β-Glucanpräparate eingesetzt, die sich in ihrer Quelle, dem Herstellungsverfahren, der Reinheit und der Charakterisierung stark unterscheiden. Darüber hinaus wurden verschiedene Zelltypen und Arten, sowohl primäre als auch etablierte Zellinien, und verschiedene funktionale Ablesungen verwendet. Die Beziehung zwischen den verschiedenen Rezeptoren, die durch diese Untersucher beschrieben worden sind, wurde daher nicht definiert, obwohl klar ist, daß der von Czop beschriebene Rezeptor nicht CR3 ist (Szabo et al. (1995)).
EP 133 170 richtet sich auf eine Zusammensetzung, die ein Lactosederivat umfaßt, zur therapeutischen oder diagnostischen Verwendung bei durch Bakterien verursachten Erkrankungen, Behandlungsverfahren unter Verwendung dieser Zusammensetzung, Verfahren zur Durchführung von Desinfektion unter Verwendung der Zusammensetzung und Verfahren zur Reinigung von Akzeptorstrukturen von Bakterien.
US 5,242,800 richtet sich auf Lactosylceramid und die Verwendung als Rezeptor, der pathogene Fungi bindet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Ermittlung, daß nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan spezifisch an einen neuen Rezeptor bindet, der auf humanen Leukozytenmembranen (HLM) vorhanden ist. Ein radioaktiv markiertes nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches α(1-3)-Glucan wurde, wie hier beschrieben, verwendet, um die Bindung dieses α(1-3)-Glucans an Membranrezeptoren, die von humanen Leukozyten sowie verschiedenen murinen und humanen Zellinien abstammen, zu messen. Der Rezeptor des nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucans zeigt spezifisches und sättigungsfähiges Binden an Membranen und ist sehr selektiv für eine Subklasse von löslichen β-Glucanen. Die Ergebnisse der hier beschriebenen Arbeit charakterisieren diesen Rezeptor von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und unterscheidet ihn deutlich von zuvor beschriebenen β-Glucanrezeptoren von entweder partikulären oder löslichen β-Glucanen, wobei wichtige Informationen über den Mechanismus der nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucan biologischen Aktivität offenbart wird.
Es wurde festgestellt, daß die Aktivität des Rezeptors von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan durch Bindung eines nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucans aktiviert wird, wobei ein Signaltransduktionsprozeß aktiviert wird, so daß ein oder mehrere transkriptionale Regulationsfaktoren (z. B. der NF-κB, NF-IL6 oder jun/fos Familien) aktiviert werden. Andere Signaltransduktionswege, die durch das erfindungsgemäße Verfahren verändert werden können, umfassen den ras/raf-1/MAP-Kinaseweg, den G-Protein/Phospholipase C/Proteinkinase C Weg, den JAK/STAT-Weg, den Phospholipase-A-Weg, den G-Protein/Phospholipase D/Phosphathidinsäure-Weg und den c-AMP-abhängigen Weg. Bei jedem Weg wird ein geeigneter Aktivator oder Indikator des Signalweges durch Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor aktiviert, und die Modulierung dieser Bindung kann die entsprechende Signaltransduktion ändern. Die Aktivierung dieser transkriptionalen Regulationsfaktoren kann eingesetzt werden, um die Aktivität des damit verbundenen Signaltransduktionsweges zu messen. Die Aktivierung des Rezeptors kann unter anderem eine Änderung in der Rezeptorbildung, der Bildung eines Liganden-Rezeptor-Komplexes oder eine Änderung des Liganden-Rezeptor-Komplexes umfassen. Alternativ kann die Aktivität des Rezeptors durch ein Mittel ausgelöst werden, das die Bindungs- und Aktivierungsfähigkeit eines nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucans nachahmt. In einer bestimmten Ausführungsform wird der transkriptionale Regulationsfaktor als Folge der Ligandenbindung aktiviert. In einer anderen Ausführungsform wird durch Bindung eines Mittels an den Rezeptor die Aktivität des transkriptionalen Regulationsfaktors entweder teilweise oder insgesamt verringert, (und folglich schließt nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan aus), wobei das Mittel den Rezeptor nicht aktivieren kann.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Test zur Identifizierung von Mitteln, die die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor verändern (z. B. erhöhen oder verringern). Das Assay umfaßt das Kombinieren von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan, dem Rezeptor von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, die für die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor geeignet sind. Der Grad der Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor in der Gegenwart eines zu testenden Mittels wird bestimmt und mit dem Grad der Bindung in Abwesenheit des zu testenden Mittels verglichen, wobei ein Unterschied im Bindungsgrad anzeigt, daß das Mittel die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor verändert. Ein Anstieg im Bindungsgrad in der Gegenwart des Mittels zeigt an, daß das Mittel die Bindung verstärkt, d. h. verlängert oder erhöht, oder ein Agonist des Rezeptors von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan ist. Eine Verringerung des Bindungsgrades in der Gegenwart des Mittels zeigt an, daß das Mittel die Bindung vermindert, d. h. verkürzt oder verringert, oder ein Antagonist des Rezeptors von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan ist. Die Erfindung betrifft außerdem Mittel, die durch die hier beschriebenen Tests identifiziert wurden und infolgedessen betrifft Agonisten und Antagonisten der nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucanaktivität.
Die Erfindung betrifft auch ein neues Assay zum Identifizieren von Mitteln, die die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf zelluläre Signaltransduktionswege verändert (z. B. erhöht oder verringert), wie Aktivierung von transkriptionalen Regulationsfaktoren. Dieser Test umfaßt das Kombinieren von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan, dem Rezeptor von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, unter denen die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor auftritt (d. h. Bedingungen, die sich für die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an den Rezeptor von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan eignen). Die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor aktiviert den Rezeptor, was wiederum eine Signaltransduktion aktiviert, die durch Modulierung einer oder mehrerer transkriptionaler Regulationsfaktoren, wie die der NF-κB, NF-IL6 oder jun/fos Familien, dargestellt oder gemessen wird. Der Grad der Aktivierung des ausgewählten transkriptionalen Regulationsfaktors in der Gegenwart eines zu untersuchenden Mittels wird bestimmt und mit dem Grad der Aktivierung des ausgewählten transkriptionalen Regulationsfaktors in der Abwesenheit des zu testenden Mittels untersucht, wobei eine Differenz in dem Grad der Aktivierung anzeigt, daß das Mittel die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf eine Aktivierung des transkriptionalen Regulationsfaktors hin verändert. Ein Anstieg in der Aktivierung des transkriptionalen Regulationsfaktors in der Gegenwart des Mittels deutet darauf hin, daß das Mittel die Aktivierung verstärkt, d. h. verlängert oder erhöht. Eine Verringerung der Aktivierung des transkriptionalen Regulationsfaktors in der Gegenwart des Mittels deutet darauf hin, daß das Mittel die Aktivierung vermindert, d. h. verkürzt oder verringert.
Die erfindungsgemäßen Tests und Verfahren können verwendet werden, um Mittel und Medikamente zu identifizieren, die zur Behandlung von einer infektiösen Erkrankung, Entzündung, Autoimmunerkrankungen, Ischämie, Reperfusionsschaden, Krebs, Asthma und Hypersensitivitätsstörungen verwendet werden. Die hier beschriebenen Tests und Verfahren können auch verwendet werden, um Medikamente zu identifizieren, die die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan verlängern, und können daher bei jeder therapeutischen oder prophylaktischen Anwendung eingesetzt werden, bei der nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan verwendet wird, wie bei der Immunmodulierung, Hämatopoese, Verhinderung und Behandlung von infektiöser Erkrankung, Blutplättchenbildung, peripherer Blutvorläufer-Zellmobilisierung und Wundenheilung. Diese Mittel oder Medikamente verstärken die Wirkungen von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan durch zum Beispiel Verlängerung der Bindung des Glucans an seinen Rezeptor oder die Wirkungen davon.
Mittel oder Medikamente, wie Peptide oder kleine organische Moleküle, die aber nicht darauf eingeschränkt sind, können unter Bezugnahme auf die Bindungsstelle von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an den Rezeptor von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan entworfen werden. In einer Ausführungsform können solche Mittel oder Medikamente so entworfen werden, die Aktivität der Rezeptorbindungsstelle nachzuahmen, indem sie nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan binden, wodurch die Menge des β(1-3)-Glucans, das für die Bindung an den Rezeptor verfügbar ist, verringert wird und die Aktivität von nachfolgenden Vorkommnissen, wie der Signaltransduktion, verringert werden. Ein Agonist kann nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanaktivität in Bezug auf seine Bindung und der Aktivierung des Rezeptors von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan nachahmen. Alternativ kann das Medikament oder Mittel so entworfen werden, daß es die Rezeptorbindungsstelle bindet, wodurch sie nicht verfügbar ist für die Bindung durch nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan, und kann als Antagonist der nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucan-Bindungsaktivität wirken.
Die hier beschriebene Arbeit hat auf viele Gebiete Anwendung. Zum Beispiel kann sie verwendet werden, um das Herstellungsverfahren von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und die Produktcharakterisierung zur kommerziellen Freigabe zu verfolgen, um β-Glucane in Flüssigkeiten zu messen, Strukturaktivitätsbeziehungen von Mitteln zu untersuchen und bestimmen, die mit dem Rezeptor von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan interagieren. Darüber hinaus hat die Arbeit Anwendung auf die Zielzufuhr von verschiedenen Mitteln, einschließlich Medikamenten und kleinen Molekülen, zu rezeptorpositiven Zellen, wie peripheren polymorphonuklearen Leukozyten, Monozyten, Makrophagen und epithelialen Zellen. Die hier beschriebenen Ergebnisse können auch bei Reinigungsschemen verwendet werden, um sowohl rezeptorpositive als auch rezeptornegative Zellen anzureichern, sowie bei der Herstellung von Anti-Rezeptor-Antikörpern für diagnostische Zwecke.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist eine graphische Darstellung des Zeitverlaufs der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an humane Leukozytenmembranen. Die Gesamtbindung wird angezeigt durch eine kontinuierliche Linie mit geschlossenen Kreisen, und die nichtspezifische Bindung wird angezeigt durch eine gestrichelte Linie mit offenen Quadraten. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Proben dar.
2A und 2B zeigen eine graphische Darstellung der Konzentrationsabhängigkeit der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an humane Leukozytenmembranen. 2A zeigt die Gesamtbindung (kontinuierliche Linie, geschlossene Kreise), nichtspezifische Bindung (gestrichelte Linie, offene Quadrate) und spezifische Bindung (gestrichelte Linie, offene Rhomben) verschiedener Konzentrationen von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Proben dar. 2B zeigt eine Scatchard-Analyse der Bindungsdaten.
3 ist ein Graph der Wirkung der Inkubationstemperatur auf die Bindung von radioaktiv markiertem β(1-3)-Glucan an humane Leukozytenmembranen. Die Gesamtbindung wird durch den schattierten Block angezeigt und die nichtspezifische Bindung wird durch den offenen Block angezeigt. Die Daten sind ausgedrückt als Prozentwert der Gesamtbindung bei 37°C, und die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Proben dar.
4 ist ein Autoradiogramm des Zeitverlaufs der NF-κB Aktivierung durch nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan in der murinen Makrophagenzellinie BMC2.3 im Vergleich mit einer Kontrolle und Lipopolysaccharid. Die Bahn für NF-κB ist mit einem Pfeil angezeigt.
5 ist ein Autoradiogramm des Zeitverlaufs der NF-IL6 Aktivierung durch nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan in der murinen Makrophagenzellinie BMC2.3 im Vergleich mit der Kontrolle. Die Bahn für NF-IL6 ist mit einem Pfeil angezeigt.
6 ist ein Diagramm der Wirkung der Exoglucanasebehandlung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf kompetitive Bindung.
7 ist ein Diagramm der Wirkung der NaOH-Behandlung auf die Fähigkeit von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan mit der Bindung zu kompetitieren.
8 ist ein Diagramm der Wirkung der Behandlung von humanen Leukozytenmembranen mit Glycin/pH 3,5 oder 1 M NaCl auf die Bindung. Die gefüllten Säulen zeigen die Kochsalzkontrolle an, gepunktete Säulen zeigen nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanprobe an.
9 ist ein Diagramm der Wirkung der Vorbehandlung von humanen Leukozytenmembranen auf die Bindung mit CHAPS. Gefüllte Säulen zeigen die Kochsalzkontrolle an, gepunktete Säulen zeigen die nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanprobe an. Offene Säulen zeigen die Dextranprobe an.
10 ist ein Diagramm der Wirkung der Behandlung von humanen Leukozytenmembranen mit 2-Mercaptoethanol auf die Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an Membranen. Gefüllte Säulen zeigen die Kochsalzkontrolle an, gepunktete Säulen zeigen die nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanprobe an.
11 ist ein Diagramm der Wirkung von Chloroform/Methanol/HBSS Extraktion von humanen Leukozytenmembranen auf die Bindung.
12 ist ein Diagramm der Wirkung der Natriumperiodat-Vorbehandlung von humanen Leukozytenmembranen auf die Bindungsaktivität.
13 ist ein Diagramm der Wirkung der Natriumperiodat-Vorbehandlung von teilweise Protein-abgereicherten humanen Leukozytenmembranen auf die Bindungsaktivität.
14 ist ein Diagramm des Vergleichs der Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und einzelner Helixkompetition von ³H-nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan in drei Assayformaten. Nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan oder einzelnes Helixglucan wurde in angezeigten Konzentrationen verwendet, um mit der ³H-nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucanbindung an Lactosylceramid (LacCer) in einer Platte mit 96 Vertiefungen (Dreiecken) oder an Lactosylceramid in rekonstituierten Membranen (Quadraten) oder an humane Leukozytenmembranen (Kreise) zu kompetitieren. Offene Symbole stellen nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan dar und geschlossene Symbole stellen die einzelne Helix dar. Die maximale Kompetition wurde bei der höchsten Konzentration von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan, das als Kompetitor in jedem Assaytyp verwendet wurde, angesehen.
15 ist eine graphische Darstellung von Daten, die zeigen, daß nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan und nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan mit hohem Molekulargewicht (Network) effektiver kompetitieren für die ³H-nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanbindung an Lactosylceramid in einem Test mit einer Platte mit 96 Vertiefungen als es die einfache Helix oder Laminarin tun. Nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (Kreise), die einfache Helix (gefüllte Quadrate), Laminarin (Kreuze) und nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan mit hohem Molekulargewicht (Network) (gestrichelte Quadrate) wurden in angezeigten Konzentrationen, um mit der Bindung von ³H-nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an Lactosylceramid (Rind) in einem Test mit einer Platte mit 96 Vertiefungen zu konkurrieren. "%-Kontrollbindung" bedeutet der Prozentsatz der Bindung mit keinem Kompetitor.
16A und 16B sind Fotographien, die zeigen, daß nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan die nuklearen Transkriptionsfaktoren NF-κB und NF-IL6 in humanen Neutrophilen aktiviert. 16A zeigt die Ergebnisse des nuklearen Transkriptionsfaktors NF-κB. 16B zeigt die Ergebnisse des nuklearen Transkriptionsfaktors NF-IL6. Beide Male wurden gereinigte humane Neutrophile mit oder ohne nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan (3 μg/ml) oder Dextran (3 μg/ml) 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nukleare Extrakte wurden hergestellt und die Protein/DNA-Komplexbildung wurde durch das elektrophoretische Mobilitätsshiftassay (EMSA) untersucht. Nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches α(1-3)-Glucan erhöhte die Bindung des nuklearen Extraktproteins an eine NF-κB oder NF-IL6 spezifische ³²P-markierte Oligonukleotidsonde im Verhältnis zu Extrakten entweder der Kontrolle oder von Dextran behandelten Neutrophilen. Der horizontale Pfeil zeigt die Richtung des Protein/DNA-Komplexes an.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Ermittlung, daß nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (siehe WO-A-94/4163, deren Lehre hier durch Referenz eingeschlossen ist) spezifisch an einen neuen Rezeptor bindet, der sich auf humanen Leukozytenmembranen (HLM) befindet. Nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucane sind auch in den US-Patenten Nr. 5,322,841, 5,488,040 und 5,532,223 beschrieben. Die Ergebnisse der hier beschriebenen Arbeit charakterisieren den Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (auch als PGG-Glucan bekannt) und unterscheidet ihn deutlich von zuvor beschriebenen α-Glucanrezeptoren, wobei wichtige Informationen des Mechanismus der nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucan biologischen Aktivität geliefert werden.
Der Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan befindet sich primär in humanen Blutzellen, genauer gesagt den Neutrophilen und mononuklearen Leukozyten (Monozyten und Lymphozyten). Es ist hier beabsichtigt, daß "Rezeptor" ein traditionelles Rezeptormolekül sowie eine Bindungsstelle einschließt, wobei eine solche Bindungsstelle selbst eine Wirkung aufweisen kann oder ein zweites Molekül oder eine zweite Bindungsstelle induzieren oder aktivieren kann, um eine Wirkung zu erzeugen (auch als "Freigeben der Maskierung" ("unmasking") einer zweiten Stelle bekannt; Sandberg et al., Infect. Immun. 63(7): 2625–2631 (1995)). Es ist beabsichtigt, daß hier "Rezeptor" Verbindungen einschließt, die eine Affinität für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan haben, wobei diese Verbindungen Rezeptornachahmungen oder Rezeptoranaloga sein können und aus einer in der Natur vorkommenden Quelle isoliert werden können oder chemisch oder synthetisch erzeugt werden können. Der Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan entfaltet Selektivität für β(1-3)-Glucane und insbesondere für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan in der Dreifachhelixbildung.
Eine Vielzahl von Polysacchariden wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, mit der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan zu kompetitieren. Der Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan unterscheidet β(1-3)-Glucane von nicht-β(1-3)-Glucanen, wie Dextran, Mannan, Glycogen und Lipopolysaccharid (LPS) (Tabelle 1). Die nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanprobe stellt eine nichtspezifische Bindung dar. Aminiertes Glucan wurde hergestellt durch reduktive Aminierung von Curdlan und von Dr. Rolph Seljelid (University of Tromsø, Tromsø, Norwegen) bereitgestellt. Für die Exoglucanaseprobe wurde nichtmarkiertes, nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan mit Exoglucanase behandelt und anschließend verwendet, um mit der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan zu kompetitieren. Der Anti-Idiotyp-Antikörper war ein monoklonaler Anti-Idiotyp-Antikörper vom Kaninchen, der gegen einen monoklonalen Anti-Laminarin-Antikörper der Maus entwickelt wurde (Czop et al., J. Immunol. 145(3): 995–1001 (1990)). Die Beobachtung, daß die β(1-3)-Glucane, Laminarin und aminiertes Glucan nicht die Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an den Rezeptor, der sich auf humanen Leukozytenmembranen befindet, inhibieren, deutet auf Selektivität unter dieser Gruppe von Polysacchariden hin.
Tabelle 1
Nichtmarkiertes, nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (1 mg) wurde mit 0,13 Einheiten 1,3-Exoglucanase (teilge reinigt aus Penicillium pinophilum) bei 50°C über Nacht entweder vor oder nach einer Wärmeinaktivierung des Enzyms behandelt. Humane Leukozyten wurden anschließend mit radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan in der Gegenwart oder Abwesenheit von nichtmarkiertem, nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan (0,2 mg/ml) inkubiert. Als Kontrolle wurde Exoglucanase zu der Bindungsreaktion in der Abwesenheit von nichtmarkiertem, nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan gegeben. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
Nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (1 mg/ml) wurde mit 1 M NaOH 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, anschließend auf 0,1 mg/ml verdünnt. Gelpermeationschromatographie-isolierte Fraktionen, enthaltend nicht zusammengefügtes, nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan wurden untersucht auf die Kompetition mit der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan. Sowohl nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan als auch nicht zusammengefügtes, nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan wurden bei 23 μg/ml in dem Bindungsassay verwendet. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Humane Leukozytenmembranen wurden auf Eis 1 Stunde in der Gegenwart von HBSS, 0,1 M Glycin/pH 2,5 oder 1 M NaCl inkubiert, anschließend durch Zentrifugierung bei 180.000 × g 60 Minuten bei 4°C pelletiert, gewaschen und in dem Bindungsassay verwendet. Die Überstände der 180.000 × g Probe wurden auf den Proteingehalt (BCA-Reagens, Pierce) untersucht und zeigten, daß 12% und 20% des Gesamtproteins aus dem Salz- und Glycin-behandelten Membranen jeweils über der HBSS Kontrolle freigegeben wurde. Die Ergebnisse (in 8 gezeigt) zeigen, daß hoher Salzgehalt und niedriger pH nicht die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an humane Leukozytenmembranen ändert. Folglich ist die Bindung von Bedingungen nicht beeinträchtigt, die periphere Proteine entfernen, was darauf schließen läßt, daß die Bindungsstelle wahrscheinlich kein peripheres Protein ist.
Humane Leukozytenmembranen wurden in HBSS mit oder ohne 0,25% CHAPS 5 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von einer 45-minütigen Zentrifugierung bei 180.000 × g, 4°C. Die Pellets wurde in einem Bindungsassay mit nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan oder Dextran (durchschnittliches MW 71.000, Sigma Chemical Co., MO), wie angezeigt bei 1 mg/ml Endkonzentration, verwendet. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Ein ähnlicher Anstieg der spezifischen Bindung wurde mit dem Detergens Octyl glucosid festgestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Bindungsstelle wahrscheinlich Bereiche enthält, die mit dem hydrophoben Teil der Membranen verbunden sind.
Bindungstests wurden in der Gegenwart von 2-Mercaptoethanol bei Konzentrationen durchgeführt, die in 10 angezeigt sind (0, 0,1 und 1 M). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten wenn die gleichen Dithiothreitol (DTT) Konzentrationen verwendet wurden. Die hohen Konzentrationen des Reduktionsmittels, die erforderlich sind um die Bindung zu beeinträchtigen, deuten darauf hin, daß der Bindungsteil keine leicht verfügbare Disulfidbindung enthält, die für die Bindung wesentlich ist.
Humane Leukozytenmembranen wurden mit Chloroform/Methanol/HBSS (3 : 2 : 1) wie in den Beispiel beschrieben extrahiert. Die proteinreduzierte Fraktion wurde in einem Bindungsassay (Nicht-Öl/Sucrose-Verfahren) zusammen mit dem in 11 angezeigten Kompetitor, i. e. mit nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem α(1-3)-Glucan oder mit Dextran bei 1 mg/ml Endkonzentration verwendet. Diese Ergebnisse (in 11 gezeigt) deuten darauf hin, daß der Bindungsteil die Chloroform/Methanol-Behandlung überlebt.
Humane Leukozytenmembranen (500 μg Protein) wurden mit Natriumperiodat bei Konzentrationen, die in 12 angezeigt sind (10 und 100 mM) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend bei 12.000 × g 10 Minuten zentrifugiert, gespült und in einem Bindungsassay (Nicht-Öl/Sucrose; siehe 12) verwendet. Proteinabgereicherte Membranen (die aus 1,87 mg humanem Leukozytenmembranprotein abstammen) wurden in 0,1 M Natriumperiodat inkubiert und wie oben beschrieben behandelt (13).
Die Ergebnisse zeigen, daß der Rezeptor nicht durch Salz oder niedrige pH Vorbehandlung der Membranen beeinträchtigt ist und durch Detergensvorbehandlung der Membranen verstärkt wird. Die Bindungsaktivität ist durch Natriumperiodat-Behandlung und durch hohe Konzentrationen von Reduktionsmitteln vermindert. Darüber hinaus scheint die Bindungsstelle mit Chloroform/Methanol/Wasser extrahierbar zu sein. Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß die Bindungsstelle wahrscheinlich kein peripheres Protein ist und wahrscheinlich Bereiche enthält, die mit dem hydrophoben Teil der Membranen verbunden sind. Die Wirkung von Natriumperiodat auf die Bindung deutet darauf hin, daß das Membranziel für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan ein Glycokonjugat sein kann, was mit der Beobachtung übereinstimmt, daß der Bindungsteil eine Chloroform/Methanol-Behandlung überlegt. Der Kohlenhydratteil des Glycokonjugats kann mit einem Protein, einem Fett oder beidem als Glycokonjugatrezeptoren verbunden sein, d. h. als Glycofette oder Glycoproteine, die im Stand der Technik bekannt sind (Sandberg et al., Infect. Immun. 63(7): 2625–2631 (1995)).
Die Verteilung des Rezeptors für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan über verschiedene Zellinien und humane Gewebe wurde bestimmt durch Untersuchen der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an Membranen, die von einer Vielzahl von Zelltypen abstammen (siehe Tabelle 2). Die Menge der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan wird als Mittelwert ± Standardabweichung in ng/mg Membranprotein ausgedrückt. Die nichtspezifische Bindung wird definiert als radioaktiv markiertes nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan gebunden in der Gegenwart von mehr als einem 100-fachen Überschuß unmarkiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan. Die spezifische Bindung wird durch (Gesamtbindung)-(nichtspezifische Bindung) mit der Zahl in Klammern in Tabelle 2, die die prozentuale Gesamtbindung darstellt, bestimmt. Die Quantifizierung von Komplementrezeptor 3 (CR3) wurde durch Fließzytometrie unter Verwendung von Fluoreszenz-markiertem Anti-CD11b durchgeführt, und die Daten sind als Durchschnittskanalfluoreszenz (MCF) in arbiträren Fluoreszenzeinheiten ausgedrückt, wobei die Hintergrundfluoreszenz für Isotypkontrollen abgezogen wurde. Die Neutrophilprobe hatte gemäß Histologie mehr als 95% Neutrophile. Die mononukleare Zellprobe bestand gemäß Histologie aus ungefähr 40–50% Monozyten.
Der dominante Zelltyp, der in humanem peripheren Blut Rezeptoren exprimiert, ist das Neutrophil, wobei mononukleare Leukozyten (Monozyten und Lymphozyten) weniger als 20% der gemessenen Expression von Neutrophilen exprimieren. Die humane monozytische Zellinie U937 bindet keine nachweisbaren Mengen des radioaktiv markierten nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucans, wohingegen die murinen Makrophagenzellinien BMC2.3 (Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA), RAW264.7 (ATCC) und P388D(1) (ATCC) verschiedene Bindungsaktivitätsmengen exprimieren. Wenn diese drei Zellinien auf CR3 Expression durch Fließzytometrie untersucht wurden, wurde festgestellt, daß die P388D(1) Zelllinien ohne CR3 sind. Folglich gab es keine Wechselwirkung zwischen der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und der CR3 Expression. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung ist die Tatsache, daß CR3 stark in Blutmonozyten exprimiert wird, die gering radioaktiv markierte nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(3-3)-Glucan-Bindungsaktivität aufwiesen. Schließlich binden murine B- und T-Zellinien (jeweils LP27.4 und DO11) kein radioaktiv markiertes nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan.
Die Inkubation von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan (1 μg/ml) mit humanen Leukozytenmembranen (2 mg/ml) 60 Minuten bei entweder 37°C oder 22°C zeigte für das Auftreten der Bindung eine deutliche Abhängigkeit von der ambienten Temperatur (3). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten wenn die 22°C Inkubation 4 Stunden verlängert wurde oder wenn die Inkubation bei 4°C durchgeführt wurde, wohingegen nichtspezifische Bindung von der Temperatur nicht beeinträchtigt wurde.
Die Bindungsaktivität des radioaktiv markierten nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucans reagiert empfindlich auf eine β(1-3)-spezifische Exoglucanase, was darauf hindeutet, daß die Bindungsaktivität des Liganden ein β(1-3)-Glucan ist. Die Bindung wird jedoch nicht durch entweder Anti-Idiotyp-Antikörper von Czop (1990) oder den Anti-Komplement-Rezeptor-3 Antikörper (OKM1; Diamond et al., J. Cell Biol. 120: 1031–1043 (1993)) inhibiert. Diese Daten, zusammen mit dem Fehlen der Inhibierung durch aminiertes Glucan, deuten darauf hin, daß der Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan ein neuer Leukozyten-Kohlenhydrat-Rezeptor ist.
Der Zeitverlauf und die Konzentrationsabhängigkeit der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an humane Leukozytenmembranen wurde bestimmt durch Inkubieren von 1 μg/ml radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan mit 2,5 mg/ml humanen Leukozytenmembranen in der Gegenwart oder Abwesenheit von nichtmarkiertem, nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan (1.000 μg/ml) bei 37°C unterschiedliche Zeitintervalle lang. Gebundenes radioaktiv markiertes nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan wurde von nicht gebundenem Liganden getrennt durch Zentrifugierung über einen doppelschichtigen Dichtegradienten, und die Membranpellets wurden löslich gemacht und die Radioaktivität wurde bestimmt. Bindung im Gleichgewicht wurde nach 60 Minuten bei 37°C bei einer Konzentration von 1 μg/ml radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan erreicht (1).
Die Konzentrationsabhängigkeit der Bindung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an humane Leukozytenmembranen wurde bestimmt durch Inkubieren von 2,2 mg/ml humanen Leukozytenmembranen mit ansteigenden Konzentrationen an radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan in der Gegenwart (nichtspezifische Bindung) oder Abwesenheit (Gesamtbindung) eines 50-fachen Überschusses an nichtmarkiertem, nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan 60 Minuten bei 37°C. Membranverbundene Radioaktivität wurde bestimmt, gefolgt von der Zentrifugierung der Reaktionsmischung über einen Sucrose/Öl-Dichtegradienten, wie in den Beispielen beschrieben. Die spezifische Bindung wurde berechnet durch Subtrahieren der nichtspezifischen Bindung von der Gesamtbindung. Die Daten wurden durch lineare Regressionsanalyse auf die Gleichung B = B_max(S/(S + Km)) angepaßt, wobei B = radioaktiv markiertes nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan, B_max = maximale Bindung, S = Konzentration von radioaktiv markiertem, nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und Km = Konzentration von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan bei der Hälfte der maximalen Bindung. Die Sättigungsbindung wurde bei einer Konzentration von ungefähr 2,5 μg/ml erreicht (2A). Die Scatchard-Untersuchung (2B) ergab eine scheinbare Affinität von 1 nM und eine maximale Bindung von ungefähr 56 fm/mg Protein, und die anscheinende Dissoziationskonstante ist ungefähr 12 nM.
Um die Aktivierung der Signaltransduktion zu untersuchen, wie sie durch die Modulierung von ein oder mehreren transkriptionalen Regulationsfaktoren durch nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan dargestellt ist, wurden BMC2.3 Zellen mit 3 μg/ml nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan über verschiedene Zeiträume bei 37°C inkubiert. Nukleare Extrakte wurden hergestellt und mit ³²P-markierten DNA-Oligonukleotiden, die spezifisch für NF-κB oder NF-IL6 sind, inkubiert. Die Protein ³²P DNA-Komplexe wurden von nichtgebundener ³²P DNA durch Gelelektrophorese (elektrophoretischer Mobilitätsshiftassay, EMSA) getrennt. Die Ergebnisse (4 und 5) zeigen einen zeitabhängigen Anstieg der Protein-DNA-Komplexe, was darauf hindeutet, daß diese Transkriptionsfaktoren durch nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan aktiviert wurden. Die Inhibierung der Bildung dieses Komplexes durch nichtmarkierte DNA-Sonde und das Fehlen der Inhibierung durch eine mutante Sonde zeigen die Spezifizität dieser Wechselwirkung (Daten sind nicht gezeigt).
Gereinigte humane Neutrophile wurden mit oder ohne nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (3 μg/ml) oder Dextran (3 μg/ml) 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nukleare Extrakte wurden hergestellt und die Protein/DNA-Komplexbildung wurde durch den elektrophoretischen Mobilitätsshifttest (EMSA) untersucht. Wie in 16A und 16B gezeigt, erhöhte nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan die Bindung von nuklearen Extraktproteinen an eine NF-κB oder NF-IL6 spezifische ³²P-mar kierte Oligonukleotidsonde im Verhältnis zu Extrakten entweder der Kontrolle oder von Dextran-behandelten Neutrophilen.
Obgleich Rezeptoren sowohl für lösliche als auch partikuläre β-Glucane zuvor beschrieben worden sind, zeigt die Charakterisierung der Wechselwirkung der Bindung zwischen nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und seinem Rezeptor auf humanen Leukozytenmembranen, daß der hier beschriebene β-Glucanrezeptor eine andere molekulare Einheit von zuvor beschriebenen Rezeptoren ist.
Der partikuläre β-Glucanrezeptor, der von Czop (1990) beschrieben wurde, befindet sich auf humanen Monozyten und U937 Zellen. Die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf Monozyten im Verhältnis zu peripheren Polymorphonuklearzyten (PMN) ist nominal und keine Bindung wurde auf U937 Zellen festgestellt. Darüber hinaus inhibiert der Anti-Idiotyp-Antikörper, der von Czop (1990) hergestellt wurde, und der vermutlich die Glucanbindungsstelle besetzt, wirksam die Glucanteilchenphagozytose in Monozyten, ist aber nicht wirksam die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan zu inhibieren.
Der Rezeptor für aminiertes Glucan, der auf murinen peritonealen Makrophagen (Konopski et al., (1994)) vorhanden ist, bindet an das beschriebene aminierte Glucan bei 4°C, wohingegen nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan nicht an seinen Rezeptor bei Raumtemperatur oder geringerer Temperatur bindet. Darüber hinaus konkurrierten Proben von löslichem aminierten Glucan nicht mit der Bindung an den Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (Tabelle 1).
Die β-Glucan-Bindungsaktivität von CR3, wie sie von Thornton et al. (1996) beschrieben ist, wird durch monoklonale Antikörper, die gegen die I-Domäne von CR3 gerichtet sind, inhibiert. Einer dieser Antikörper war OKM1, der die Glucanbindung in dem zuvor beschriebenen System inhibiert, aber keine inhibierende Wirkung auf die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan hat. Humanes peripheres Blut PMN wies eine 5- bis 10-fach spezifischere nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanbindung auf als mononukleare Zellen, aber sowohl PMN als auch Monozyten sind dafür bekannt, hohe CR3 Gehalte zu exprimieren.
Vor kurzem wurde ein Rezeptor für ein phosphoryliertes Derivat von β-Glucan, das in sehr hohen Gehalten in U937 Zellen exprimiert wurde, beschrieben (Muller et al., J. Immunol. 156: 3418–3425 (1996)). Wieder wurde keine nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanbindung in U937 Membranen beobachtet.
Partikuläre β-Glucanrezeptoren, die von Goldman et al. (Exp. Cell. Res. 174(2): 481–490 (1988)) beschrieben wurden, können durch lösliche Glucane im Größenbereich von 2.000–4.000 Dalton inhibiert werden, wobei die nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanbindung nicht durch Laminarin (Molekulargewicht von ungefähr 5.000 Dalton) oder durch einen β-Glucankonformer mit einer einzelnen Kette und mit einem Molekulargewicht von 18.000 Dalton inhibiert. Der Rezeptor von Goldman et al. wird nur durch Induktion mit Retinoinsäure oder 1α,25-Hydroxyvitamin D3 exprimiert (Goldman, Immunology 63(2): 319–324 (1988), wohingegen nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan an nichtinduzierte P388D(1) Zellen bindet. Die Phagozytose von Glucanteilchen durch Lachsmakrophagen kann fast vollständig durch hohe Laminariheptose-Konzentrationen (800 μM) inhibiert werden (Engstad und Robertsen (1994)), die keine Wirkung auf die nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanbindung hatten (Daten sind nicht gezeigt).
Wie hier beschrieben, entfalteten verschiedene Glycosphingolipide, die auf einer Polystyrolplatte mit 96 Vertiefungen immobilisiert waren, signifikante spezifische Bindung an ³H-nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan, einschließlich Lactosylceramid (LacCer) (von beschiedenen Quellen), Glactosylceramide (GalCer), Globotriasylceramid und Asialogangliosid-GM1 (siehe Tabelle 3). Diese Verbindungen haben eine terminale Galactose gemeinsam, die daher an den Bindungswechselwirkungen zwischen ³H-nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan und dem Glycosphingolipid beteiligt sein können. Eine terminale Galactose alleine reicht zur Bindung nicht aus, da Psychosin (1-Galactosylsphinosin) keine merkbare Bindung zeigt. Dieser Verbindung fehlt jedoch der Fettsäureteil von Ceramid.
Während verschiedene Fettsäurestrukturen in LacCer die Bindung von ³H-nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan unterstützen können, wie mit HPLC fraktioniertem LacCer von HLM in Tabelle 4 gezeigt, ist die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, die in C18:1 Sphingosin vorhanden ist, anscheinend für diese Bindung wichtig, da im Handel verfügbare Dihydrosphingosin LacCers nicht binden.
Die Bindung von ³H-nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an LacCer wurde auch als temperaturabhängig festgestellt, ähnlich zu der mit HLM. Die Bindung tritt bei 37°C aber nicht bei 4°C auf, wie in Tabelle 5 angezeigt. Die Temperaturspezifizität wurde bei zwei verschiedenen LacCer Quellen festgestellt.
Die Konformerspezifizität der Kompetition der ³H-nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucanbindung war auch ähnlich zu der, die zuvor bei HLM beschrieben wurde. Wie in 14 gezeigt, konkurriert nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan für die ³H-nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucanbindung an HLM und an LacCer in sowohl dem Test mit 96 Vertiefungen als auch dem Rekonstitutionstest in gleicher Weise. Im Gegensatz dazu konkurriert (SH)-Glucan mit einer einzelnen Helix nicht wirksam in einem dieser Tests. Network, ein Glucanpräparat, das Glucan umfaßt, das sich primär in der Dreifachhelixkonformation befindet und ein Molekulargewicht von größer als einer Million aufweist, konkurriert ebenfalls ähnlich zu nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan, während Laminarin nicht wirksam mit der ³H-nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucanbindung an LacCer in dem Test mit einer Platte mit 96 Vertiefungen konkurriert (siehe 15).
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
Die oben beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß LacCer ein in vivo Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan ist. Andere untersuchte Verbindungen, die oben beschrieben sind, haben jedoch auch Affinität für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan; es ist beabsichtigt, daß diese Verbindungen von dem Ausdruck "Rezeptor", wie er hier beschrieben ist, umfaßt sind. Zum Beispiel können diese Verbindungen anstatt des LacCer Rezeptors in den hier beschriebenen Tests verwendet werden. Diese Arbeit deutet darauf hin, daß es drei Charakteristika gibt, die die Affinität einer Verbindung für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan bestimmen: Länge der Fettsäurekette der Verbindung, Gegenwart einer terminalen Galactose in der Verbindung und Gegenwart oder Abwesenheit einer Doppelbindung in dem Sphingosinteil der Verbindung. Genauer gesagt haben hier gezeigte Verbindungen, die eine Affinität für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan aufweisen, eine Fettsäurekette in einer Länge von ungefähr 16 bis ungefähr 24 Kohlenstoffatomen, enthalten eine terminale Galactose und enthalten eine Doppelbindung in dem Sphingosinteil. Verbindungen, die Fettsäureketten von weniger als 16 und mehr als 24 Kohlenstoffatomen aufweisen, sind ebenfalls erfindungsgemäß beabsichtigt. Darüber hinaus ist es beabsichtigt, daß "terminale Galactose", wie sie hier verwendet wird, nichtmodifizierte Galactose sowie derivatisierte oder modifizierte Galactose, wie sulfonierte Galactose, umfaßt. Demzufolge sind Verbindungen mit diesen Charakteristiken erfindungsgemäß umfaßt und eignen sich für die Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren zusammen mit anderen Verbindungen, die Affinität für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan aufweisen.
Als Ergebnis der hier beschriebenen Arbeit ist es möglich, das Herstellungsverfahren von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan zu verfolgen und das Erzeugnis zu charakterisieren. Das heißt, Testproben können in dem Standardkompetitionsrezeptor-Bindungstest eingeschlossen werden, um die Charakterisierung des Moleküls in Bezug auf die relative Affinität für den Rezeptor zu ermöglichen. Diese Charakterisierung wird Informationen in Bezug auf einige oder alle der folgenden Charakteristiken geben: Charge-zu-Charge Qualität, Identifizierung des Produkts als ein β(1-3)-Glucan einer bestimmten Konformation und Reinheit des Produkts.
Als Folge der hier beschriebenen Arbeit ist es möglich, den Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan zu verwenden, um β-Glucane in Flüssigkeiten zu messen. Testproben können in den Standardcapture oder Kompetitionsassays eingeschlossen werden und mit einer Standardkurve verglichen werden, die mit einem bekannten β-Glucanstandard erstellt wurde. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um lösliche β-Glucane im Serum, Plasma, Urin, synovialer Flüssigkeit, zerebrospinaler Flüssigkeit, Lungenlavage, Gallenflüssigkeit und anderen Körperflüssigkeiten, als Diagnostikum für Fungämie zu messen. Er kann auch verwendet werden, um β-Glucangehalte in Nahrungsmittelherstellungsverfahren zu messen, um fungale Kontamination zu testen sowie Hefefermentierung zu verfolgen.
Testproben können auch in Standardcapture oder Kompetitionstests ein gesetzt werden und mit einer Standardprobe verglichen werden, um die Strukturaktivitätsbeziehungen zu ermitteln. Alternativ kann die Bindung der Testprobe direkt nach der radioaktiven Markierung untersucht werden. Proben können auch in einem nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucanrezeptor vermittelten Test untersucht werden, um die Inhibierung oder Stimulierung dieser Wirkungen zu untersuchen. Zum Beispiel können solche Tests bei der Entwicklung von Polymer oder Rezeptoragonisten, die kleine Moleküle sind, verwendet werden oder um einen Rezeptorantagonisten zu entwickeln, um eine nicht geeignete Immunoverstärkung zu inhibieren, zum Beispiel eine Transplantatablehnung zu verhindern, die als Folge einer opportunistischen fungalen Infektion während der Immunsuppression auftreten kann.
Die hier offenbarten Entdeckungen können auch verwendet werden, um verschiedene Mittel rezeptorpositiven Zellen zuzuführen. Zum Beispiel können verschiedene Mittel an nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan konjugiert (z. B. chemisch konjugiert, kreuzvernetzt oder kovalent gebunden) werden, um ein Konjugatmolekül herzustellen, das rezep torpositiven Zellen, wie PMN und Makrophagen, zugeführt werden kann. Ein solches Lieferungssystem zu einem Ziel kann verwendet werden, um die Zufuhr von Mitteln zu verbessern, z. B. von Antimikroben für resistente intrazelluläre Pathogene (z. B. Mykobakterium, Leishmanie, Malaria), von Zytotoxinen für rezeptorpositive Leukämien, von Genen für die Gentherapie (z. B. für die verbesserte Zytokinherstellung oder zum Austausch dysfunktionaler Enzyme) oder von Antigenen zur Verbesserung der Präsentierung und Herstellung von spezifischen Antikörpern oder der T-Zellaktivierung.
Die Bindungsspezifizität von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor liefert ein Verfahren zur Reinigung von sowohl rezeptorpositiven als auch rezeptornegativen Zellen (d. h. Zellen, die keinen Rezeptor enthalten); zum Beispiel kann nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan an eine Festmatrix angebracht werden und als Affinitätsmatrix verwendet werden, um rezeptorpositive oder rezeptornegative Zellen positiv auszuwählen. In gleicher Weise können Anti-Rezeptor-Antikörper anstatt von immobilisiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan verwendet werden. Zellen, die durch dieses Verfahren gereinigt werden, können anschließend in der Zelltherapie verwendet werden.
Darüber hinaus wird erfindungsgemäß die Erzeugung von Anti-Rezeptor-Antikörpern für diagnostische Zwecke möglich gemacht. Monoklonale oder polyklonale Antikörper können hergestellt werden unter Verwendung von angereicherten oder gereinigten Rezeptorpräparation durch Standardtechniken. Somit betrifft die Erfindung auch Antikörper, die den Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan binden. Zum Beispiel sind erfindungsgemäß polyklonale und monoklonale Antikörper umfaßt, die an den beschriebenen Rezeptor binden. Ein Säuger, z. B. eine Maus, ein Hamster oder Kaninchen, können mit einer immunogenen Form des Rezeptors immunisiert werden (d. h. einem antigenen Teil des Rezeptors, der eine Antikörperantwort auslösen kann). Techniken zum Übertragen von Immunogenizität umfassen zum Beispiel die Konjugierung an Träger oder andere Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Das Antigen kann in der Gegenwart eines Hilfsmittels verabreicht werden, und das Verfahren zur Immunisierung kann durch Nachweis von Antikörpertitern in Plasma oder Serum verfolgt werden. Standard ELISA oder andere Immuntests können mit dem Immunogen als Antigen verwendet werden, um Antikörpergehalte zu untersuchen. Antikörper des Glycolipidrezeptors, der hier beschrieben ist, können durch Standardtechniken hergestellt werden wie zum Beispiel durch solche, wie sie von Koscielak et al. (Immunochemistry 5: 441 (1968)), Hakomori (Methods of Enzymol. 28: 232–236 (1972)) und Marcus und Janis (J. Immunol. 104: 1530 (1970)) beschrieben sind. Solche Antikörper können verwendet werden, um Änderungen in rezeptorpositiven oder rezeptornegativen Zellpopulationen zu identifizieren, wodurch die Krankheitspathologie reflektiert wird (z. B. Antwort auf kryptische fungale Infektion oder Leukämie).
Es wurde festgestellt, daß die Aktivität des Rezeptors für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan aktiviert wird über die Bindung eines nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucans, wodurch ein Signaltransduktionsweg, der durch transkriptionale Regulationsfaktoren (z. B. der NF-κB, NF-IL6 oder jun/fos Familien) reguliert wird, aktiviert wird. Die Aktivierung des Rezeptors kann unter anderem eine Änderung der Rezeptorkonformation, Bildung eines Liganden-Rezeptor-Komplexes oder Änderung des Liganden-Rezeptor-Komplexes umfassen.
Alternativ kann die Aktivität des Rezeptors durch ein Mittel aktiviert werden, das die Bindungs- und Aktivierungsfähigkeit eines nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucans nachahmt. In einer besonderen Ausführungsform wird der transkriptionale Regulationsfaktor als Folge der Ligandenbindung aktiviert. In einer weiteren Ausführungsform wird die Aktivität des transkriptionalen Regulationsfaktors entweder teilweise oder insgesamt verringert durch die Bindung eines Agens, der den Rezeptor bindet (und folglich nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan ausschließt), dem aber die Fähigkeit fehlt, den Rezeptor zu aktivieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein neues Assay zum Identifizieren von Mitteln, die die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan in den Signaltransduktionswegen ändert, wie die Aktivierung von transkriptionalen Regulationsfaktoren. Dieses Assay umfaßt das Kombinieren von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan, dem Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan und einem zu untersuchenden Mittel unter Bedingungen, unter denen die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor auftritt (d. h. Bedingungen, die sich für die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an den Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan eignen). Die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor aktiviert den Rezeptor, der wiederum einen Signaltransduktionsweg aktiviert, der durch die transkriptionalen Regulationsfaktoren, wie denen der NF-κB, NF-IL6 oder jun/fos Familien, gezeigt ist. Andere Signaltransduktionswege, die erfindungsgemäß geändert werden können, umfassen den ras/raf-1/MAP-Kinaseweg, den G-Protein/Phospholipase C/Proteinkinase C Weg, den JAK/STAT-Weg, den Phospholipase-A-Weg, G-Protein/Phospholipase D/Phosphatidinsäure-Weg und den c-AMP-abhängigen Weg. Bei jedem Weg wird ein geeigneter Aktivator oder Indikator des Signalweges durch Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan an seinen Rezeptor aktiviert, und die Modulierung dieser Bindung kann die entsprechende Signaltransduktion ändern. Der Grad der Aktivierung des ausgewählten transkriptionalen Regulationsfaktors in der Gegenwart eines zu untersuchenden Mittels wird bestimmt (z. B. unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA-Oligonukleotiden, die für den transkriptionalen Regulationsfaktor spezifisch sind, wie in den Beispielen beschrieben) und mit dem Grad der Aktivierung des ausgewählten transkriptionalen Regulationsfaktors in der Abwesenheit des zu untersuchenden Mittels verglichen werden, wobei eine Differenz in dem Grad der Aktivierung darauf hindeutet, daß das Mittel die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf die Aktivierung des transkriptionalen Regulationsfaktors ändert. Ein Anstieg in der Aktivierung des transkriptionalen Regulationsfaktors in der Gegenwart des Mittels deutet darauf hin, daß das Mittel die Aktivierung verbessert, d. h. verlängert oder erhöht. Eine Verringerung in der Aktivierung des transkriptionalen Regulationsfaktors in der Gegenwart des Mittels deutet darauf hin, daß das Mittel die Aktivierung herabsetzt, d. h. verkürzt oder verringert.
Die Erfindung betrifft auch einen Test oder ein Verfahren zur Untersuchung der Spezifizität einer Wechselwirkung zwischen einem Kohlenhydrat und einem Glycolipid. Gemäß dem Verfahren werden aus ausgewählten Kohlenhydrat und ein ausgewähltes Glycolipid unter Bedingungen kombiniert, die sich für eine Wechselwirkung zwischen dem Kohlenhydrat und dem Glycolipid eignen, und der Grad der Wechselwirkung zwischen dem Kohlenhydrat und Glycolipid wird bestimmt. Der Grad der Wechselwirkung wird mit dem Grad der Wechselwirkung zwischen dem ausgewählten Glycolipid und ausgewählten Kohlenhydrat in der Gegenwart eines anderen Glycolipids oder Kohlenhydrats verglichen.
Um die Affinität eines bestimmten Glycolipids für ein ausgewähltes Kohlenhydrat zu bestimmen, werden die beiden unter geeigneten Bedingungen kombiniert und der Grad der Wechselwirkung wird bestimmt. Der Grad der Wechselwirkung wird anschließend mit dem Grad der Wechselwirkung in der Gegenwart eines ausgewählten Kompetitorkohlenhydrats verglichen. Bei diesem Weg kann die Spezifizität der Wechselwirkung zwischen dem Glycolipid und dem ausgewählten Kohlenhydrat mit der Spezifizität der Wechselwirkung zwischen dem Glycolipid und einem Kompetitorkohlenhydrat verglichen werden, und die verhältnismäßigen Spezifizitäten können bestimmt werden.
Um die Affinität eines bestimmten Kohlenhydrats für ein ausgewähltes Glycolipid zu bestimmen, werden in ähnlicher Weise die beiden unter geeigneten Bedingungen kombiniert und der Grad der Wechselwirkung wird bestimmt. Der Grad der Wechselwirkung wird anschließend mit dem Grad der Wechselwirkung in der Gegenwart eines ausgewählten konkurrierenden Glycolipids verglichen. Auf diese Weise kann die Spezifizität der Wechselwirkung zwischen dem Kohlenhydrat und dem ausgewählten Glycolipid mit der Spezifizität der Wechselwirkung zwischen dem Kohlenhydrat und einem konkurrierenden Glycolipid verglichen werden, und die relativen Spezifizitäten können bestimmt werden. In einer bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Glycolipid LacCer. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Kohlenhydrat nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan.
Die folgenden Beispiele werden angeboten zum Zweck der Darstellung der Erfindung und sind nicht so zu verstehen, daß sie den Umfang der Erfindung einschränken.
Beispiele
Materialien
Lactosylceramid (HLM) wurde aus humanen Leukozytenmembranen wie nachfolgend beschrieben gereinigt. Alle anderen Sphingolipide, Ceramide und Phospholipide waren von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), außer Lactosylceramid (Schwein), das von Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA) stammte. SOLVABLE^® kam von DuPont, NEN (Boston, MA). Die Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen stammten von Corning (New York).
Herstellung von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan
Nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (PGG-Glucan, 17 mg; HPD0144, Alpha-Beta Technology, Worcester, MA) wurde mit NaIO₄ (225 mg; Sigma, St. Louis, MO) in sterilem pyrogenfreien (SPF) Wasser 72 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Periodat wurde durch Zugabe von 50 mg Glycerol gequenscht. Das nichtderivatisierte, wäßrige, lösliche β(1-3)-Glucan wurde gegen SPF Wasser dialysiert und anschließend mit 100 mCi NaB³H₄ (New England Nuclear, Boston, MA) reduzierend markiert. Radioaktiv markiertes nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan wurde von tritiummarkierten Nebenprodukten mit niedrigen Molekulargewicht durch Dialyse (10 K Schnittpunkt) und Ultrafiltrierung getrennt. Die Reinheit des markierten Produkts wurde durch Gelpermeationschromatographie untersucht.
Herstellung von humanen Neutrophilen
Frisches Gesamtblut wurde von normalen humanen Freiwilligen erhalten, wobei saure Citratdextrose als Antikoagulans verwendet wurde. Nach der Dextransedimentierung wurden Zellen zentrifugiert (400 × g, 7 Minuten) und in autologem Plasma wieder suspendiert. Zellen wurden anschließend über einen Ficoll-Gradienten (Lymphozytentrennungsmedium; Organon Teknika, Durham, NC) geführt und zentrifugiert (400 × g, 30 Minuten). Die Zellen, die aus dem Pellet gewonnen wurden, wurden hypotonisch lysiert, um Rest-RBC zu entfernen. Die verbleibenden Zellen enthielten mehr als 95% Neutrophile, was durch morphologische Kriterien beurteilt wurde.
Herstellung von humanen Leukozytenmembranen
Buffycoat-Zellen (über Dichtegradient separierte weiße Blutzellen) von humanen Spendern (Red Cross, Dedham, MA) wurden in 3% Dextran 15–20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um Leukozyten von roten Zellen zu trennen. Der leukozytenreiche Überstand wurde pelletiert (500 × g, 7 Minuten) und einmal in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen (PBS; Life Technologies, Grand Island, NY). Die darauffolgenden Vorgänge wurden bei 4°C durchgeführt. Die verbleibenden roten Zellen wurden durch hypotone Lyse entfernt und die Leukozyten durch Zentrifugierung (850 × g, 7 Minuten) gewonnen. Das Zellpellet wurde in ungefähr 3–4-mal Volumen PBS suspendiert und Proteaseinhibitoren wurden zugegeben (5 mM EDTA, 40 μg/ml Aprotinin, 1 μM Pepstatin A, 1 μg/ml Leupeptin, 50 μM PMSF). Die Zellen wurden durch Beschallung der Probe (50 Watt, 3 × 1 Sekunde Pulse) zerstört. Die Zerstörung der Zellen wurde mikroskopisch verfolgt. Kerne und verbleibende intakte Zellen wurden durch Zentrifugierung bei geringer Geschwindigkeit (700 × g, 7 Minuten) entfernt. Wahlweise wurde das bei der Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit erhaltene Pellet nochmals beschallt und anschließend einer weiteren Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit unterworfen. Die Überstände von der Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit wurden anschließend durch Ultrazentifugierung bei hoher Geschwindigkeit (180.000 × g, 1 Stunde) gesammelt. Membranpellets wurden wieder in Hanks balancierter Salzlösung, enthaltend Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ (HBSS), suspendiert. Das Membranprotein wurde unter Verwendung des BSA- oder Comassie-Verfahrens (Pierce, Rockland, IL) bestimmt. Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO) wurde zu 1 mg/ml eines 10× Vorrats gegeben und die Membranen in flüssigem Stickstoff bei 4–5 mg/ml aufbewahrt. In einigen Fällen wurden die Membranen ohne Zugabe von Protein gefroren; keine Bindungsänderung wurde jedoch als Folge der unterschiedlichen Aufbewahrungsbedingungen beobachtet.
In einigen Fällen wurden frische humane Leukozyten aus Gesamtblut, das in saurer Citratdextrose gesammelt worden war, hergestellt. Rote Blutzellen wurden durch Dextransedimentierung entfernt und die leukozytenreiche Schicht wurde geerntet und wie oben beschrieben behandelt. Schließlich wurden gereinigte Neutrophile und mononukleare Leukozyten (einschließlich Monozyten und Lymphozyten) hergestellt, indem die leukozytenreiche Schicht der Zellen in autologem Plasma suspendiert wurde und die Schicht über Lymphozytentrennungsmedium (LSM; Organon Technika) gelegt wurde, gefolgt von einer Zentrifugierung (700 × g, 30 Minuten). Das Neutrophil-angereicherte Pellet und die mononuklearen Zellen, die an der Dichtegrenzfläche vorhanden waren, wurden in eiskalter PBS gewaschen und die Membranen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Ein mit Cytospin (Shandon) gefärbtes Präparat deutete darauf hin, daß das Neutrophilpräparat reiner als 95% war und daß das mononukleare Präparat ungefähr 40–50% Monozyten enthielt.
Herstellung von Membranen aus Zellinien
Nichthaftende Zellinien wurden durch Zentrifugierung (500 × g, 7 Minuten) gesammelt, in eiskalter PBS gewaschen und die Membranen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Leicht haftende Zellinien wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und durch vorsichtiges Kratzen mit einem Zellkratzer (Costar) entfernt. Mehr als 90% der Zellen hielten ihre Lebensfähigkeit während dieses Verfahrens bei, was durch Farbstoffausschluß bestimmt wurde. Die Zellen wurden wieder in PBS und Proteaseinhibitoren suspendiert. Stark haftende Zellen wurden mit eiskalter PBS gewaschen, anschließend mit PBS plus den Proteaseinhibitoren, wie oben beschrieben, inkubiert. Die Zellen wurden anschließend durch Kratzen entfernt und durch Zentrifugierung (500 × g, 7 Minuten) gesammelt. Die Membranen von haftenden Zellen wurden anschließend wie oben beschrieben hergestellt.
Bindungstest (Öl/Sucrose-Verfahren)
Membranen wurden auf 2 bis 5 mg/ml in HBSS mit und ohne 1 mg/ml BSA verdünnt. Die Reaktionsmischung bestand aus 280 μl Membranen (2–4 mg/ml Endkonzentration), 35 μl Kochsalzlösung oder Testprobe (in verschiedenen Konzentrationen) und 35 μl radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan (1 μg/ml Endkonzentration). Es wurde ermöglicht, daß die Bindung 60 bis 120 Minuten bei 37°C erfolgt. Am Ende der Inkubierung wurden 100 μl Aliquote der Reaktionsmischung auf einen doppelschichtigen Dichtegradienten, bestehend aus 100 μl Dibutylphthalat (untere Schicht) und 100 μl 8% Sucrose in PBS (obere Schicht) in 400 μl Zentrifugenröhrchen (Brinkman) aufgetragen. Die Röhrchen wurden bei 15.000 × g 4–5 Minuten gedreht und die Spitzen, die die Membranpellets enthalten, wurden entfernt, in 300 μl SOLVABLE^® (New England Nuclear, Boston, MA) über Nacht bei 50°C inkubiert, um das Pellet aufzulösen, und anschließend durch Flüssigszintillationszählen bestimmt. Keine Radioaktivität wurde in der Ölschicht in der Abwesenheit zugegebener Membranen festgestellt.
Alternativ wurden die Membranen direkt in ihren Inkubierungsröhrchen bei 15.000 × g 4–5 Minuten bei 37°C zentrifugiert, das Pellet mit HBSS gewaschen, anschließend wurden die Pellets aufgelöst und die Radioaktivität durch Flüssigszintillationszählen bestimmt.
Bindungstest (Nicht-Öl/Sucrose-Verfahren)
Ein alternatives Verfahren zu dem des Öl/Sucrose-Gradienten umfaßte das Zentrifugieren von 100 μl Aliquoten aus dem Bindungsassay in Mikrofugenröhrchen bei 12.000 × g 5 Minuten, gefolgt vom Spülen des resultierenden Pellets mit HBSS. Die Pellets wurden anschließend in SOLVABLE^® aufgelöst und die Radioaktivität wie oben beschrieben bestimmt.
Extraktion der Membranen aus Chloroform/Methanol-Puffer
Humane Leukozytenmembranen (5 mg Protein/ml), die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden mit 5 Volumen 3 : 2 Chloroform/Methanol (pro Volumen) gewirbelt und bei 1.500 × g zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die obere wäßrige und untere organische Phase wurde von der proteinhaltigen Zwischenschicht entfernt, zusammengeführt und unter Argonstrom auf ungefähr 50 μl konzentriert. Der Rückstand wurde wieder in HBSS suspendiert, kurz beschallt und zentrifugiert (12.000 × g, 10 Minuten), um Membranen zu pelletieren. Das Pellet wurde in 500 μl HBSS suspendiert und 100 μl wurden pro 350 μl Bindungstest verwendet. Die Proteintests unter Verwendung des BCA-Reagens (Pierce) deuten darauf hin, daß ungefähr 85% Protein aus der suspendierten Fraktion erhalten wurden.
Elektrophoretischer Mobilitätsshifttest (EMSA) (murin)
BMC2.3 Zellen in DMEM plus 10% fötales Kalbserum wurden mit 3 μg/ml nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan über verschiedene Zeitspannen inkubiert. Nuklearextrakte wurden durch das Verfahren von Dignam et al. (Nuc. Acid Res. 11: 1475–1489 (1983)) hergestellt. Nuklearextrakte wurden anschließend mit einem ³²P-markierten DNA-Oligonukleotid 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sequenz des verwendeten Oligo nukleotids, das als Sonde verwendet wurde, war AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC (SEQ ID NO: 1). Die Reaktionsmischung wurde anschließend auf einem 4%igen Polyacrylamidgel getrennt und die Ergebnisse autoradiographisch aufgezeigt.
Elektrophoretischer Mobilitätsshifttest (EMSA) (human)
Humane Neutrophile (4,5 × 10⁶ Zellen/ml; 10 ml insgesamt), die wie zuvor beschreiben gereinigt worden waren, wurden in RPMI + 10% FCS (Sigma Chemical Co.) 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan oder Dextran (jeweils 3 μg/ml) wurden anschließend zugegeben und die Inkubierung weitere 60 Minuten bei 37°C fortgesetzt. Nichts wurde zu den Kontrollzellen gegeben. Am Ende der Inkubierung wurden die Zellen in eiskaltem PBS + 20 mM EDTA gewaschen und Nuklearextrakte hergestellt, und wie oben beschrieben der EMSA durchgeführt.
Reinigung von Lactosylceramid (LacCer) aus humanen Leukozytenmembranen (HLM)
1. Extraktion aus Membranen mit Chloroform/Methanol-Puffer
HLM (15 mg Protein) in 1 ml HBSS wurden mit Chloroform (3 ml) und Methanol (2 ml) durch 1-minütiges Wirbeln extrahiert, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugierung bei 1.500 × g, um die Schichten zu trennen. Die obere Schicht und proteinhaltige Zwischenschicht wurde entfernt. Die untere Schicht wurde unter Argonstrom getrocknet und in 200 μl Chloroform/Methanol (10 : 1) suspendiert.
2. Dünnschichtchromatographieanalyse von LacCer
Die zu untersuchenden Proben wurden auf HPTLC-Kieselgelplatten punktförmig aufgetragen und bei Chloroform/Methanol/Wasser (80 : 20 : 2) zusammen mit im Handel erhältlichen LacCer Standards laufengelassen. LacCer wurde mit dem Orcinol-Sprühreagens sichtbar gemacht (Schnaar, Methods in Enzymology 230: 380 (Academic Press, 1994)).
3. Kieselgelchromatographie
100 μl des obigen Extrakts wurden auf eine Kieselgelsäule (2 ml, 60 Å, 200–400 Sieböffnung, die mit Chloroform äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit Chloroform (8 ml), anschließend mit Aceton (16 ml) gewaschen, gefolgt von der Eluierung einer Glycosphingolipid-Fraktion mit Aceton/Methanol (9 : 1, 16 ml). Die Aceton/Methanol-Fraktion wurde bis zur Trockenheit konzentriert und in Aceton/Methanol (10 : 1) suspendiert.
4. DEAE-Sephadex-Chromatographie
Die Aceton/Methanol-Fraktion aus der Kieselgelchromatographie wurde auf eine DEAE-Sephadex A-25 Säule (1 ml Harz in der Acetatform, hergestellt in Chloroform/Methanol (1 : 2)) aufgetragen. Die Säule wurde mit 60 ml Chloroform/Methanol (1 : 2) gewaschen. Neutrale Glycosphingolipide waren in dieser Fraktion enthalten, die getrocknet und in Chloroform/Methanol (5 : 1) suspendiert wurden.
5. Letzte Kieselgelchromatographie
Die DEAE-Sephadex-Fraktionen wurden auf eine Kieselgelsäule (25 × 0,8 cm), die in Chloroform, äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit Chloroform (60 ml) und anschließend in Chloroform/Methanol (7,5 : 1) (60 ml) gewaschen. LacCer wurde mit Chloroform/Methanol (5 : 1) (60 ml) und anschließend mit Chloroform/Methanol (2 : 1) (60 ml) eluiert.
6. HPLC Fraktionierung
Die LacCer Fraktionierung in einzelne Komponenten wurde mittels eines Hewlett Packard 1090 HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-Symmetrie-C18-Säule (3,9 × 150 mm, Waters Associate, Milford, MA) und einer mobilen Phase von 3,5% 0,2 M Ammoniumacetat in Methanol bei einer Fließrate von 1 ml/min durchgeführt. Die Peaks mit einer UV-Absorption bei 206 nm wurden gesammelt, getrocknet und durch TLC untersucht, um Fraktionen zu identifizieren, die LacCer enthalten. Isolierte Fraktionen wurden unter Verwendung eines S. E. D. E. R. E. Sedex 55 evaporativen Massennachweisgeräts (Alfortville France) bei 45°C quantifiziert.
7. GC-MS-Analyse
Die unterschiedlichen Analysen wurden bei jeder isolierten LacCer Fraktion durchgeführt. Eine Aliquote wurde methanolisiert und die Methanolfraktion mit Hexan extrahiert. Die extrahierten Fettsäuremethylester wurden durch GC-MS analysiert (Irie et al., J. Biochem. 108: 531–536 (1990)). Die Methanolschicht wurde getrocknet, trimethylsilyliert und in Hexan aufgelöst. Die resultierenden trimethylsilylierten Methylglycoside wurden anschließend durch GC-MS analysiert (Irie et al., 1990). Eine zweite Aliquote wurde mit Ceramidglycanase (siehe unten) behandelt und gefriergetrocknet. Das resultierende acylierte Sphingosin und Oligosaccharid wurden trimethylsilyliert, in Hexan aufgelöst und durch GC-MS auf einer HT-5 aluminiumausgekleideten Kapillarsäule analysiert.
Bindungstest in rekonstituierten Membranen
Die Membranen wurden aus der rezeptornegativen Zellinie U937 hergestellt und wie oben beschrieben mit Chloroform/Methanol extrahiert. Die obere und untere Schicht wurden zusammengefügt, nachdem die proteinhaltige Zwischenschicht entfernt worden war, und mit der Probe, deren Bindung untersucht werden soll (Lactosylceramid oder Fraktionen aus der Reinigung), getrocknet.
Alternativ wurde eine Mischung aus gereinigten Phospholipiden mit der Probe, die in dem Bindungstest verwendet wird, getrocknet. Die Phospholipidmischung enthielt Phosphatidylcholin (132 μg), Phosphatidylethanolamin (112 μg), Phosphatidylinositol (36 μg) und Phosphatidylserin (56 μg).
Die trockenen Flüssig/Probenpräparate wurden in HBSS (500 μl) durch kurze Beschallung suspendiert und anschließend 10 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert. Die Überstände dieser Drehung wurden verworfen und die Pellets wurden wieder in HBSS (560 μl) suspendiert. 280 μl Aliquote wurden zu den Röhrchen gegeben, die Kochsalzlösung (35 ml) oder nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (35 μl eines 10 mg/ml Vorratslösung) und ³H-nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (35 μl eines 10 μg/ml Vorrats) enthielten. Die Tests wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert, woraufhin 100 μl Aliquote entfernt wurden und in Mikrofugenröhrchen bei 12.000 × g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden mit 150 μl HBSS gespült. Die Pellets wurden anschließend in SOLVABLE^® aufgelöst und Szintillationsflüssigkeit wurde zugegeben und die Radioaktivität wurde gemessen.
Bindungstest in einer Platte mit 96 Vertiefungen
Lactosylceramid oder die zu messende Probe wurden in Ethanol suspendiert. Aliquote, wie spezifiziert, wurden dreifach zu den Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und luftgetrocknet. Die folgenden Komponenten wurden zuvor gemischt, anschließend wurden 100 μl zu jeder Vertiefung gegeben: Kochsalzlösung (10 μl) oder nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (10 μl eines 10 mg/ml Vorrats), ³H-nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan (10 μl eines 10 mg/ml Vorrats) und HBSS (80 μl). Die Platten wurden bei 37°C 1,5 bis 2 Stunden inkubiert, anschließend wurden die Überstände aus jeder Vertiefung entfernt und verworfen. Die Vertiefungen wurden mit HBSS (200 μl) gespült und SOLVABLE^® (100 μl) wurde zugegeben. Die Platte wurde 5 Minuten bei 60°C inkubiert, anschließend wurden die Überstände entfernt und gezählt.

Claims

Test zur Beurteilung der Affinität eines Kohlenhydrats zu einem Glykolipid, umfassend die folgenden Schritte: a) Kombinieren eines Glykolipids und eines Kohlenhydrats unter Bedingungen, die für eine Interaktion zwischen dem Kohlenhydrat und dem Glykolipid geeignet sind; b) Bestimmen der Affinität des Kohlenhydrats zu dem Glykolipid; und c) Vergleichen der in (b) bestimmten Affinität mit der Affinität in Anwesenheit von konkurrierendem Kohlenhydrat oder Glykolipid, wodurch die Affinität des Kohlenhydrats zu einem Glykolipid beurteilt wird.
Test zur Identifizierung eines Mittels, das die Bindung eines Kohlenhydrats an einem Glykolipid verändert, umfassend die folgenden Schritte: a) Kombinieren von radioaktiv markiertem Kohlenhydrat, Glykolipid und einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, die für eine Interaktion zwischen dem Kohlenhydrat und dem Glykolipid geeignet sind; b) Bestimmen des Grades der Bindung des Kohlenhydrats am Glykolipid; und c) Vergleichen des Grades der in Schritt (b) bestimmten Bindung mit dem Grad der Bindung in Abwesenheit des zu testenden Mittels unter Bedingungen, die für eine Interaktion zwischen dem Kohlenhydrat und dem Glykolipid geeignet sind, wobei eine Differenz in dem Grad der Bindung des Kohlenhydrats am Glykolipid andeutet, daß das Mittel die Bindung des Kohlenhydrats am Glykolipid verändert.
Test nach Anspruch 2, wobei das Mittel ein Antagonist oder Agonist des Rezeptors für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan ist.
Test nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Kohlenhydrat nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan ist.
Test nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Glykolipid ein Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan ist.
Test nach Anspruch 5, wobei das Glykolipid Lactosylceramid ist.
Test nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Rezeptor eine Verbindung mit einer Affinität zu nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan oder ein Rezeptoranalog oder eine Rezeptornachahmung davon ist.
Test zur Identifizierung eines Mittels, das Affinität zu dem Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan hat, umfassend die folgenden Schritte: a) Kombinieren von radioaktiv markiertem nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan, Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan und einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, die für die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan am Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan geeignet sind; b) Bestimmen des Grades der Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan am Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan; und c) vergleichen des Grades der in Schritt (b) bestimmten Bindung mit dem Grad der Bindung in Abwesenheit des zu testenden Mittels unter Bedingungen, die für eine Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan am Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan geeignet sind, wobei ein Rückgang des Grades der Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan am Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan darauf hinweist, daß das Mittel Affinität zum Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan hat.
Test zur Identifizierung eines Mittels, das die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf eine Aktivierung eines Signaltransduktionsweges hin verändert, wobei der genannte Test die folgenden Schritte umfaßt: a) Kombinieren von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan, Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan und einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, die für eine Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan am Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan geeignet sind; b) Bestimmen des Grades der Aktivierung eines Signaltransduktionsweges; und c) Vergleichen des Grades der in Schritt (b) bestimmten Aktivierung mit dem Grad der Aktivierung in Abwesenheit des zu testenden Mittels unter Bedingungen, die für die Bindung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan am Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan geeignet sind, wobei eine Differenz in dem Grad der Aktivierung des Signaltransduktionsweges andeutet, daß das Mittel die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf eine Aktivierung eines Signaltransduktionsweges hin verändert.
Test nach Anspruch 9, wobei, wenn der Grad der Aktivierung in Abwesenheit des Mittels größer ist als in Abwesenheit des Mittels, das Mittel die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf eine Aktivierung eines Signaltransduktionsweges hin verbessert, oder wenn der Grad der Aktivierung in Anwesenheit des Mittels geringer ist als in Abwesenheit des Mittels, das Mittel die Wirkung von nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan auf eine Aktivierung eines Signaltransduktionsweges hin verringert.
Test nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Aktivierung des Signaltransduktionsweges anhand der Modulation von wenigstens einem Transkriptionsregulationsfaktor gemessen wird.
Test nach Anspruch 11, wobei der Transkriptionsregulationsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mitgliedern der NF-κB, NF-1L6 oder jun/fos Familie.
Test nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei Schritt (b) mit ³²P-markierten DNA-Oligonukleotiden stattfindet, die für den Transkriptionsregulationsfaktor spezifisch sind.
Test nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei der Rezeptor eine Verbindung mit Affinität zu nichtderivatisiertem, wäßrigem, löslichem β(1-3)-Glucan oder ein Rezeptoranalog oder eine Rezeptornachahmung davon ist.
Test nach einem der Ansprüche 8 bis 14, wobei der Rezeptor Lactosylceramid ist.
Verfahren zur In-vitro-Veränderung der Bindung eines Kohlenhydrats an ein Glykolipid, umfassend das Kombinieren eines Kohlenhydrats, eines Glykolipids und eines Mittels, das durch einen Test nach einem der Ansprüche 2 bis 7 unter Bedingungen identifiziert wurde, die für die Bindung des Kohlenhydrats am Glykolipid geeignet sind, wobei das Mittel die Bindung des Kohlenhydrats am Glykolipid im Vergleich zur Bindung in Abwesenheit des Mittels verändert.
Konjugiertes Molekül, bestehend aus einem nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucan, das chemisch konjugiert, vernetzt oder kovalent an ein Mittel gebunden ist, wobei sich das konjugierte Molekül an einen Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan in einer den Rezeptor enthaltenen Zelle bindet.
Verwendung eines Mittels, das mit einem nichtderivatisierten, wäßrigen, löslichen β(1-3)-Glucan konjugiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Lieferung eines Mittels zu einer Zelle, die einen Rezeptor für nichtderivatisiertes, wäßriges, lösliches β(1-3)-Glucan enthält.