JPH04346791A - 単クローン抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オリゴ糖または多糖に
含まれるβ−１，３−グリコシド結合と特異的に反応す
る単クローン抗体、及び該単クローン抗体を産生するハ
イブリドーマに関する。

【０００２】

【従来の技術】純粋な多糖は高分子物質であるにもかか
わらずその免疫原性は低いので、生体に投与された場合
、抗体産生能力は同じ高分子物質である蛋白質に比較し
て非常に弱く、抗多糖抗体はできにくい。そのためか、
糖ペプチド、糖蛋白、リポ多糖等の複合糖質を抗原とし
て用いた免疫学的研究は従来より広範囲に行なわれてお
りそれらに対する抗体も数多く報告されているのに対し
、純粋な多糖に対する抗体の存在は殆ど知られていない
。

【０００３】殊にグルコースだけからなる純粋なグルカ
ンについては、古くから代用血漿として臨床で使用され
ているデキストランに関し、デキストランを投与された
患者の中に割合は少ないものの抗デキストラン抗体の存
在が確認されているのと（ｋａｗａｓａｋｉ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　Ｖｏｌ．　８．　Ｎｏ．２
，　７７〜　８１，　１９８２）、また近年のβ−１，
３−グルカン（β−１，３−グリコシド結合を主結合と
する糖鎖を主鎖とするグルカン）に関する免疫化学的研
究の進展において、フクロタケのアルカリ抽出多糖（Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．　５３，　Ｎｏ．７，　１８
４９〜１８５９，　１９８９）や、スエヒロタケの産生
する多糖シゾフィラン（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．
　５４，　Ｎｏ．８，　１９５３〜１８５９，　１９９
０）等に反応する抗体の存在が報告されている程度にす
ぎない。

【０００４】しかも多糖のような高分子抗原は多くの抗
原決定基を含んでいるのが常であり、多糖をそのまま生
体投与して得られる抗体は通例多クローン抗体である。 前述のβ−１，３−グルカンに対する抗体も全て多クロ
ーン抗体であることから、現在のところβ−１，３−グ
ルカンに対する単クローン抗体作製の報告は皆無である
。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】近年、β−１，３−グ
ルカンの生理活性に関する研究が広範囲に行なわれるよ
うになり、種々のβ−１，３−グルカンに宿主介在性の
免疫賦活作用が認められている。殊にβ−１，３−グル
カンの一つであるシゾフィランやレンチナン等は宿主の
免疫賦活作用に基づいた癌の治療薬として臨床で使用さ
れており、これら多糖の体内分布や体内濃度の正確な把
握がその作用の解明のために必要とされている。更にま
た、β−１，３−グルカンの免疫賦活作用を利用する研
究が、制癌剤だけでなく他の分野で活発に展開されるよ
うになってきており、複雑な夾雑物と共存するβ−１，
３−グルカンを特異的に認識する方法の開発が望まれて
いる。

【０００６】従って本発明は、β−１，３−グルカンの
特異的な認識、検出を可能とする手段を提供することを
目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記のよう
な事情に鑑み、β−１，３−グルカンの特異的且つ精度
の高い検出法を確立すべく鋭意研究を重ね本発明を完成
するに至った。即ち、本発明は、オリゴ糖または多糖に
含まれるβ−１，３−グリコシド結合と特異的に反応す
る単クローン抗体、及び該単クローン抗体を産生するハ
イブリドーマを提供するものである。

【０００８】本発明の単クローン抗体は、オリゴ糖また
は多糖に含まれるβ−１，３−グリコシド結合と特異的
に反応し、従ってβ−１，３−グリコシド結合を有する
オリゴ糖あるいは多糖と特異的に反応する。尚、本発明
にいうオリゴ糖とは、糖単位二以上から数十個位までの
天然及び合成された糖類を示すものであり、多糖とはそ
れ以上の糖単位からなる糖類をいい、直鎖状及び分枝状
のもののいずれも含む。さらにこれ等の糖類は、糖タン
パク等の複合糖類に含まれるものも包含する。

【０００９】以下に本発明を詳細に説明する。本発明の
単クローン抗体は、β−１，３−グリコシド結合を含む
オリゴ糖またはβ−１，３−グリコシド結合を主結合と
する糖鎖を主鎖とするグルカン、例えばシゾフィラン等
を抗原物質として使用することにより従来の単クローン
抗体の製造、選択方法を使用することにより得ることが
できる。

【００１０】即ち、上記抗原物質により免疫化した動物
から免疫細胞を採取し、該免疫細胞をミエローマ細胞と
融合させてハイブリドーマを得、所期の単クローン抗体
を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマ
の産生した単クローン抗体を回収することにより製造す
ることができる。抗原物質として使用するβ−１，３−
グリコシド結合を含む糖類としては、特にβ−１，３−
グルカンが好ましい。β−１，３−グルカンは自然界に
広く分布しておりその起源もまちまちであるが、殊に担
子菌であるキノコ由来のβ−１，３−グルカンが数多く
報告され、また研究も活発に行なわれている。カードラ
ンやラミナランのように直鎖状のβ−１，３−グルカン
も存在するが、シゾフィランやレンチナン等側鎖にβ−
１，６−グリコシド結合を有するβ−１，３−グルカン
が一般的であり、その分岐の頻度や分岐の長さ等も様々
で、従って薬理活性や物性、特に水に対する溶解性など
が異っている。

【００１１】本発明の単クローン抗体を産生するための
抗原として望ましい条件は、まず純度が高いことと、物
質としての特性が明確にされていることである。数多く
のβ−１，３−グルカンの中でもシゾフィランが最も高
度に純化され且つ物質としての特性がよく知られている
ことから、本発明の単クローン抗体の産生用抗原として
最も好ましいものである。

【００１２】上記抗原物質は被免疫動物に投与される抗
原懸濁液中、０．１　〜１０ｍｇ／ｍｌ　、特に０．１
〜１ｍｇ／ｍｌ　程度の濃度で使用するのが好ましい。 被免疫動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ
、ウマ、ウシ等を使用することができる。一般的に高分
子物質は生体内に投与されたとき抗体を投与生体に産生
させる能力、即ち免疫原性を有している。しかしながら
その免疫原性は高分子物質の種類により大きな差があり
、免疫原性の低い物質に対しては免疫原性を高めるため
に種々の工夫がなされている。アミノ酸、ペプチドある
いは蛋白質の付加又はフロイントのアジュバントとの併
用等は免疫原性を高めるための汎用手段としてよく知ら
れており、本発明の単クローン抗体の製造においても使
用することができる。

【００１３】フロイントのアジュバントは完全アジュバ
ント及び不完全アジュバントのいずれも使用することが
できる。フロイントのアジュバントは、抗原懸濁液中、
５０〜９０容量％程度の量で使用することが好ましい。 抗原懸濁液中の抗原濃度、アジュバントの容量比等は生
理食塩水を用いて調整すればよい。

【００１４】上記に従って作製した抗原懸濁液を被免疫
動物に接種することにより、β−１，３−グルカン等を
抗原として免疫された動物が得られる。例えばマウスを
免疫する場合には、抗原懸濁液を１〜５回、好ましくは
３〜５回程度、１〜２週間間隔で腹腔内投与、皮下投与
等により投与して効率良くマウスを免疫することができ
る。

【００１５】上記のようにして得られた免疫動物から、
脾細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を分離
することにより抗体産生細胞を得ることができる。例え
ば脾細胞を抗体産生細胞として使用する場合には、脾臓
を摘出した後に脾臓を切断し、培地中での遠心洗浄、ピ
ペッティング等の操作により抗体産生細胞を得ることが
できる。

【００１６】細胞融合に使用するミエローマ細胞として
はマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの種々の動物の細
胞株を使用することができ、例えばヒポキサンチン・グ
アニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲ
Ｔ）を欠損するミエローマを使用することが好適である
。このようなミエローマは未融合の状態ではＨＧＰＲＴ
を欠くためにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン（ＨＡＴ）培地で核酸の合成ができずに死滅するが、
免疫細胞と融合しＨＧＰＲＴ活性を回復したハイブリド
ーマはアミノプテリンで核酸の生合成を阻害されてもヒ
ポキサンチンを利用して生育することができるのでハイ
ブリドーマのみが生育する。また、これらのミエローマ
細胞は非分泌型の細胞株であることが好ましい。この様
なミエローマ細胞としてはマウスミエローマＰ３　／Ｘ
６３−Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３　Ｕ１　）、Ｐ３　／ＮＳ１−
１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３　／Ｘ６３−Ａｇ８
−６・５・３（Ｘ６３・６・５・３）、ＳＰ２／０−Ａ
ｇ１４（ＳＰ２）、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３
・Ａｇ１・２・３（Ｙ３・Ａｇ１・２・３）、ヒトミエ
ローマＳＫＯ−００７、ＧＭ１５００ＴＧ−Ａ１２等を
挙げることができる。

【００１７】細胞融合はＲＰＭＩ　　１６４０等の動物
細胞培養培地中で１０７　〜１０８　個のミエローマ細
胞に５〜１０倍の数の上記抗体産生細胞を混合して行う
。細胞融合促進物質としては平均分子量１０００〜６０
００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリビニル
アルコール、センダイウィルス等が使用でき、通常２５
℃で数分〜２０分間、好ましくは２〜５分間程度の融合
を行えばよい。特にＰＥＧを用いることが好ましい。

【００１８】細胞融合処理後の細胞からハイブリドーマ
を選別するには選択培地における選択的増殖を行えばよ
い。例えば、細胞をＮＳ−１培地等の培地で５×１０６
　個／ｍｌとなるように稀釈した後に、マイクロタイタ
ープレート上に１０５　〜１０６　細胞数／ウェルとな
る様に各ウェルに細胞を入れ、各ウェルに例えばＨＡＴ
培地等の選択培地を加えて、以後適当な間隔、例えば３
日間隔で選択培地を交換して培養すればよい。例えばミ
エローマ細胞としてＰ３　／Ｘ６３−Ａｇ８−６・５・
３を使用した場合にはＨＡＴ培地で１〜２週間程度培養
することによりハイブリドーマのみを選別することがで
きる。

【００１９】β−１，３−グリコシド結合に特異的なモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、
例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により以下のよう
にして行うことができる。予めβ−１，３−グリコシド
結合を含む糖類を含有する検体をリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）、炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
等の緩衝液に溶解し、ポリスチレン、ポリカーボネート
、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、シリコーン、
デキストラン、セルロース等のソフトプレートやガラス
プレート、ビーズ、シート、ウェル、チューブ等の固相
に添加し室温で放置して吸着させる。次に抗原液体を捨
てＰＢＳで洗浄した後に、２％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）含有ＰＢＳを加えて室温で放置し、抗原の結合し
ていない部位をＢＳＡでブロックする。その後に、ハイ
ブリドーマの培養上清を加えた後室温で１〜１．５時間
放置し、ＰＢＳで洗浄する。次にペルオキシダーゼ等で
標識した抗マウスイムノグロブリン抗血清（第２抗体）
を加えて室温で放置する。ＰＢＳで洗浄した後に、酵素
基質を加えて発色させ吸光光度計等でその発色の程度を
測定すれば抗原と結合力のある抗体を産生しているハイ
ブリドーマが検索される。

【００２０】上記のようにして抗体産生細胞を選別した
後、限界希釈法等によりクローニングを行うことにより
単一のハイブリドーマを起源とする抗体産生細胞を得る
ことができる。上記のモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマによる抗体は、培養フラスコや培養瓶を用いて１
０〜１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ　　１６４０培地
、又は無血清培地等の動物細胞培養用培地で培養して、
その培養上清液から得ることができ、培養方法及び条件
は通常の動物細胞培養方法に準じて選択すればよい。

【００２１】さらに大量の抗体を産生する方法としては
、例えばハイブリドーマの親ミエローマ細胞の由来動物
と同系動物にプリスタン（２、６、１０、１４−テトラ
メチルペンタデカン）等の鉱物油を腹腔内に投与した後
、ハイブリドーマを腹腔内投与して大量に増殖させる方
法を採用することができる。該方法によれば、ハイブリ
ドーマは１０〜１８日程で腹水腫瘍を形成し、血清及び
腹水中に高濃度（約１〜２０ｍｇ／ｍｌ　）の抗体が産
生される。

【００２２】さらに単クローン抗体の精製が必要な場合
には、該腹水を硫安分画した後に、ＤＥＡＥセルロース
イオン交換クロマトグラフィー、β−１，３−グリコシ
ド結合を含む糖類を結合させたセファロース４Ｂ等を用
いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー、分子ふ
るいカラムクロマトグラフィー等によって精製すること
が可能である。

【００２３】上記のようにしてβ−１，３−グリコシド
結合に特異的に反応するモノクローナル抗体が得られる
。これらのモノクローナル抗体は他のグリコシド結合、
例えばβ−１，４−結合、β−１，６−結合、α−１，
２−結合、α−１，４−結合等とは反応性を有しないも
のである。

【００２４】

【発明の効果】現在β−１，３−グルカンの微量定量法
としてはエンドトキシンの検出法として頻用されている
リムルステストが用いられているが、リムルステストで
はβ−１，３−グルカン以外の因子、例えばある種の核
酸やペプチドグリカン等にも反応するといわれており、
血中や臓器等の生体組織中に存在するβ−１，３−グル
カンの検出には種々の問題が指摘されている。一方、本
発明により得られる単クローン抗体はβ−１，３−グリ
コシド結合を主結合として含む種々のβ−１，３−グル
カンに特異的に反応するため、血中や臓器中の夾雑物質
に無関係にβ−１，３−グルカンだけを選択的に定量で
き、リムルステストより優れた定量法を提供する。

【００２５】β−１，３−グルカンの検出の必要性につ
いては、前述の通り癌治療の分野のみならず種々の分野
において高いものがある。例えば、最近居住環境の変化
に伴う種々の疾患としてのハウスダスト症候群が注目さ
れるようになってきたが、その原因物質の一つとして大
気中に微量に存在するβ−１，３−グルカンが指摘され
ており、ハウスダスト中のβ−１，３−グルカンの有用
な検出法が求められている。また、免疫抑制剤の使用頻
度の増加やエイズ患者の二次感染等真菌症に対する医学
的関心も高まり、抗真菌薬の研究も盛んに行なわれるよ
うになってきたが、真菌の細胞壁にはβ−１，３−グル
カンが存在しているので真菌症の診断にもβ−１，３−
グルカンの検出が利用できる。

【００２６】本発明による単クローン抗体は、このよう
な各種の分野において極めて有用なβ−１，３−グルカ
ンの検出手段となるものである。

【００２７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。 実施例１ シゾフィラン（台糖株式会社製の平均分子量４４．５万
のもの）の溶液（１ｍｇ／ｍｌ　）１００μｌ　、０．
１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．２５ｍｌ及びフロイント
のアジュバント（完全アジュバントまたは完全アジュバ
ント）０．２５ｍｌからなる懸濁液の全量をＢＡＬＢ／
ｃマウス（６週齢、雌）の腹腔に計５回投与した。投与
間隔は２週間で、最初の投与はフロイントの完全アジュ
バントを、後の４回はフロイントの不完全アジュバント
を用いた。５回目の投与の１週間後にマウスを開腹して
その脾臓をとり、ピペッティングにより単細胞を得た。 これ等の脾細胞を血清無添加のＰＲＭＩ　　１６４０培
地で２回洗浄し、脾細胞５×１０７　個に対し、別に培
養を行ない洗浄したマウスミエローマ細胞（Ｘ−６３−
Ａｇ８−６．５．３）１×１０７　個の割合で混合して
遠心分離を行ない、上清を除去した。沈渣をよく溶かし
、融合促進剤であるポリエチレングリコール１５４０（
１ｍｌ）を３７℃で１分間かけてゆっくりと添加し、さ
らに１分間撹拌して融合を行なった。この融合細胞（ハ
イブリドーマ）を牛胎児血清添加ＲＰＭＩ　　１６４０
培地１０ｍｌで懸濁して遠心分離した後、その残渣を９
６穴培養用プレート一枚にまき、３７℃、５％ＣＯ２　
インキュベーターで１週間培養した。ＨＡＴ培地で１週
間、３７℃で培養した後、ハイブリドーマだけを選択的
に採取した。それらの培養上清液を採取し、以下の手順
によりＥＬＩＳＡでシゾフィランとの反応性が最も高い
ハイブリドーマを選択した。

【００２８】シゾフィラン（上記と同じもの。以下「Ｓ
ＰＧ」と略す。）と牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」
と略す。）との共役体（以下「ＳＰＧ−ＢＳＡコンジュ
ゲート」と略す。ＢＳＡ；２ｍｇ／ｍｌ　）を２０倍希
釈した水溶液を９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェル
に５０μｌずつ添加して室温で３０分放置して吸着させ
た。次に抗原液体を捨てＰＢＳで洗浄した後に、２％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ１００μｌを各ウェルに加えて室温で３
０分間放置し、抗原の結合していない部位をＢＳＡでブ
ロックした。その後に、上記各ハイブリドーマの培養上
清を１ウェル当たり１００μｌ加えた後室温で１時間放
置した。陰性対照としては、再蒸留水、ＰＢＳ、正常マ
ウス血清（以下「ＮＭＳ」と略す。１：１０００希釈）
を使用した。その後ＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼ
で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（１：１５０
０希釈）を加えて室温で放置した。ＰＢＳで洗浄した後
に、ｏ−フェニレンジアミン２０ｍｇを２０ｍｌのクエ
ン酸緩衝液に溶解し、これに３０％Ｈ２　Ｏ２　５０μ
ｌを２．５ｍｌのクエン酸緩衝液に溶解したもの２００
μｌを加え、これを各ウェルに１００μｌずつ加え室温
で１５分間放置した。その後各ウェルに２ＭＨ２　ＳＯ
４　を５０μｌ添加して反応を停止させた。前述の陰性
対照をブランクとして反応液の４９０ｎｍの吸光度を測
定し、最も高い吸光度を示したもののハイブリドーマＳ
ＰＧ１−ＨＳを選択した。クローニングを行なってこの
ハイブリドーマが単一のクローン由来であることを確認
した。このハイブリドーマＳＰＧ１−ＨＳは、平成３年
５月１７日付で工業技術院微生物工業技術研究所に受託
番号微工研菌寄１２２６２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１２２
６２）として受託された。

【００２９】１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ　　１６４
０培地で選択したハイブリドーマを培養用フラスコにて
増殖させた後、約１×１０７　個の細胞をＢＡＬＢ／ｃ
ヌードマウスの腹腔に投与して２週間後に貯留した腹水
を採取した。この腹水の遠心分離後の上清から単クロー
ン抗体を精製した。尚、抗体の精製はＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ａ−５０（ファルマシア）を用いて以下の
ように行なった。

【００３０】再蒸留水で膨潤させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ａ−５０の５ｇを再蒸留水（１ｌ×５）、０
．２ＮＨＣｌ（５００ｍｌ）、水（１ｌ）、０．２ＮＮ
ａＯＨ（５００ｍｌ）、水（１ｌ）で順次洗浄してｐＨ
を７とした後、０．０３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０，
５００ｍｌ×３）でさらに洗浄し、その後０．５Ｎリン
酸でｐＨを８とした。その後３０分間超音波脱気してエ
コノカラム（日本バイオラッドラボラトリーズ）に充填
し、平衡化させた。上記腹水上清２ｍｌを試料として添
加し、０．０３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液１５０ｍｌで溶
出し、その後０．１、０．２、０．３及び０．４ＭのＮ
ａＣｌを添加した０．０３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液の各
３０ｍｌで順次溶出し３ｍｌのフラクションを集めた。 各フラクションのタンパクを定量してタンパクピークの
所在を確認し、該ピークの各フラクションのシゾフィラ
ンに対する反応特異性を上記と同様のＥＬＩＳＡにより
確認し、反応特異性を有する画分を合わせてＰＢＳに対
して２日間透析した。この反応特異性を有する画分の抗
ＩｇＧ抗体と抗ＩｇＭ抗体に対する反応性を調べたとこ
ろ、抗ＩｇＧ抗体とは殆ど反応しなかったが、抗ＩｇＭ
抗体とは高い反応性を示し、本発明の単クローン抗体は
ＩｇＭ抗体であることが確認された。

【００３１】上記のようにして得られた単クローン抗体
の反応性を以下のようにして調べた。ニトロセルロース
膜にＳＰＧ−ＢＳＡコンジュゲート（ＢＳＡ；２ｍｇ／
ｍｌ　）をＢＳＡ換算で４μｇ　（２μｌ）スポットし
て乾燥させた。次に、４％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキン
グを行なって抗体の非特異的な結合を抑えた後これを除
去し、一次抗体として上記で作製した抗体を添加して室
温で６０分間反応させた。対照として正常マウス血清（
ＮＭＳ）を使用した。ＰＢＳで洗浄して未反応の抗体を
除去後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ、１
：２００希釈）を添加して室温で３０分間反応させた。 再びＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳ２０ｍｌに溶解したジアミ
ノベンジジン（Ｓｉｇｍａ　社）３ｍｇ及び３０％過酸
化水素水１０μｌ　を添加した溶液で発色させた。作製
した抗体を一次抗体に使用したニトロセルロース膜上の
スポットは茶色に呈色した。

【００３２】シゾフィラン以外の糖類についても同様に
してその反応性を調べた。その結果を表１に要約する。 表１．ドットブロット法による本発明の単クローン抗体
と糖類−ＢＳＡコンジュゲートとの反応性　　　　　＊
　　反応性：　　＋＋；強い陽性、　　＋；陽性、　　
−；陰性　　　　＊＊　　カードランのヒドロキシル基
をカルボキシメチル化したもの　　　＊＊＊　　本発明
者が合成したもの上記の結果の通り、本発明の単クロー
ン抗体は、シゾフィラン以外のカードランやスクレログ
ルカン等のβ−１，３−結合を含む多糖類のみならず、
ラミナリテトラオースのようなβ−１，３−結合を含む
オリゴ糖のＢＳＡコンジュゲートとも反応するが、マン
ナン、プルラン、キシラン等のβ−１，３−結合を含ま
ない糖類とは反応せず、β−１，３−結合を特異的に認
識し反応するものであることが判る。

【００３３】実施例２ ウサギの腹腔にシゾフィラン含有ＰＢＳ溶液を一定量投
与し、４日後に貯留した腹水を採取した。この腹水中に
はシゾフィランを貪食したマクロファージ等が存在した
。これらを集めてＰＢＳで洗浄後、サイトスピン（１５
００ｒｐｍ　、５分）でスライドグラスに張り付けた。 ＰＬＰ（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐａｒａ
ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）固定を行ない、１％馬血清
／ＰＢＳでブロッキングを行なった後、一次抗体として
作製した抗体あるいは対照として非免疫マウス血清を使
用してＡＢＣ−ＧＯ法（ａｖｉｄｉｎ　ｂｉｏｔｉｎ　
ｃｏｍｐｌｅｘ−ｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｍ
ｅｔｈｏｄ）で免疫染色した。染色にはキット（Ｖｅｃ
ｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣ−ＧＯ　ｋｉｔ）を使用した。 その結果、抗体を使用したスライドグラスではシゾフィ
ランを貪食したマクロファージは黒青色に染色されたが
、陰性対照は染色されなかった。また、シゾフィラン以
外にカードランやスクレログルカンを貪食したマクロフ
ァージも染色されたが、プルランでは染色されなかった
。

【００３４】実施例３ シゾフィランを産生する菌体、すなわち　　Ｓｃｈｉｚ
ｏｐｈｙｌｌｕｍ　　　ｃｏｍｍｕｎｅ　　　Ｆｒｉｅ
ｓを水で洗浄して菌体の周囲にある遊離のシゾフィラン
を除去した。これをスライドグラス上にて乾燥させた。 一方、真菌の一種であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　属の
菌に感染したヒトの組織切片をスライドグラスに張り付
けた。これらをＰＬＰ固定後、実施例３で行なった方法
と同様の方法で免疫学的な染色を行なった。その結果、
両者共非免疫血清を使用した対照と比較して有意に染色
されていた。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　オリゴ糖または多糖に含まれるβ−１
   ，３−グリコシド結合と特異的に反応する単クローン抗
   体。
2. 【請求項２】　　β−１，３−グリコシド結合を含むオ
   リゴ糖または多糖と特異的に反応する請求項１記載の単
   クローン抗体。
3. 【請求項３】　　シゾフィラン、カードラン、レンチナ
   ン、スクレログルカン、カルボキシメチル化したカード
   ラン及びラミナリテトラオースと特異的に反応する請求
   項１又は２記載の単クローン抗体。
4. 【請求項４】　　請求項１〜３のいずれかに記載の単ク
   ローン抗体を産生するハイブリドーマ。