JPH0255039B2

JPH0255039B2 -

Info

Publication number: JPH0255039B2
Application number: JP57138848A
Authority: JP
Inventors: Kenji Yoshida; Fumio Kimura; Jujiro Yamada; Katsumi Kawarajo; Tanehito Takeda
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1982-08-10
Filing date: 1982-08-10
Publication date: 1990-11-26
Also published as: EP0101039A2; CA1213536A; EP0101039A3; JPS5929622A

Description

【発明の詳細な説明】

〔1〕発明の背景１技術分野本発明は、シユードモナス・エルギノーサに対
するモノクローナル抗体およびその用途、すなわ
ち具体的にはシユードモナス・エルギノーサ感染
診断薬ないし菌分類用試薬に関する。シユードモナス・エルギノーサ（以下、緑膿菌
ということがある）は、本来病源性の低い菌とし
て知られていたものである。しかし、最近は、抗
生物質の投与による菌交代性増殖の結果として、
所謂日和見感染が増加しつつある。また、この菌
は本来弱毒性であるところから、この菌による感
染患者のほとんどが他の基本的疾患、たとえば癌
あるいは逸疫抑制剤による治療を要するもの、に
罹患している者、熱傷患者、新生児等に多いのも
特徴とされている。緑膿菌感染症は、現在のところ最も治療の困難
な感染症の一つとされているものである。この感
染症が治療困難であるのは、緑膿菌が従来からの
各種の抗生物質に耐性を示すようになつているう
え、近年開発されてきた緑膿菌にある程度の効果
を示す薬剤に対しても耐性となり易いからであ
る。ところで、菌の感染を受けた場合に感染菌が何
であるかを早期に知ることは、その後の治療にと
つて極めて重要なことである。この考え方は従来
から存在し、多くの抗血清による診断がなされて
きた。しかしながら、従来の抗血清はその調製手
段の当然の帰結として多数のクローンの産生する
特異性の異なつた抗体の混合物、すなわちポリク
ローナル抗体、であつたので、一定の品質のもの
をつくることが困難であること、非特異的反応を
抑制するために多くの操作が必要であること、そ
の他の多くの問題点が指摘されている。〔〕発明の概要１要旨本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、緑膿菌に対するモノクローナル抗体をつく
り、それを使用することによつてこの目的を達成
しようとするものである。従つて、本発明によるシユードモナス・エルギ
ノーサに対するモノクローナル抗体は、血清型の
異なるシユードモナス・エルギノーサの集団に対
し、その中の一つの血清型と反応し、該集団の他
の血清型とは反応しないものであること、を特徴
とするものである。本発明は、また、この抗体の用途に関するもの
である。すなわち、本発明によるシユードモナス・エル
ギノーサの検出または同定用試薬は、血清型の異
なるシユードモナス・エルギノーサの集団に対
し、その中の一つの血清型と反応し、該集団の他
の血清型とは反応しないモノクローナル抗体を１
種または複数種含んでなること、を特徴とするも
のである。また、本発明によるシユードモナス・エルギノ
ーサの血清型分類用試薬は、血清型の異なるシユ
ードモナス・エルギノーサの集団に対し、その中
の一つの血清型と反応し、該集団の他の血清型と
は反応しないモノクローナル抗体を１種または複
数種含んでなること、を特徴とするものである。２効果本発明によるモノクローナル抗体によれば、前
記のポリクローナル抗体に認められた諸問題が解
決される。本発明で興味あることは、このモノクローナル
抗体がグルブリンとして主としてIgMのタイプと
して得られるということである。その結果、従来
のモノクローナル抗体に認められた凝集反応や沈
降反応等のポリクローナル抗体で用いられる手法
が使用できないという問題を伴なわずに極めて短
時間に菌との抗原―抗体反応を検知することがで
きる。なお、本発明抗体はIgMのタイプとしても
得られるがこのタイプの抗体は樹脂エマルジヨン
の樹脂粒子に吸着させるなどして速やかな凝集を
行なわせることができる。〔〕発明の具体的説明１使用した緑膿菌緑膿菌の分類同定に関しては現在でも多くの議
論のあるところであつて、研究者間でも緑膿菌の
血清型による分類が異なつていて、混乱が生じて
いる。このような状況となつているのは、ポリク
ローナル抗体を用いていることに由来する動物の
個体差、抗血清の吸収操作の条件の差、等があつ
て、研究対象が統一化ないし共通化されていない
ことが大きな原因であると考えられる。本発明では、対象緑膿菌の分類を緑膿菌研究会
主催の型別検討委員会の決定（1975年）による血
清学的分類に従うものとし、この分類に基くＡ―
Ｍ群に属する菌株を使用している。Ａ―Ｍ群に属する緑膿菌の菌株のいくつかは東
京大学医科学研究所（東京都文京区）に保存され
ており、第三者に自由に分譲される。東京大学医科学研究所に保存されている緑膿菌
の菌株を示せば、下記の通りである。なお、参考
のため、本間らの分類も併記した。

【表】なお、本発明では緑膿菌の分類として型別検討
委員会の決定による血清学的分類を最良のものと
判断してそれに従つているが、そのＡ―Ｍ群とい
う分類は現在の時点での指標であるから、将来に
おいて新しい分類基準が提案ないし採択される可
能性がある。特に、本発明によるモノクローナル
抗体を用いて分類同定を行なつていけば、現在の
分類基準では律しえない菌株が生じてくることは
想像にかたくない。従つて、本発明は対象菌株に
関して上記Ａ―Ｍ群に属するものあるいはこの分
類基準に従つて分類しうるもの、のみに限定され
るものではない。２モノクローナル抗体の製造本発明による緑膿菌に対するモノクローナル抗
体は、細胞融合法によつてつくられる。細胞融合法によるモノクローナル抗体の作製
は、一般に、(1)細胞融合用抗体産生細胞の調製、
(2)細胞融合／ハイブリドーマの作製、(3)所望ハイ
ブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
（および保存）、ならびに(4)ハイブリドーマの増殖
による所望モノクローナル抗体の産生、からな
る。これらの単位工程、また従つてその結合からな
るモノクローナル抗体製造体、は公知であつて、
本発明でも抗原である菌が緑膿菌であることに基
く改変がありうることを留保してこの公知の方法
を利用することができる。なお、ハイブリドーマ
の作製およびモノクローナル抗体の製造の一般的
解説として、J.Immunol.Methods，39、285〜
308（1980）を参照することができる。本発明によるモノクローナル抗体の製造法の一
例を具体的に示せば、下記の通りである。１）細胞融合用抗体産生細胞の調製緑膿菌Ａ―Ｍ群に属する菌株をそれぞれ培養
し、好ましくは弱ないし無毒化（たとえば、ホ
ルマリン処理）したのち、洗滌菌体また菌体の
リポ多糖体や菌体膜成分等をホスト動物、たと
えばマウス、特にBALB／Ｃマウス、に腹腔
内投与または皮下投与（たとえば、背中、四股
のつけ根等）する。投与後、２週間程度以上経過してから、同一
菌を再度投与して追加免疫ないし追感作を行な
い、必要に応じて追加免疫をさらに行なう。追
加免疫は静脈注射によることが多い。最終免疫後72時間経過してから脾臓を摘出し
て、抗体産生細胞（リンパ球）を得る。２）細胞融合／ハイブリドーマの作製予じめ接養しておいたミエローマ（骨髄腫）
細胞、たとえばP3―X63―Ag8〔Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.，41、781―791
（1976）〕、X63―Ag8―6.5.3、その他、と前記
脾細胞とを１：１〜１：10程度の比率で混合
し、適当な細胞融合用培地たとえば約40％ポリ
エチレングリコール（PEG）（分子量1000〜
6000程度）、および約15％ジメチルスルホキシ
ド（DMSO）を含むRPMI―1641培地（たとえ
ば日水）を加えて、公知の方法〔J.Immunol，
Methods 39、285―308（1980）〕で両細胞を融
合させてハイブリドーマを形成させ、培地をハ
イブリドーマのみの生育に適したものに代えて
いつてハイブリドーマのみの培養物を得る。こ
のハイブリドーマのみを生育させる培地として
は、使用ミエローマ細胞が上記具体例である場
合はその代謝特性ないし生合成特性に着目した
HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン
およびチミジンを含有するRPMI―1640培地）
がふつうである（脾臓のリンパ球は、HAT培
地のようなin vitro条件下では長期間増殖でき
ない）。３）所望ハイブリドーマのスクリーニングおよ
びクローニング上記のようにしてHAT培地中でハイブリド
ーマのみを生育させて１〜２週間後に、マイク
ロプレート中で前記緑膿菌菌体とハイブリドー
マ上清とを反応させる。反応させた緑膿菌を遠
心洗浄後、抗マウス抗体のペルオキシダーゼで
ラベルしたものを用いたエンザイム・イムノア
ツセイ（EIA）によつて、目的とする菌と特異
的に反応する抗体を産生しているハイブリドー
マをスクリーニングする。スクリーニングによつて所望活性を認めたも
のについて、たとえば顕微鏡下でシングル・セ
ル・マニピユレーシヨンによつて、クローニン
グを行なう。約２週間後に、ウエル１個当り１
個のクローンのみが生育しているものについ
て、再度EIAを行なつて、クローンを確立す
る。確立されたクローンは、直ちにモノクローナ
ル抗体生産に使用するものを除き、凍結乾燥等
の手段によつて保存することができる。４）モノクローナル抗体の産生確立されたクローンのハイブリドーマを適当
培地中でのin vitro培養およびマウス腹腔内で
のin vivo培養のいずれかで増殖させることに
よつて、所望モノクローナル抗体を産生させる
ことができる。たとえば、確立されたクローンについて常法
に従つて徐々にスケールアツプを行ない（培養
上清には目的の抗体が含まれている）、更に高
い抗体価の標品を得べく、プリスタン（アルド
リツチ）0.5mlを予じめ１〜２週間前に腹腔内
投与しておいたBALB／Ｃマウスに細胞数が
１〜10×10⁶個／0.5mlとなるように調整したハ
イブリドーマを腹腔内に投与する。投与後１〜
２週間程度経過して貯留された腹水および血清
中には、ハイブリドーマ培養上清の10〜500倍
程度の抗体価の目的のモノクローナル抗体が含
まれている。このようにして得られる培養液や腹水中の目
的抗体はそのままの姿で使用することができる
が、精製して高抗体価標品とすることが好まし
い。精製手段としては、免疫グロブリンの精製
に採用されうる任意のもの、たとえば硫安によ
る塩析法、DEAEセルロース等を用いるイオン
交換法、ゲル過法、アフイニテイ―クロマト
グラフイー等、が適当であり、これらを適宜組
合せあるいは電気泳動法と組合せることによつ
て高純度の目的抗体を得ることができる。なお、本発明による製造法で「抗体を取得す
る」ということは、抗体を精製標品として取得
する場合の外に、培養液や腹水の形態で取得す
る場合をも包含するものである。３モノクローナル抗体の用途このようにして得られるモノクローナル抗体
は、その緑膿菌に対する特異性に着目した各種の
用途に供することができる。そのうちのいくつかを示せば、下記の通りであ
る。１）緑膿菌感染症診断用または菌分類用の試薬本発明によるモノクローナル抗体は、精製標
品の外に、ハイブリドーマ培養上清、腹水およ
び血清の形態においてもＡ―Ｍ群の緑膿菌を明
確に区別しうるものである。すなわち、本発明
者の確認したところによると、Ａ群に属する緑
膿菌を感作して得られたハイブリドーマの産生
するモノクローナル抗体はＡ群の菌とのみ反応
し、他のＢ―Ｍ群の菌とはEIAで全く反応しな
かつた。同様に、Ｍ群の菌からの抗体はＭ群の
菌とのみ反応し、Ａ―Ｌ群の菌とは完全に区別
することができた。本発明によるモノクローナル抗体はＡ―Ｍ群
の緑膿菌のそれぞれについて得られていて、Ａ
―Ｍ群の各群間の識別は上記のように可能であ
る。しかし、将来においてＡ―Ｍ群以外の群に
属する緑膿菌が見出され、あるいはＡ―Ｍ群の
どれかについてさらに下位群が見出され、ある
いはさらに全く別の分類が採用される可能性が
あることは前記した通りであるから、本発明に
よる診断ないし分類用試薬は現存のＡ―Ｍ群に
限定されるものではない。抗体を用いて感染症の診断を行なう場合に
は、菌が緑膿菌であるということさえ判明すれ
ば、それがどの群に属するかは知る必要がない
場合もある。そのようなときには、Ａ―Ｍ群に
関して一つ一つ判定していくことは特策ではな
い。そのような場合には、Ａ―Ｍ各群に対する
モノクローナル抗体（単位抗体という）を全種
類または何種類かを組合せてなる混合物を使用
するのが合理的である。なお、本発明で「シユードモナス・エルギノ
ーサ分類」というときは、感染症での当該菌の
分類の場合の外に、一般に緑膿菌の分類を行な
う場合を包含するものである。診断には、精度と同時に簡便さが要求され
る。上記の単位抗体を複数種含む診断薬は診断
回数が減少しているという点でこの趣旨に沿う
ものであるが、本発明によるモノクローナル抗
体のあるものは緑膿菌に対して極めて短時間に
特異的な菌の凝集を引き起し、またあるものは
適当な「剤型」にすることによつて短時間凝集
を可能にすることができるので、本発明分類試
薬は分類作業が容易であるという点でこの趣旨
に沿うものである。すなわち、一般に、モノクローナル抗体はそ
の特異性が極めて高いので、目的の特異的抗原
―抗体反応に際して、たとえばポリクローナル
抗体の場合のような凝集反応や寒天内沈降反応
等が起らないとされている。従つて、モノクロ
ーナル抗体を用いれば正確な診断ないし分類が
行なえるという利点がある訳であるが、また一
方モノクローナル抗体のあるものは凝集反応や
沈降反応を起さないので、特異的抗原―抗体反
応の生起を簡単に知ることができないという問
題があつた。ところが、本発明によるモノクロ
ーナル抗体の多くはIgMタイプに属する免疫グ
ロブリンであり、この抗体は対応する緑膿菌と
混合すると極めて短時間に特異的な凝集反応を
引き起すことが本発明者によつて発見された。
従つて、特異的抗原―抗体反応は極めて容易に
検知することができるのである。これは、モノ
クローナル抗体に関しての上記の知見からすれ
ば思いがけなかつたことというべきであろう。本発明によるモノクローナル抗体には、免疫
グロブリンとしてIgGのタイプとして得られる
ものがある。モノクローナルなIgGの場合は、
一般にいわれているようにそのままでは凝集が
起らない。しかし、そのような抗体も、これを
樹脂ラテツクス中の樹脂粒子等の適当な担体に
吸着させたものは、IgMからなる抗体と同様に
極めて短時間に特異的な菌の凝集反応が生じる
ことがわかつた。従つて、IgGからなる抗体の
場合についても、特異的抗原―抗体反応は極め
て容易に検知できて、診断ないし分類の簡便性
に対する要請に応えることができる。なお、診
断ないし分類に際して時間的制約がない場合
は、IgGおよびIgMからなる抗体のいずれにつ
いてもEIA等を用いることにより確実に判定を
行なうことができる。診断薬ないし分類薬として調剤するには、合
目的的な任意の手段を採用して任意の剤型でこ
れを得ることができる。たとえば、腹水、目的
抗体を含む培養液、または精製した抗体につい
てその抗体価を測定し、適当にPBS（生理食塩
を含むリン酸バツフアー）等で希釈したのち、
0.1％ナトリウムアジド等を防腐剤として加え
る。また、ラテツクス等の担体に吸着させたも
のも、抗体価を求めて適当に希釈し、防腐剤を
添加して用いる。前記のように、本発明抗体をラテツクス粒子
上に吸着させたものは、本発明診断ないし分類
薬の好ましい「剤型」の一つである。この場合
のラテツクスとしては、適当な樹脂材料たとえ
ばポリスチレン、ポリビニールトルエン、ポリ
ブタジエン等のラテツクスが適当である（ラテ
ツクス担体に関しては、たとえば、アメリカ
ン・ジヤーナル・オブ・メデイスン、21、888
〜892（1956）参照）。なお、ヒトγ―グロブリ
ンを粒子上に吸着させたポリスチレンラテツク
スがリユーマチ様因子検査用試薬として実用さ
れている。２）緑膿菌感染症治療剤本発明による緑膿菌に対するモノクローナル
抗体を用いてマウスの緑膿菌感染治療実験を行
なつたところ、少量の抗体が菌の所属群に特異
的に極めて強い治療効果を示すこと本発明者は
認めている。この実験事実は、緑膿菌感染疾患
を有する動物（ヒトを含む）に対する本発明モ
ノクローナル抗体の治療剤としての利用の可能
性を示すものである。４実験例実施例１）実験方法 (1)使用した菌株緑膿菌研究会主催の型別検討委員会の決定
による血清学的分類に基きＡ―Ｍ群に属する
菌株を東大医科学研究所より入手して使用し
た。 (2) 菌の培養あらかじめ寒天斜面培地で37℃で一夜培養
した各菌株を、100ml BHI培地（Difco）
を含む坂口フラスコにエーゼでかきとるか、
あるいは、10mlのBHI培地で種培養した液
１〜２mlを100mlBHI培地を含む坂口フラス
コに接種し、37℃で17〜24時間振盪培養し
た。 (3) 菌体の処理前記の方法にて培養した培養液100mlを
10000rpmで30分間遠心分離に付し、得られ
た菌体に10mlの10％ホルマリンを加えて充分
混合したのち、37℃で１夜放置し、使用まで
冷蔵庫に保存した。ホルマリン処理菌体は、
使用時に生理的食塩を含むリン酸バツフアー
（PH7.2、以下PBSと略す）で充分洗滌してホ
ルマリンを除去したのち、OD550の値をも
とにPBSで必要濃度に調整して、マウスの
感作および抗体の分析に供試した。 (4) 菌体別のリポ多糖体（以下LPSと略す）の
調製先の方法にて培養した菌体を遠心分離して
集菌後、0.12M TrisバツフアーPH８で洗滌
し、50mlのTrisに懸濁させ、37℃にしたの
ち、0.02MEDTAを含むTris50mlを加えて静
かに撹拌した。４分後にMgCl₂終濃度0.05M
になるよう加え、10000rpmで30分間遠心し、
上清を集めた。得られた上清を0.1Mリン酸
バツフアーに続いて精製水に対して透析後、
凍結乾燥して、各菌のLPSを得た。 (5) マウスへの抗原の感作菌体を感作する場合はホルマリン処理菌体
を充分PBSで洗滌してから、PBSに懸濁さ
せ、OD₅₅₀が0.1〜0.2になるように調整した
のち、４〜８週令のBALB／Ｃマウスに0.2
〜0.3ml腹腔内投与した。また、LPSの場合
は、凍結乾燥したものをPBSに溶解し、終
濃度５〜20μｇ／0.2mlとなるように調整した
のち、その0.2mlを腹腔内に投与した。 (6) ハイブリダイゼーシヨン菌体またはLPSで動物を感作して少なくと
も２週間後、同一抗原で菌体の場合は
OD₅₅₀0.2〜0.5のものを0.5ml、LPSの場合は
20〜30μg、を尾静脈より追感作した。追感
作72時間後にマウスをクロロフオルムまたは
エチルエーテルで摩酔して、無菌的に脾臓を
摘出した。得られた脾臓をRPMI―1640培地
（日水）で洗滌したのち、ハサミで細片とし
て、供試脾細胞を得た。得られた脾細胞は、
牛胎児血清（以下、FCSと略す）を含まない
RPMI―1640培地で洗滌した。一方、８―ア
ザグアニン10μg／mlおよび10％FCSを含む
RFMI―1640培地で、５％CO₂／相対湿度
100％／37℃であらかじめ培養して対数増殖
期にあるミエローマ細胞（P3―X63―Ag8―
U1細胞）をFCSを含まないRPMI―1640培
地で洗滌し、先に述べた脾細胞とミエローマ
細胞との数が10：１〜１：１程度になるよう
混合する。混合した細胞を1000rpm10〜15分
間遠心し、上清を捨て、細胞を充分にほぐ
す。この細胞を含む遠心管に、ポリエチレン
グリコール（M.W.＝1000〜6000。半井化
学）２ｇ、RPMI―1640培地（FCSを含まな
いもの）２ml、およびDMSO（和光純薬）0.7
mlから成る溶液0.5mlを静かに加え、遠心管
をゆつくり回転させるから細胞と混合させ
る。１分後、FCSを含まない培地１mlをゆつ
くり加えながら静かに遠心管を回転させて混
合する。以後、30秒毎に培地１mlを加え、同
様の操作を培地10mlが加わるまでくり返す。
10mlの培地を加え終つたら、1000rpmで10〜
15分遠心して、上清を捨て、充分に細胞をほ
ぐしたのちFCS10％を含むRPMI―1640培地
をミエローマ細胞として１×10⁵〜１×10³／
0.1mlになるように加え、プラスチツク製96
穴マイクロプレート（ヌング）に0.1mlずつ
分注し、37℃／５％CO₂／相対湿度100％に
て培養する。つぎの日、ヒポキサンチン
0.387mg／100ml、アミノプテリン0.0176mg／
100ml、チミジン1.3mg／100ml（いずれも
Sigma）および10％FCSを含むRPMI―1640
培地（以下HAT培地と略す）0.1mlを加え、
融合後２日および３日目に培地の１／２をと
つてHAT培地を加える。その後３〜４日毎
に培地を静かに除き、HAT培地を加えなが
らハイブリドーマの成育を持つ。約１〜２週
間後にウエル中にハイブリドーマが生育して
くるのが懸微鏡下で観察される。 (7) 目的抗体のスクリーニング 96穴ポリ塩化ビニールプレート（ヌング）
に５％ウサギ血清を含むRPMI―1640培地を
加え、４℃で一夜放置後、培地を捨て、分析
しようとするサンプル100μと抗原となる
菌体懸濁液（OD₅₅₀10）50μを加えて、
37℃で60分間インキユベートした。2000rpm
で20分遠心後、培地で２回洗滌し、ペルオキ
シターゼでラベルした抗マウス抗体（カロペ
ル）の100倍希釈液50μを加えて、37℃で
60分反応させた。反応後、PBSで３回洗滌
し、0.1％ｏ―フエニレンジアミン（10ml中、
2μ30％H₂O₂を含む0.1Mクエン酸バツフア
ー、PH4.5）溶液100μを加え、室温に放置
して30分後に黄かつ色に変化したものを肉眼
で判定して選定した。 (8) 目的抗体産生細胞のクローニング以下に示す二つの方法を用いた。 (a) BALB／Ｃマウスの胸腺細胞または脾
臓細胞をHAT培地に１×10⁶／0.2mlにな
るように懸濁させ、0.2ml／ウエルになる
ようあらかじめ96穴マイクロプレートに分
注しておく。スクリーニングの結果、目的
抗体を産生していると判定されたウエル中
のハイブリドーマをピペツトを用い充分は
がして混合したのち、その一部をシヤーレ
にとりHAT培地を加えて、細胞のうすい
懸濁液を作る。顕微鏡を見ながら、ガラス
製キヤピラリーを用いて細胞を一つずつひ
ろい、先に用意した胸腺または脾臓細胞を
含む96穴マイクロプレートのウエル中に１
個ずつハイブリドーマを入れる（１細胞／
ウエル） (b) スクリーニングの結果、目的抗体を産生
していると判断されたウエル中のハイブリ
ドーマの懸濁液を作り、血球計算盤を用い
て正確に細胞数を調べたのち、HAT培地
で希釈後、最終的にはBALB／Ｃマウス
の胸腺または脾臓細胞を含む培地に加え、
ハイブリドーマとして0.3〜0.5個／0.2mlで
かつ胸腺または脾臓細胞が１×10⁶個／0.2
mlとなるような細胞の懸濁液を作る。これ
を0.2mlずつ96穴マイクロプレートに分注
する。以上述べた(a)または(b)の方法によりクロー
ニングしたマイクロプレートを５％CO₂／37
℃で培養すると、１〜２週間後にクローンが
生育してくる。顕別鏡で１つのウエル中に１
個のクローンしかないものを選び、スクリー
ニングの項で述べた方法で分析して、目的抗
体を産生しているクローンを選択する。 (9) in vitroによる細胞の培養および抗体の産
生96穴マイクロプレートで充分増殖させた目
的クローンは、24穴、６穴および４穴のプレ
ートに徐々にスケールアツプして培養し、必
要により更に大きなスケールにて培養する。
このようにして得られた細胞の培養上清に
は、目的菌体と特異的に反応する抗体が産生
されている。２）結果感作ないし免疫および反応に用いた菌株は、
前記第１表に示した通りである。第２表は、本発明者らの得た代表的なハイブ
リドーマの産生するモノクローナル抗体と各群
の菌との反応性（EIA法による）の関係を示す
ものである。本発明者らの得た各群に特異的なモノクロー
ナル抗体について、抗体の免疫グロブリンとし
てのクラスを知るため検討を行なつた。IgMは
メルカプトエタノールやジチオスレイトール等
のSH試薬に不安定であるが、IgGは安定であ
ること〔Pirofsky等：Vox sang.27：480―488
（1974）〕、ならびに市販のμ―鎖特異的および
γ―鎖特異的な抗マウス免疫グロブリンとの反
応性およびモノクローナル抗体の対応する群の
菌に対する凝集性等を検討した結果、得られた
抗体はIgMまたはIgGに属するものであつた。
第３表は、結果の一例を示すものである。参考例感染治療実験モノクローナル抗体を含む腹水での実験例の一
部を示せば、下記の通りである。 ICR系マウス（雄４週令）に緑膿菌を感染させ
る前日および４時間前に抗体を含む腹水または腹
水を生理食塩水で希釈したもの0.2mlをip投与し
た。あらかじめ各緑膿菌のマウスに対するLD₅₀
をしらべておき、LD₅₀の10〜20倍量の菌を25％
ムチンに懸濁させip投与後一週間観察して、生存
数をしらべた。対照にはミエローマをマウスに投
与して得た腹水を希釈せずに用いた。結果を第４
表に示した。対照では全てのマウスが翌日死亡したが、それ
ぞれ対応する抗体を投与した群では強い治療効果
を認めた。治療効果は菌群特異的でＡ群の菌に対
する効果は菌群Ａ特異的な抗体のみが有し、タイ
プの異なる抗体では全く効果を認めなかつた。

【表】＋：反応性あり、空欄：反応性なし。

【表】

【表】＊分子：マウスの生存数分母：供試マウ
ス数

Claims

【特許請求の範囲】１血清型の異なるシユードモナス・エルギノー
サの集団に対し、その中の一つの血清型と反応
し、該集団の他の血清型とは反応しないものであ
ることを特徴とする、シユードモナス・エルギノ
ーサに対するモノクローナル抗体。２シユードモナス・エルギノーサの集団が菌株
番号IID 1001、IID 1002、IID 1007、IID 1013、
IID 5004、IID 1021、IID 1004、IID 1130、IID
1006、IID 1020、IID 1009、IID 1010、IID
1011、IID 1012、IID 5141、IID 5018およびIID
1015の株からなり、その中の１株と反応し、該集
団の中の他の株とは反応しない特性を有する、特
許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。３血清型の異なるシユードモナス・エルギノー
サの集団に対し、その中の一つの血清型と反応
し、該集団の他の血清型とは反応しないモノクロ
ーナル抗体を１種または複数種含んでなることを
特徴とする、シユードモナス・エルギノーサの検
出または同定用試薬。４血清型の異なるシユードモナス・エルギノー
サの集団に対し、その中の一つの血清型と反応
し、該集団の他の血清型とは反応しないモノクロ
ーナル抗体を１種または複数種含んでなることを
特徴とする、シユードモナス・エルギノーサの血
清型分類用試薬。